Konserveeritud tsüsteiinirikas sekretoorne valk MaCFEM85 interakteerub MsWAK16-ga, et aktiveerida taimekaitse

Abstraktne: Metarhizium anisopliaeon entomopatogeenne seen, mis võib peremeestaimedes endofüüdina toimides suurendada taimede kasvu ja resistentsust. Siiski on valkude vastastikmõjude või nende aktiveerimismehhanismide kohta vähe teada. Seente rakuvälise membraani (CFEM) valgud on levinud taimede immuunregulaatoritena, mis pärsivad või aktiveerivad taimede resistentsuse vastuseid. Siin tuvastasime CFEM domeeni sisaldava valgu MaCFEM85, mis paiknes peamiselt plasmamembraanis. Pärmi kahe hübriid (Y2H), glutatioon-S-transferaasi (GST) ja bimolekulaarse fluorestsentsi komplementatsiooni testid näitasid, et MaCFEM85 interakteerub rakuvälise domeeniga.Medicago sativa(lutserni) membraanivalk, MsWAK16. Geeniekspressiooni analüüsid näitasid, et MaCFEM85 ja MsWAK16 olid oluliselt ülesreguleeritudM. anisopliaejaM. sativa, vastavalt 12 kuni 60 tundi pärast koosinokuleerimist. Täiendavad pärmi kahe hübriidanalüüsid ja aminohappe kohaspetsiifiline mutatsioon näitasid, et MaCFEM85 ja MsWAK16 interaktsiooniks on vaja spetsiifiliselt CFEM domeeni ja 52. tsüsteiini. Kaitsefunktsiooni testid näitasid, et JA oli ülesreguleeritud, kuid Botrytis cinerea kahjustuse suurust ja Myzus persicae paljunemist pärssis MaCFEM85 ja MsWAK16 mööduv ekspressioon peremeestaime Nicotiana benthamiana mudelis. Need tulemused annavad ühiselt uudse ülevaate M. anisopliae ja peremeestaimede koostoimete aluseks olevatest molekulaarsetest mehhanismidest.

Tistanche toidulisandi eelised - suurendavad immuunsust

Märksõnad: seinaga seotud kinaas; CFEM-id; Metahizium anisopliae; taime immuunsus; Medicago sativa

1. Sissejuhatus

Taimede ja mikroobide vahelised vastasmõjud on laialt levinud ning on mineviku ja käimasoleva koosarengu tulemus. Nendel interaktsioonidel võivad olla iga osaleja jaoks kasulikud, neutraalsed või ebasoodsad tulemused [1–3]. Kasulik risosfääri mikrobioota võib kiirendada taimede kasvu ja parandada üldist tervist, kaitstes pinnases levivate haiguste eest või suurendades toitainete omastamist [4, 5]. Lai valik kasulikke mikroobe võib suurendada taimede võimeid, nagu toitainete omastamine, kasv ning patogeenide ja putukate kaitsevõime [6, 7]. Metarhizium Sorok¯ın on oluline entomopatogeensete seente perekond, millel on võime koloniseerida taimi [8], kuid on ka tõendeid, mis viitavad sellele, et perekonna liikmed võivad suurendada taimede patogeenide resistentsust. Näiteks leiti laboriuuringus 60% Fusarium solani (Mart.) Sacc. Metarhizium robertsii (varem tuntud kui M. anisopliae) juuresolekul võrreldes ilma M. robertsii kontrollidega [9]. Mõned Metarhizium tüved võivad taimekaitsegeenide ekspressiooni muutmise kaudu parandada taimede resistentsust kahjurite ja haiguste suhtes. Endofüütne kolonisatsioon M. Robertsiga aktiveerib nii jasmoonhappe (JA) kui ka salitsüülhappe (SA) kaitseradade ekspressiooni maisilehtedes; lisaks on selline koloniseerimine seotud taimede kasvu soodustamise ja Agrotis epsiloni (Hufnagel) vastsete arengu pärssimisega [10]. Metarhizium guizhouense aktiveeris Lansium parasiticum'i viljakoores -1,3-glükanaasi ja kitinaasi, mille tulemuseks oli Botrytis sp. ja Fusarium sp. Aglaia dookkoo Griffi [11] viljal. Veelgi enam, kui M. anisopliae kanti maapähkli seemikutele, aktiveeriti mitmesugused transkriptsioonifaktorid, sealhulgas WRKY-d, MYC-d, TGA-d ja etüleenile reageerivad transkriptsioonifaktorid, samas kui nitraadi transporterid ja valgud, mis seovad dehüdratsioonile reageerivaid elemente, ekspresseerusid samuti erinevalt [12] . See viitab sellele, et M. anisopliae reguleerib taime kaitsegeene, kuna see koloniseerib taime. Siiski on suhteliselt vähe teada taimekaitsereaktsioonide aluseks olevatest mehhanismidest pärast Metarhiziumi nakatumist. Efektorid on levinud vahend, mille abil mikroorganismid reguleerivad taimede resistentsust [13]. Taimeresistentsuse aktiveerumist iseloomustab tavaliselt oksüdatiivne purse ning hormoonide, metaboliitide ja muude signaalide esilekutsumine [13]. Taimehormoonid SA ja JA mängivad olulist rolli taimede resistentsuse esilekutsumisel, vahendades kahte erinevat kaitsesignaali rada [14]. SA signaalirada toimib peamiselt taimede allergilise reaktsiooni ja süsteemse omandatud resistentsuse korral patogeenide suhtes, kuid see võib olla seotud ka kaudsete taimekaitsereaktsioonidega, mis on põhjustatud nõelavate putukate toitumisest [15]. SA akumuleerumine on seotud lipiidide ülekandevalke (LTP) ja fenüülalaniini ammoniaaklüaasi (PAL) kodeerivate geenide suurenenud ekspressiooniga [16], mis vahendavad allavoolu spetsiifiliste metaboliitide, nagu flavonoidid ja ligniini [17], sünteesi ja akumulatsiooni. JA signaalirada toimib otseses ja kaudses vastuses mehaanilistele kahjustustele, seenpatogeenidele ja putukakahjuritele. Uuringud on näidanud, et JA signaaliülekandel on regulatiivne mõju spetsiifiliste metaboliitide, nagu terpenoidid, fenüülpropanoidid ja alkaloidid, sünteesile, millel on lai valik bioloogilisi funktsioone [18]. On näidatud, et pärast metüülJA-ga (MeJA) töötlemist taimerakkudes akumuleeruvad mõned spetsiifilised metaboliidid, sealhulgas paklitakseel Taxuse liikides [19, 20], terpenoidid Centella Asiatica (L.) Urban [21] ja saponiinid ženšennis [22]. . SA ja kitosaani (CHT) kasutamine esilekutsujatena kutsus tomatites esile ligniini akumulatsiooni ja kaitseensüümide reaktsioonid, mis vähendas Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi nakkuse esinemissagedust [23]. Lisaks kogunes nisu JA ja SA tase märkimisväärselt esilekutsuja PeaT kasutamisel, suurendades kaitsereaktsiooni kaera lehetäi Sitobion avenae (Fabricius) vastu [24]. See näitab, et taimede immuunsust võivad need efektorid reguleerida taimehormoonide ja metaboliitide kaudu.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Seente ekstratsellulaarse membraani (CFEM) valgud on levinud paljudes seentes. Need kodeerivad domeene, mis on tavaliselt 60 aminohappe (aa) pikkused ja sisaldavad kaheksat iseloomulike vahedega tsüsteiini [25]. CFEM domeenid on sarnased epidermaalse kasvufaktori (EGF) sarnaste domeenidega, mis toimivad rakuväliste retseptorite, signaalimuundurite või adhesioonimolekulidena peremees-patogeeni interaktsioonides [26]. CFEM-domeene sisaldavad valgud võivad efektoritena toimides manipuleerida taime resistentsuse vastust. Nisu leherooste seen Puccinia triticina Erikas kiirendas CFEM-i efektorikandidaat PTTG_08198 rakusurma kulgu ja soodustas reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) akumulatsiooni [27]. Antraknoosseen Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils sisaldab viit efektorit (CgCFEM6, 7, 8, 9 ja 15), mis pärsivad BAX-indutseeritud programmeeritud rakusurma Nicotiana benthamiana Domin [28]. Teatati, et fütosümbiootiline mükoriisaseen Laccaria bicolor (Maire) PDOrton sekreteerib sümbiootilistes kudedes mitmeid CFEM-valke, nagu Lac310796, Lac296573 ja Lac296572 [29]. Kuigi nende valkude keerulisi funktsioone ei ole mükoriisa sümbioosis edasi uuritud, viitavad varasemad tulemused sellele, et CFEM-valgud võivad funktsioneerida seente ja taimede vahelises signaaliülekandes. M. anisopliae võib peremeestaimel toimida kas entomopatogeense või endofüütilise seenena [30]. CFEM-valkude rollidest pole aga veel teatatud. Varem tuvastasime M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) CFEM domeeni sisaldava valgu [31]. Siin kirjeldame seost MaCFEM85 ja Medicago sativa seinaga seotud kinaasi MsWAK16 vahel. Analüüsisime MaCFEM85 järjestust ja viisime läbi katsed, et teha kindlaks, millised jäägid on MsWAK16-ga interaktsiooni jaoks kriitilised. Lõpuks, kasutades oma mudeltaimena N. benthamianat, hindasime taimede kaitsereaktsioone Botrytis cinerea ja lehetäide Myzus persicae vastu koos MaCFEM85 ja MsWAK16 mööduva ekspressiooniga ja ilma.

