Kaasasündinud südamehaiguse neuroprotektsiooni hetkeseis 2. osa

Seejärel arvutati mikroskoopilised kujutised ImageJ tarkvara abil (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Hsp60 signaal korrutati "x-ga".

Hsp60 on oluline valgumolekul, mis mängib inimkehas olulist bioloogilist rolli. Viimaste aastate uuringud on näidanud, et Hsp60 esinemine on tihedalt seotud inimese mäluga.

Hsp60 on molekulaarne chaperone valk, mis osaleb peamiselt valkude voltimises, lahtivoltimises, stabiliseerimises ja lagunemises. Need protsessid on väga olulised inimkeha normaalseks ainevahetuseks ja rakkude talitluseks. Samas on Hsp60-l ka antioksüdantne, põletikuvastane ja immunomoduleeriv toime ning sellel on suur roll inimese tervise ja immuunsüsteemi tasakaalu hoidmisel.

Uuringud on leidnud, et Hsp60 mängib mälu moodustamisel ja säilitamisel otsustavat rolli. Õppimis- ja mäluprotsessi käigus toodavad ajurakud suure hulga Hsp60 molekule. Need molekulid võivad kaitsta rakke väliskeskkonna häirete ja kahjustuste eest, et tagada õppimise ja mälu sujuv edenemine. Lisaks võib Hsp60 mõjutada ka inimese mõtlemist ja käitumist, muutes ajurakkude signaaliülekannet ja neuronite arengut ning avaldab positiivset mõju kognitsioonile ja stressiresistentsusele.

Kuigi Hsp60 roll on näidanud positiivset mõju inimkehale, peavad inimesed ka mõistma, et nii Hsp60 liig kui ka puudus võib avaldada negatiivset mõju inimeste tervisele. Seetõttu peaksime aktiivselt uurima ja uurima Hsp60 mehhanismi inimkeha erinevates füsioloogilistes ja patoloogilistes tingimustes, et paremini mõista Hsp60 positsiooni ja rolli inimeste tervises. On näha, et peame parandama mälu ja Cistanche deserticola võib oluliselt parandada mälu, kuna Cistanche deserticola omab antioksüdantset, põletikuvastast ja vananemisvastast toimet, mis võib aidata vähendada oksüdatsiooni ja põletikulisi reaktsioone ajus, kaitstes seeläbi närvisüsteemi tervis. Lisaks võib Cistanche deserticola soodustada ka närvirakkude kasvu ja paranemist, parandades seeläbi närvivõrkude ühenduvust ja funktsiooni. Need mõjud võivad aidata parandada mälu, õppimisvõimet ja mõtlemiskiirust ning võivad samuti takistada kognitiivse düsfunktsiooni ja neurodegeneratiivsete haiguste teket.

Lühimälu parandamiseks klõpsake nuppu Tea

"x" väärtus määrati järgmiselt: "x"-volditud Hsp60 signaali lahutamine mitokondriaalse DNA signaalist kontrollrühmas muutis mitokondriaalse DNA väärtuse nullist väiksemaks või sellega võrdseks. Histooni H2B signaal korrutati y-ga.

"Y" väärtus määrati järgmiselt: "y"-volditud histooni-H2B signaali lahutamine tuuma-DNA signaalist kontrollrühmas muutis tuuma-DNA väärtuse väiksemaks kui null. Kui taustasignaal muutub korrutamisest kõrgeks, saab korrutatud pildi kontrastsust reguleerida kõigis proovides samade tingimuste jaoks.

Edasiseks analüüsiks kasutati dsDNA värvimise pilti, millest on lahutatud korrutatud Hsp60 ja histooni H2B korrigeeritud kujutis. Funktsiooni "Adjust-Threshold" kasutades muudeti need pildid binaarseks. Valisime dsDNA puncta suurusega 2 kuni 2 0 µm2 (ringikujulisus 0,1–1,0) ja need loendati funktsiooni "Analüüsi-Analyze Particles" abil.

2.3. Elektronmikroskoopia

Üks päev enne transfektsiooni kanti HeLa rakud plaadile tihedusega 600 rakku/µl. Huvipakkuvate geenide ekspressioon vaigistati HeLa rakkudes, kasutades Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) lipofectamine RNAiMAX transfektsioonireagendis (ThermoFisher Scientific) vastavalt tootja juhised (RNA lõppkontsentratsiooniga 10 nM).

Neli päeva pärast siRNA knockdowni rakke fikseeriti. Rakukultuuri proovid fikseeriti 2% PFA ja 2% glutaaraldehüüdiga 0.1 M fosfaatpuhvris, pH 7,4, temperatuuril 37 °C, seejärel pandi 4 °C. ◦C külmkappi 30 min. Proovid fikseeriti 2% glutaaraldehüüdis 0,1 M fosfaatpuhvris üleöö temperatuuril 4 ◦C. Proove pesti kolm korda 0,1 M fosfaatpuhvriga 30 minutit ja järelfikseeriti 2% osmiumtetroksiidiga 0,1 M fosfaatpuhvris temperatuuril 4 ◦C 1 tund.

Proovid dehüdreeriti ingradeeritud etanoolilahused, viidi üle vaigule (Quetol -812, Nisshin EM Co., Tokyo, Jaapan) ja polümeriseeriti temperatuuril 60 ◦C 48 tundi. Polümeriseerunud vaigud lõigati teemantnoaga ultramikrotoomi abil (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Saksamaa) üliõhukesteks 70-nm-sektsioonideks ja paigaldati seejärel vaskvõredele.