Cistanche tubulosa eelised- tugevdada immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Tulemused

2.1. MaCFEM85 oli kõige tihedamalt seotud mittepatogeensete seente CFEM-idega ja paiknes plasmamembraanis

Ehitati fülogeneetiline puu, et analüüsida seoseid MaCFEM85 ja teiste patogeensete ja mittepatogeensete mudelseente CFEM valkude vahel. Nende hulka kuulusid Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl), Neurospora crassa Shear & BODodge ja Beauveria bassiana (Bals.) (vt jaotis 4). MaCFEM85 oli kõige tihedamalt seotud B. bassiana CFEM valkudega ja seetõttu evolutsiooniliselt lähemal mittepatogeensetele kui patogeensetele seentele (joonis 1a).

Joonis 1a

2.2. MaCFEM85 oli M. sativaga koostoime ajal ülesreguleeritud

Seinaga seotud retseptorilaadsed kinaasid (WAK-id) esindavad retseptoritaoliste proteiinkinaaside (RLK) superperekonna alarühma ja hõlmavad rakuvälist domeeni, transmembraanset heeliksit ja intratsellulaarset kinaasi domeeni. Nad mängivad olulist rolli taimede kasvu, arengu, stressireaktsiooni ja patogeeniresistentsuse signaaliradade reguleerimisel [32]. RNA ekstraheeriti M. anisopliae hyphae ja M. sativa juurtest pärast koosinkubeerimist, et uurida MaCFEM85 ja MsWAK16 ekspressioonimustreid. Nii MaCFEM85 kui ka MsWAK16 ekspresseerusid oluliselt kõrgemal tasemel kaasinkubeerimise ajal 12 kuni 6 0 h (joonis 1c, d). Alates 0 kuni 36 tundi suurenes MaCFEM85 ekspressioon järk-järgult, saavutades haripunkti 36 tunni pärast. M. anisopliae ja M. sativa kombinatsioonis oli see × 593 korda kõrgem kui üksi kasvatatud M. anisopliae. Kuigi MaCFEM85 ekspressioon oli 48–60 tunni jooksul veidi vähenenud, ekspresseeriti see siiski oluliselt kõrgemal tasemel kui üksi kasvatatud M. anisopliae puhul. MsWAK16 oli samuti oluliselt ülesreguleeritud, ekspressioon saavutas haripunkti 36 tunni pärast. M. anisopliae'ga nakatunud M. sativas oli MsWAK16 x 89,06 korda kõrgem kui M. sativa ilma M. anisopliae'ta. 36 kuni 60 tunni jooksul vähenes MsWAK16 tase veidi, kuid selle ekspressioon oli siiski oluliselt kõrgem kui inokuleerimata taimedel.

2.3. MaCFEM85 suhtleb MsWAK16-ga in vitro ja in vivo

MaCFEM85 võimaliku funktsionaalse mehhanismi uurimiseks vastuseks M. anisopliae ravile viidi läbi pärmi kahe hübriid (Y2H) sõeluuring, et eelnevalt tuvastada peremeesvalke, mis interakteeruvad MaCFEM85-ga. MsWAK16 rakuvälise domeeni (MsWAK16-ED) ja MaCFEM85 vahelist interaktsiooni uuriti pärmi kahe hübriidanalüüsiga üks-ühele, kasutades BD-vektorina pGBKT7-s olevat MaCFEM85 ja AD vektorina pGADT7-s MsWAK16. Kogu transformeeritud pärm kasvas hästi SD-T/L puudulikkusega söötmel ning positiivne kontrollrühm ja katserühm kasvasid edukalt SD-T/L/H/A + X- -gal puudulikkusega söötmel. See näitas, et MaCFEM85 võib suhelda MsWAK{19}}ED-ga (joonis 2a).

Joonis 2. MaCFEM85 ja MsWAK16 vahelise interaktsiooni valideerimine.

In vitro valideerimiseks sisestati pGEX6-P2-sse glutatioon-S-transferaasi (GST) märgistatud MsWAK16-ED (kodeerides 60 kDa suurust toodet) ja polühistidiiniga (His) märgistatud MaCFEM85 ( kodeeriv toode 17 kDa) sisestati pET{10}}b. Immunoblotanalüüs His ja GST antikehadega näitas, et rekombinantne valk MaCFEM{11}}His suhtles GST-MsWAK16-ED saagiga, kuid mitte ainult GST-ga ja et GST-MsWAK16- ED suhtles His-iga. -MaCFEM85 (joonis 2b). MaCFEM85 ja MsWAK16 vahelise koostoime täiendavaks kinnitamiseks viisime läbi bimolekulaarse fluorestsentsi komplementatsiooni (BiFC) testi MaCFEM{21}}YFPN ja MsWAK16-YFPC konstruktidega. MaCFEM85-YFPN ja MsWAK16-YFPC koosekspressioon tubakalehtedes tekitas kollase fluorestsentssignaali, mis näitab, et MaCFEM85 suhtles MsWAK16-ga (joonis 2c).

2.4. MaCFEM85 ja MsWAK16 interaktsioonide peamised saidid

MaCFEM85 piirkonna määratlemiseks, mis on vajalik interaktsiooniks MsWAK16-ED-ga, ennustati valgudomeene võrgutarkvaraga SMART (joonis 3a). MaCFEM85 sisaldas CFEM domeeni 19-86 aa piirkonnas. Samuti ennustati tertsiaarset struktuuri (joonis 3b). Selle domeeni kaheksa tsüsteiini andsid tulemuseks neli disulfiidsidet (CYS26 ja CYS69, CYS30 ja CYS64, CYS43 ja CYS50 ning CYS52 ja CYS85), säilitades valgu stabiilsuse (joonis 3b). MaCFEM85 oletatava interaktsiooni saidi(de) valideerimiseks genereeriti valgu seitse muteeritud versiooni ja sisestati söödavalkudena pGBKT7-sse. Iga rekombinantne vektor kaastransfekteeriti AD-MsWAK16-ED-ga Y2H Gold tüves. CYS52 mutatsiooniga tüvi ei kasvanud selektiivsel söötmel (joonis 3c, joonistatud punasega), mis näitab, et CYS52 on vajalik MaCFEM85 interaktsiooniks MsWAK{25}}ED-ga.

2.5. MaCFEM85 koostoime MsWAK16-ga aktiveerib taimede immuunvastuse

2.5.1. MaCFEM85 ja MsWAK16 rolli hindamine haigusresistentsuses B. cinerea vastu

Et uurida MaCFEM85 ja MsWAK16 võimalikku osalust patogeeni kaitsereaktsioonides, uurisime, kas MaCFEM85, MsWAK16 või MaCFEM85 ja MsWAK16 üleekspressioon võib suurendada resistentsust B. cinerea suhtes. Me ekspresseerisime neid vektoreid ajutiselt N. benthamiana lehtedes. Western blot test näitas, et MaCFEM85 ja MsWAK16 ekspresseerusid võrreldaval tasemel, kui neid ekspresseeriti üksi või koos, mis näitab, et MaCFEM85 ja MsWAK16 ekspresseerusid edukalt tubakas (joonis 4a). Haigustestid viidi läbi ka N. benthamianaga, mis oli infiltreeritud MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 või GFP kontrolliga. MaCFEM85, MsWAK16 või MaCFEM{19}}MsWAK16-ga infiltreeritud lehtedel olid kahjustused kontrolltaimedega võrreldes oluliselt väiksemad (~30% 2 päeva pärast inokuleerimist) (joonis 4b). Need andmed näitavad, et MaCFEM85 mööduv ekspressioon N. benthamianas suurendas resistentsust B. cinerea suhtes ning et MaCFEM85 ja MsWAK16 reguleerisid positiivselt kaitsereaktsiooni B. cinerea vastu.

Joonis 3. MaCFEM5 ja MsWAK16 vahelise interaktsiooni saidi identifitseerimine.

Joonis 4. Taimeresistentsuse esilekutsumine MaCFEM85 ja MsWAK16 mööduva ekspressiooniga.