Sektsioone värviti 2% uranüülatsetaadiga toatemperatuuril 15 minutit ja pesti destilleeritud veega, millele järgnes sekundaarne värvimine plii värvimislahusega (Sigma-Aldrich, Tokyo, Jaapan) toatemperatuuril 3 minutit.

Võrke vaadeldi ülekandeelektronmikroskoobi all (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokyo, Jaapan) kiirenduspingel 80 kV (sebrakala aju) või 100 kV (rakk) ja kujutised salvestati laenguga seotud seadme (CCD) kaameraga (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.) .

2.4. Immunoelektronmikroskoopia

Kullaketaste proovid külmutati vedelas propaanis temperatuuril –175 ◦C. Pärast proovide külmutamist külmutati need 1% tanniinhappega etanoolis ja 2% destilleeritud veega temperatuuril –80 ◦C 24 tundi.

Seejärel hoiti proove 4 tundi temperatuuril –20 °C, millele järgnes inkubeerimine 1 tund temperatuuril 4 °C. Seejärel dehüdreeriti proove veevabas etanoolis 3 korda 30 minutit. iga kord, millele järgneb infiltratsioon 50:50 etanooli-maavaigu seguga (LR valge: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) temperatuuril 4 °C 1 tund. Proovid kanti üle värskele 100% vaigule ja inkubeeriti 4 °C juures 30 minutit ning seda protsessi korrati kolm korda.

Proovid viidi üle värskele 100% vaigule ja polümeriseeriti temperatuuril 50 ◦ CO/N. Polümeriseerunud vaigud lõigati üliõhukesed sektsioonid 90 nm juures teemantnoaga, kasutades ultramikrotoomi (Ultracut UCT; Leica) ja lõigud asetati niklivõredele. Võre inkubeeriti dsDNA-vastase antikehaga (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) 1% BSA/PBS-s temperatuuril 4 ◦CO/N, millele järgnes kolm loputamist 1% BSA/PBS iga 1 min.

Seejärel inkubeeriti neid 2 tundi toatemperatuuril nende konjugeeritud {{0}}nm kullaosakestega (kitse anti-hiire IgG polüklonaalne keha) antikehadega. Pärast PBS-ga loputamist asetati võred 2% glutaaraldehüüdi 0, 1 M kakodülaatpuhvrisse.

Seejärel võred kuivatati ja värviti seejärel 2% uranüülatsetaadiga 15 minutit ja pliivärvi lahusega (Sigma-Aldrich) toatemperatuuril 3 minutit. Ruudusid vaadeldi läbi transmissioonielektronmikroskoobi (JEM-1400). pluss JEOLLtd.) 100 kV kiirenduspingel. Digitaalsed kujutised saadi CCD-kaameraga (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Tulemused

3.1. TFAM või GBA vähenemine kutsub esile ektoopilise mitokondriaalse DNA suurenemise

Esiteks näitasime näidet mitokondritest pärineva tsütoplasmaatilise DNA tuvastamisest HeLa rakkudes, kus siRNA hävitas TFAM-valgu (joonis 1A). TFAM on peamine mitokondriaalne transkriptsioonifaktor ning see toimib ka mitokondriaalse DNA replikatsioonis ja parandamises [20]. .

Selle geeni järjestuse polümorfismid on väidetavalt seotud Parkinsoni tõvega [21,22]. Pärast 3-päevast TFAM-i valgu hävitamist tuvastati HeLa rakkude tsütoplasmas palju kaheahelalisi DNA punkte.

Histoonid on positiivsed markerid tsütoplasmas olevale tuuma päritolu DNA-le ja negatiivsed markerid mitokondriaalsele DNA-le ja mitokondriaalsele DNA-le tsütoplasmas [23]. Need punktid ei lokaliseerunud histoonidega, mis viitab sellele, et need ei olnud tuumast pärineva DNA-ga. Lisaks ei lokaliseerunud mõned neist tsütoplasmaatilistest ektoopilistest DNA punktidest koos mitokondriaalse maatriksi markeriga Hsp60, mis näitab, et nad asusid väljaspool mitokondreid (joonis 1B, C).

Elektronmikroskoopia näitas ka, et ektoopiline DNA lekkis mitokondritest (joonis 2A, B). Kokkuvõtteks võib öelda, et ektoopiliste DNA-punktide suurenemine tsütoplasmas TFAM-i katkestamise tõttu oli tingitud mitokondriaalse DNA lekkimisest mitokondritest. Teiseks näitasime veel ühte näidet mitokondritest pärineva tsütoplasmaatilise DNA tuvastamisest HeLa rakkudes, milles siRNA hävitas GBA valku. (Joonis 1A).

GBA on Gaucher' tõve põhjustav geen, kuid GBA heterosügootne mutatsioon on ka Parkinsoni tõve riskitegur [24]. Pärast 3-päevast GBA valgu katkestamist tuvastati HeLa rakkude tsütoplasmas palju kaheahelalisi DNA punkte. Mõned DNA punktid lokaliseeriti histoonidega, mis viitab sellele, et need olid tuumast saadud DNA.

Teised DNA punktid ei paiknenud histoonidega koos, mis viitab sellele, et need ei olnud tuumast pärineva DNA, vaid mitokondritest pärineva DNA (joonis 1D). Kokkuvõtlikult võib öelda, et tsütoplasma ektoopiliste DNA punktide suurenemine GBA knockdowni tõttu oli vähemalt osaliselt tingitud mitokondriaalsest DNA lekkimisest mitokondritest.

For more information:1950477648nn@gmail.com