2.5.2. MaCFEM85 ja MsWAK16 rolli hindamine lehetäide kaitses N. benthamianas

MaCFEM85 ja MsWAK16 rolli edasiseks uurimiseks nakatati ajutiselt MaCFEM85 ja MsWAK16 ekspresseerivad N. benthamiana taimed M. persicae'ga ning populatsioone hinnati. Selle katse jaoks agroinfiltreeriti suur ala igast N. benthamiana lehest rekombinantse binaarse vektoriga pYBA1132, mis sisaldas MaCFEM85 ja MsWAK16. Kontrollina kasutati GFP-d. 12 tundi pärast infiltratsiooni paigutati igale lehele 20 M. persicae täiskasvanud isendit, mis paljastas infiltreerunud ala lehetäide eest. Järgmise kolme päeva jooksul registreeriti täiskasvanute lehetäide suremus ja nümfide arv; seejärel eemaldati nümfid. MaCFEM85, MsWAK16 või MaCFEM{11}}MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, DF=3, p < 0,30081) ekspresseerivatest taimedest toituvate M. persicae populatsioonide suremusriskis ei olnud olulist erinevust. ) (Joonis 4c). Kuid 24, 48 ja 72 tunni pärast oli iga täiskasvanud lehetäi keskmine järglaste arv GFP kontrolli ekspresseeriva N. benthamiana puhul oluliselt suurem võrreldes MaCFEM85, MsWAK16 või MaCFEM{24}}MsWAK16 ekspresseerivate järglastega (joonis). 4d).

2.5.3. MaCFEM85 ja MsWAK16 rolli hindamine hormoonide akumulatsioonis ja hormoonidega seotud geeniekspressioonis

Et analüüsida erinevusi eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 ja MaCFEM85+MsWAK16 ekspresseerivate N. benthamiana taimede kaitsereaktsioonide vahel, mõõtsime JA, SA ja kogu flavonoidide taset ning seotud geenide ekspressiooni. Tulemused näitasid, et JA ja SA tasemed erinevad eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 ja MaCFEM{6}}MsWAK16 ekspresseerivate taimede vahel (joonis 5a). Võrreldes nendega, mis ekspresseerisid eGFP-d, olid MA tasemed MaCFEM85 ekspresseerivates taimedes oluliselt madalamad; SA tase oli veidi tõusnud, kuid erinevused ei olnud olulised. Seevastu MsWAK16 ekspresseerivad taimed ei näidanud olulisi erinevusi JA tasemetes võrreldes eGFP kontrolliga, samas kui SA tasemed olid oluliselt madalamad kui kontrollis (joonis 5a). MaCFEM85+MsWAK16 ekspresseerivates taimedes suurenesid JA ja SA tasemed eGFP-ga võrreldes vastavalt oluliselt.

Joonis 5. Hormoonide tase ja hormoonvastuse geeniekspressioon

Flavonoidide üldsisaldus oli MaCFEM{0}}MsWAK16 ekspresseerivates taimedes kõigi teiste ravirühmadega võrreldes oluliselt kõrgem (joonis 5a). Biosünteesi geeniekspressioonitasemed olid MsWAK16 ja MaCFEM85+MsWAK16 ekspresseerivates taimedes sarnased. Näiteks JA vastusega seotud geenid, nimelt COI1, MYC2 ja PDF1.2, olid oluliselt ülesreguleeritud võrreldes GFP-d ekspresseerivate taimedega (joonis 5b). Sarnaselt ekspresseerusid SA-ga seotud geenid NPR1, WRKY70 ja PR1 oluliselt erinevalt taimedes, mis ekspresseerisid MsWAK16 ja MaCFEM{16}}MsWAK16; NPR1 reguleeriti üles, samas kui WRKY70 ja PR1 olid kontrolliga võrreldes alla reguleeritud (joonis 5b). Samuti uurisime võtmegeenide ekspressiooni Shikimic happe ja fenüülpropanoidi sünteesi radadel, mis mõlemad on seotud flavonoidide sünteesiga. Üldiselt ei indutseerinud MaCFEM85 ekspressioon üksi nende geenide oluliselt kõrgemat ekspressiooni tubakas. Kuid need geenid olid MsWAK16 või MsWAK16+MaCFEM85 ekspresseerivas tubakas GFP kontrolliga võrreldes ülesreguleeritud (joonis 5c).

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

3. Arutelu

3.1. Konserveeritud CFEM-valgu motiiv täidab seeneliikides mitmeid funktsioone

CFEM domeen on seentele ainulaadne ja esineb tavaliselt seente rakuvälise membraani valkudes. Domeen pärines Ascomycota ja Basidiomycota kõige uuemast ühisest esivanemast [33]. Hiljutised uuringud on näidanud, et seenpatogeenides olevad CFEM-valgud võivad toimida taimede immuunregulaatoritena, põhjustades peremeestaime immuunsupressiooni või -aktivatsiooni sõltuvalt nakkuse tüübist [28,34,35]. M. anisopliae CFEM-domeeni sisaldavate valkude kohta on vähe teateid, ainult evolutsioonilise võrdluse kontekstis teiste seentega [36]. Selles uuringus võrdlesime M. anisopliae CFEM valke teiste teadaolevate CFEM valkudega nii patogeensetes kui ka mittepatogeensetes seentes. Kinnitasime, et MaCFEM85 lähim homoloog on Cfem5, mis on leitud Beauveria bassianas, mis on üks selle liigi 12 CFEM-valgust (täiendav joonis S1). BbCfem5 on raua omandamiseks hädavajalik [37]. Veelgi enam, prognoositud tertsiaarse struktuuri põhjal on CFEM domeen MaCFEM85-s väga sarnane Candida albicans (CPRobin) Berkhout'is leitud pinnaantigeenivalguga 2 (CSA2), milles 65 jääki (96% järjestusest) on modelleeritud 99,8-ga. % usaldus [31]. Candida albicans on loomade patogeen; CSA2 mängib olulist rolli kasvus ja patogeensuses, eraldades hemoglobiinist heemi ja transpordides heemi rakuseinast plasmasse [38–40]. Me oletame, et MaCFEM85 võib olla seotud putukate peremeesorganismide M. anisopliae virulentsusega. Need MaCFEM85 kombineeritud funktsioonid loomade patogeensete infektsioonide korral ja taimede immuunsuse aktiveerimine muudavad valgu põnevaks tuleviku uurimistööks.

3.2. Disulfiidsidemed on valkude funktsiooni jaoks olulised struktuurid

Valgu struktuuri konformatsiooniline terviklikkus on otseselt seotud selle funktsioneerimisvõimega. Tsüsteiinipaaride moodustatud disulfiidsidemed soodustavad valgu voltimist ja konformatsioonilist stabiilsust ning neid peetakse spetsiifiliste retseptorite või ligandide äratundmise ja seondumise võtmekohtadeks [41]. Näiteks taimepatogeeni Cladosporium fulvum efektorvalgu AVR4 ühe kolmest konserveerunud disulfiidsideme katkestamine põhjustab proteaasitundlikkuse ja kitiini sidumisvõime vähenemise [42]. Kolmes teises C. fulvum valgus (ECP1, ECP2 ja ECP5) summutavad tsüsteiinide ühekordsed asendused alaniinidega tomati ülitundlikkusreaktsiooni, mis näitab, et tsüsteiinid on stabiilsuse ja ülitundlikkusreaktsiooni esilekutsuva aktiivsuse säilitamiseks üliolulised [43]. Veelgi enam, Magnaporthe oryzae küpses valgus MC69 võib kahe konserveerunud tsüsteiinijäägi (Cys36 ja Cys46) mutagenees kahjustada MC69 funktsiooni, ilma et see mõjutaks sekretsiooni, mis viitab disulfiidsideme olulisusele konkreetselt MC69 patogeensuses [44]. CFEM domeen näib olevat tsüsteiinijääkide suuruse ja mustri poolest sarnane EGF-i sarnaste domeenidega, mis sisaldavad kolme või nelja paari disulfiidsidemeid. EGF-valgud võivad peremees-patogeeni interaktsioonides toimida rakupinna retseptorite, signaalimuundurite või adhesioonimolekulidena [45]. Selles uuringus me mitte ainult ei leidnud, et MaCFEM85 CFEM-domeen sisaldas kaheksat konserveerunud tsüsteiini, mis moodustasid neli paari disulfiidsidemeid (joonis 3b), vaid kinnitasime ka, et CFEM oli MaCFEM85 ja MsWAK16 vahelise interaktsiooni jaoks kriitiline domeen. Lisaks leidsime tsüsteiinijääkide saidipõhise mutatsiooni kaudu alaniiniks, et positsioonis 52 asuv tsüsteiinijääk oli interaktsiooniks vajalik tuum (joonis 3c). Need tulemused annavad aluse CFEM85 – WAK16 interaktsiooni füsioloogiliste funktsioonide edasistele uuringutele.

3.3. MaCFEM85 koostoime MsWAK16 aktiveeritud taimekaitsega

Mikroobide ja taimede interaktsioonides aktiveerivad taimede kaitsereaktsioonid tavaliselt mikroobsed efektorvalgud. Indutseeritud kaitse on muutumas resistentsuse edendamiseks oluliseks vahendiks bioloogilises kahjuritõrjes. CFEM-valgud on tuvastatud kui taime immuunsüsteemi aktiveerimise või inhibeerimise reguleerimises osalevad efektorid [28,46]. Siiski on vähe avaldatud uuringuid, mis seovad nende immuunfaktorite reguleerimise nende spetsiifilise rolliga taimehaigustes ja putukate resistentsuses. Selles uuringus kasutasime entomopatogeenset ja endofüütilist seent M. anisopliae, et tuvastada interaktsiooni MaCFEM85 ja rakuseinaga seotud kinaasi MsWAK16 vahel M. sativas. Tulemused näitasid, et see interaktsioon vähendas kahjustuste suhet pärast B. cinerea inokuleerimist (joonis 4b) ja M. persicae populatsiooni kasvukiirust (joonis 4d), mis näitab, et MaCFEM85 ja MsWAK16 vaheline interaktsioon suurendas M. sativa resistentsust lehetäide suhtes. JA, SA ja etüleeni (ET) taseme muutusi saab kasutada markeritena taimede resistentsuse esilekutsumise hindamiseks [47,48]. Siin näitasime, et MaCFEM85 interakteerub MsWAK16-ga, et mõjutada taimede resistentsust hormonaalse regulatsiooni kaudu ja pärssida M. persicae paljunemiskiirust (joonis 4d). Sarnastest uuringutest on teatatud ka varem. Näiteks näidati, et Brevibacillus laterosporuse efektorvalk PeBL1 indutseerib JA ja SA akumuleerumist tomatites ning vähendab nendest taimedest toitunud M. persicae teise ja kolmanda põlvkonna populatsioonide kasvukiirust. Lisaks on efektoritega pritsitud tomatitaimedel M. persicae'le tõrjuv toime [49]. Eliitsiorvalgu PeBC1 kasutamine harilikule oale (Phaseolus vulgaris L.) põhjustab roheliste virsiku lehetäide puhul väljendunud ja märkimisväärseid subletaalseid toimeid. PeBC1-ga töödeldud taimed näitavad JA ja SA-ga seotud geenide olulist ülesreguleerimist [50]. Beauveria bassiana esilekutsuja PeBb1 vähendab M. persicae viljakust tubakal ja indutseerib JA ja ET-ga seotud geenide ekspressiooni [51]. Käesolevas uuringus reguleeris MaCFEM85 ja MsWAK16 mööduv ekspressioon tubakas oluliselt JA vastusega seotud geene COI1, MYC2 ja PDF1.2 (joonis 5b) ning suurendas JA ja kogu flavonoidide sisaldust (joonis 5a), mis oli tulemustega võrreldav. kirjanduses, nagu eespool kirjeldatud. Siiski ei tuvastanud me tubakas kõrget SA taset 12 tundi pärast infiltratsiooni ja MsWAK16 või MaCFEM{35}}MsWAK16 ajutiselt ekspresseerivad taimed näitasid oluliselt vähenenud SA taset ja SA vastusega seotud geenide allareguleerimist (joonis 5a, b) . See näitas, et erinevate taimsete hormoonide stimuleerimine võib põhjustada mitte ainult sünergistlikke tegevusi, vaid ka läbirääkimisi ja tagasisidet, võimaldades taimedel reageerida erinevatele stiimulitele. Taimedes on varem teatatud suurenenud JA tasemest, kuid madalast SA tasemest. Näiteks A. thaliana puhul, millel puudus SA akumulatsioon, olid JA tasemed 25- korda kõrgemad kui metsiktüüpi A. thaliana ja JA-le reageerivad geenid olid aktiveeritud [52]. Samuti on teatatud, et mõned bakterid võivad tõsta JA taset taimedes, et pärssida SA akumuleerumist, vältides SA põhjustatud kahju. Näiteks Pseudomonas syringae sihib COI1 retseptorit toksiini, koronatiini kaudu, mis reguleerib negatiivselt JA rada [53]. See soodustab MYC2-indutseeritud transkriptsioonifaktorite ANAC019, ANAC055 ja ANAC072 [54] ülesreguleerimist, inhibeerides ICS1 (SA sünteesi võtmegeen) transkriptsiooni ja vähendades seega SA tootmist ja signaaliülekannet. Käesolevas uuringus põhjustas MaCFEM85 ja MsWAK16 vaheline interaktsioon JA-le reageerivate geenide suurenenud JA akumuleerumist ja ülesreguleerimist, kuid SA akumulatsiooni ja SA-ga seotud geenide transkriptsiooni pärssimist. See näitas, et MaCFEM85 ja MsWAK16 vaheline interaktsioon indutseeris JA, parandades seeläbi taimede resistentsust lehetäide suhtes.

N. benthamiana puhul, mis ekspresseerib ajutiselt MaCFEM85 ja MsWAK16, tõusis JA tase ja vähenes B. cinerea kahjustuste suurus (joonis 4b), mis on kooskõlas varasemate uuringutega. JA osaleb taimede resistentsuses putukate ja nekrotroofsete patogeenide suhtes [52,55]. B. cinerea nekrotroofse patogeenina pärssis JA ja ET akumuleerumine [56]. A. thaliana ET-puuduliku mutandi ein2-1 ja JA-vastuse mutantse coi1-1 korral vähenes allavoolu kaitsegeeni PDF1.2 tase oluliselt ja tundlikkus B. cinerea suhtes suurenes [ 57]. Leidsime siin, et JA akumuleerumine ja JA-ga seotud geenide transkriptsioon suurenes oluliselt N. benthamianas, mis ekspresseeris ajutiselt MaCFEM85 ja MsWAK16, samas kui SA akumuleerumine ja SA-ga seotud geenide transkriptsioon olid pärsitud. MaCFEM85 ja MsWAK16 ekspressioon näitas samuti pärssivat toimet B. cinereale. See näitas, et JA aktiveerisid MaCFEM85 ja MsWAK16 ja et see mängis juhtivat rolli taimede resistentsuses B. cinerea suhtes.

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Seenetüved, taimsed materjalid ja kultiveerimismeetodid

Metarhizium anisopliae isoleeritud tüvesid Ma 9 kasvatati kartuli-suhkru-agari (PSA) söötmel (200 g vees keedetud kooritud kartuliekstrakti, 20 g sahharoosi ja 15 g agarit/l). Värske sporangiumipulber koguti 10 päeva pärast. Nicotiana benthamiana taimi kasvatati kunstlikus kliimakambris 14/10 h valguse/pimeduse tsükliga (27/25 ◦C). Mööduvaks geeniekspressiooniks Agrobacterium-vahendatud transformatsiooni kaudu kultiveeriti Agrobacterium tumefaciens'i tüve GV3101 Luria Broth (LB) söötmes (10 g trüptooni, 5 g pärmiekstrakti ja 10 g NaCl/l). Pärmitüve Gold (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, Hiina) kultiveeriti pärmiekstrakti peptoondekstroosi (YPDA) söötmel (10 g pärmiekstrakti, 20 g peptooni, 20 g glükoosi ja 0,03 g adeniini hemisulfaati/l). Iga vektori ja tüve jaoks kasutati sobivaid antibiootikume, nimelt rifampitsiini, kanamütsiini või ampitsilliini (vastavalt 25, 50 või 50 µg/ml). Selles uuringus kasutatud tüved ja plasmiidid on loetletud täiendavas tabelis S1. Medicago sativa seemnete pind steriliseeriti 75% etanooliga 1 minut, millele järgnes 50% NaClO (5, 5%) 15 minutit. Seemned segati põhjalikult ja pesti seejärel steriilses vees kolm korda 5 minutit. Seemneid inkubeeriti 4 °C juures pimedas üle 24 tunni, seejärel idandati 1% vesiagari plaatidel toatemperatuuril üleöö. Kolm päeva pärast idanemist kanti arenevad seemikud filterpaberile 9-cm steriilsetele Petri tassidele, 20 seemikut tassi kohta. Ravid ja kontroll jaotati vastavalt 15 tassile. Seejärel niisutati seemikuid 10 ml M. anisopliae spoorisuspensiooniga, mis sisaldas 107/ml, ja kontrolli niisutati 10 ml steriilse veega. 0, 12, 24, 48 ja 60 tunni pärast valiti iga ajaintervalli jaoks kolmest Petri tassist juhuslikult seemikud. Proovid külmutati vedelas lämmastikus ja säilitati temperatuuril –80 ◦C.

4.2. qRT-PCR ja plasmiidi ehitus

Kogu RNA ekstraheeriti M. anisopliae (hyphae) ja M. sativa (juured) TRIzol reagendiga (Invitrogen, CA, USA) järgides tootja juhiseid. Saadud RNA kvaliteeti ja arvukust mõõdeti NanoPhotometer®-iga (Implen, Münich, Saksamaa). Esimese ahela cDNA süntees (kuni 2 ug RNA-d) viidi läbi, kasutades 5 × All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Kanada), järgides tootja juhiseid. qRT-PCR viidi läbi, kasutades 2×SYBR Green qPCR Master Mixi firmalt US EVER BRIGHT ® INC ja ABI QuantStudio 5 süsteemi, järgides tootja juhiseid. Iga geeni jaoks kasutatud praimerid on loetletud täiendavas tabelis S2. Maury [58], Msactin [59] ja Nbactin [60] kasutati sisemiste võrdlusgeenidena ekspressiooniandmete normaliseerimiseks. Reaktsioon viidi läbi järgmistes tingimustes: 5 minutit temperatuuril 95 °C, millele järgnes 40 tsüklit temperatuuril 95 °C 15 sekundit ja temperatuuril 60 °C 40 sekundit. Iga proovi jaoks oli kolm tehnilist kordust. Suhteline avaldis arvutati 2−∆∆Ct meetodil [61]. Statistiline olulisus määrati ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) ja Duncani mitme vahemiku testiga SPSS v20.0 (SPSS) abil.

4.3. Valkude mööduv ekspressioon N. benthamianas

MaCFEM85 kodeeriv järjestus (CDS) amplifitseeriti ülitäpse DNA polümeraasiga, kasutades matriitsina cDNA-d. Subtsellulaarse lokaliseerimise testi jaoks klooniti MaCFEM85 jaoks CDS-i sisaldavad PCR-produktid vastavalt pYBA1132-eGFP-sse (seeditud EcoRI ja SalI-ga) ja pcambia1300-kirssi (EcoRI ja SacI). Kõik konstruktsioonid valideeriti sekveneerimisega (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Peking, Hiina). Selles uuringus kasutatud praimerid on loetletud täiendavas tabelis S2. MaCFEM85-eGFP ja MaCFEM85-mCherry ajutise ekspressiooni jaoks N. benthamianas transformeeriti A. tumefaciens'i tüvi GV3101 iga plasmiidiga ja kontrolliti PCR-iga. Agrobacterium'i kultiveeriti üle öö temperatuuril 28 ◦C loksutades. Rakud koguti 5-minutise 5000 p/min tsentrifuugimisega toatemperatuuril, pesti kolm korda steriilse topeltdestilleeritud veega ja resuspendeeriti 10 mM MgCl2 puhvris (mis sisaldas 10 mM MES-i ja 10 mM atsetosüringooni, pH 5,7). Rakususpensiooni OD600 reguleeriti väärtusele 0,5, seejärel infiltreeriti 4- kuni 5-nädalaste N. benthamiana lehtede alumisse külge 1-mL süstlaga. Iga leht infiltreeriti 50 ui A. tumefaciens'iga; taime kohta töödeldi kolme lehte ja igas töötlemisrühmas oli kolm taime. Töödeldud lehed koguti 30 tunni pärast ja visualiseeriti Zeiss LSM980 konfokaalse mikroskoobiga (Carl Zeiss, Saksamaa), et määrata subtsellulaarne lokaliseerimine.

Tistanche'i eelised meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

4.4. Fülogeneetiline analüüs

Fülogeneetiline puu konstrueeriti MEGA X-is naaberliitumise meetodil. 1000 alglaadimiskorda kasutasid P-kauguse mudelit. Puu genereerimiseks kasutatud aminohappejärjestused saadi BLASTP-otsinguga seotud seente NCBI andmebaasi (nt Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumiodiplodedium the Lasocbriodiplodiaum, Glioocrodiplodiaum, , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana ja Paecilomyces lilacinus), kasutades päringuna MaCFEM85.

4.5. Pärmi kahe hübriidanalüüsid

MaCFEM85 ja MsWAK16 vahelise koostoime kontrollimiseks kasutati Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc.; nüüd Takara Bio USA, Inc.). Ilma signaalpeptiidita MaCFEM85 sisestati söödana pGBKT7-sse ja MsWAK16 rakuväline domeen (MsWAK{6}}ED) sisestati saagiks pGADT7-sse. Pärmi suhtes pädevate rakkude ettevalmistamine ja transformatsioonid viidi läbi, kasutades Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, USA), järgides tootja juhiseid. Sööda- ja saakloomade plasmiidid muudeti koos pärmitüveks Gold. Valkude ja valkude interaktsioone analüüsiti kasvu alusel SD topeltväljalangemise söötme (DDO, SD/-Trp-Leu) ja SD neljakordse väljalangemise söötme (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade) plaatidel.

4.6. BiFC test

BiFC konstruktide genereerimiseks lineariseeriti pUC-SPYNE ja pUC-SPYCE vektorid BamHI-ga seedimisega. MaCFEM85 ja MsWAK16 täispikad CDS-d klooniti ja sisestati lineariseeritud plasmiididesse, kasutades rekombinantset ensüümi, et saada MaCFEM85-YFPN ja MsWAK16-YFPC konstruktid. Plasmiide, mis sisaldasid MaCFEM85 ja MsWAK16, kaastransformeeriti negatiivsete kontrollidena tühjade vektoritega (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE ja pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Kõik vektorid viidi N. benthamianasse Agrobacterium-vahendatud transformatsiooni teel, nagu ülalpool kirjeldatud. Fluorestsentssignaale täheldati lehtede epidermise rakkudes, kasutades Zeiss LSM980 konfokaalset mikroskoopi (Carl Zeiss, Saksamaa). Vektori ehitamiseks kasutatavad praimerid on loetletud täiendavas tabelis S2.

4.7. GST allatõmmatav test

GST rippanalüüside jaoks sisestati MsWAK16-ED pGEX-6P-2 vektorisse ja MaCFEM85 sisestati pET-21b-sse. Puhastatud liitvalke (GST-MsWAK16- ED) ja pGEX-6P-2 laadimata valku (GST) kasutati söödavalguna ja puhastatud pET-21 Saagiks kasutati b-MaCFEM85 sulandvalku (His-MaCFEM85). GST rippanalüüsid viidi läbi Mag-Beads GST Fusion valgu puhastussüsteemiga (Sangon Biotech, Shanghai, Hiina), järgides tootja juhiseid. Lühidalt, Mag-Beads pesti viis korda 1x fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS, pH 7,4), et vabastada alkoholikaitse ja seejärel lisati 10 ml GST või GST-MsWAK16-ED. Helmeid segati ümberpööramisega toatemperatuuril 30 minutit. Pärast supernatandi eemaldamist pesti Mag-Beads viis korda 1 × PBS-ga. His-MaCFEM85 lisati juba GST-ga seotud Mag-Beads'idele ja segu inkubeeriti öö läbi 4 °C juures pöörlemisega. Seejärel pesti helmeid viis korda 1 × PBS-ga, et eemaldada seondumata valgud. Seejärel eraldati helmestele immobiliseeritud valgud SDS-PAGE abil, kanti nitrotselluloosmembraanile (100 V, 1 h) ja analüüsiti Western blot abil. Membraanid pesti kolm korda 10 minutit PBS + Tweeniga (PBST). Membraanid blokeeriti 2 tundi toatemperatuuril 5% kooritud piimaga, seejärel inkubeeriti ProteinFind anti-His hiire monoklonaalse antikehaga (TransGen Biotech, Peking, Hiina) (lahjendatud 1:3000) või ProteinFind anti-GST hiire monoklonaalse antikehaga 2 korda. h 4 ◦C juures. Seejärel sukeldati membraanid ProteinFind kitse küülikuvastasesse IgG(H+L) (HRP) antikehasse (TransGen Biotech, Peking, Hiina) (lahjendatud 1:5000) 1 tunniks toatemperatuuril. Membraanid visualiseeriti EasySee® Western Blot Kitiga (TransGen Biotech, Peking, Hiina), järgides tootja juhiseid.

4.8. Võtmekoha tuvastamine MaCFEM85-s

MaCFEM85 ja MsWAK16 interaktsiooniks vajaliku suuruse määramiseks viidi läbi PCR amplifikatsioon, et luua mitu MaCFEM85 kärbitud vormi. Vektorisse sisestati CFEM-domeen (MaCFEM85-CFEM; aa jäägid 19–86) ja C-terminal ilma CFEM-domeenita (MaCFEM85-C, aa jäägid 87–170). pGBKT7 söödavalguna (täiendav tabel S1). Veel viis varianti konstrueeriti polüpeptiidi sünteesi abil, et muteerida tsüsteiin alaniiniks positsioonides 26, 30, 43, 52 ja 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8530, ∆CFEM8, ∆543 CFEM8552 ja ∆CFEM858 kõik vastavalt). Neid variante kasutati Y2H katsete läbiviimiseks MsWAK16-ED-ga. Transformeeritud pärmirakkude kasvu analüüsiti sünteetilistel väljalangenud SD/-Trp-Leu plaatidel ja SD/-Trp-Leu-His-Ade plaatidel, mis sisaldasid X- -galaktosidaasi (X- -Gal).

4.9. Taimede resistentsuse testid

Myzus persicae saadi ettevõttest Henan Quanying Biological Co., Ltd. Üks nädal enne biotestide algust paigutati 150 täiskasvanud lehetäi kolmele N. benthamiana taimele (50 lehetäi taime kohta). 72 tunni pärast eemaldati kõik täiskasvanud isendid pehme kunstnikuharjaga ja nümfidel lasti veel neli päeva toituda, enne kui nad viidi üle N. benthamianasse lehetäide jõudluse testimiseks.

4.10. Lehetäide jõudlusanalüüsid

Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) kasutati M. persicae jõudluse, taimede resistentsuse B. cinerea vastu ja hormoonidega seotud geenide ekspressiooni hindamiseks. Agrobaktereid, mis kandsid kas pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 või pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16, kasvatati LB-s, millele oli lisatud sobivaid antibiootikume, 36 tundi temperatuuril 28 °C. Rakke pesti kolm korda, seejärel resuspendeeriti infiltratsioonipuhvris (10 mM MgCl2, 10 mM MES ja 100 uM atsetosüringoon, pH 5,6) kuni OD600 väärtuseni 0,6. Kaasinfektsiooni korral reguleeriti MaCFEM85 ja MsWAK16 kandvad bakterid OD600 väärtusele 1, 2 ja segati seejärel võrdsetes kogustes. Täielikult laienenud lehed immutati bakteritega, kasutades 1-mL nõelata süstlaid. Igale taimele infiltreeriti kolm lehte ja iga töötlust rakendati kolmele taimele, kokku 12 taime katse kohta.

Lehetäide jõudluse testimiseks kanti iga lehe infiltreerunud alale 20 täiskasvanud lehetäi 12 tundi pärast Agrobacterium'i pealekandmist. Lehetäid piirati 5 mm läbimõõduga klambripuuridega. Iga ravi korrati viis korda. Täiskasvanud lehetäide suremust ja äsja munenud nümfide arvu registreeriti iga päev kolme päeva jooksul. B. cinereat kultiveeriti viis päeva PDAY-l. 12 tundi pärast Agrobacterium'i infiltratsiooni torgati äsja kasvatatud B. cinerea 5- mm seenekoogiks ja seeneniidistiku kasvupind kinnitati lehepinnal oleva infiltratsiooniala külge. Haiguse arengu soodustamiseks hoiti taimi niiskes, kattes need plastkilega kandikutel temperatuuril 22 ◦C, et soodustada haiguse progresseerumist. 48 tunni pärast hinnati haiguse kulgu nakatatud lehtedes, mõõtes kahjustuste suurust. Asjakohaste geenide suhtelise ekspressiooni kvantifitseerimiseks koguti kolm infiltreerunud lehte igalt taimelt 12 tundi pärast infiltratsiooni, seejärel külmutati vedelas lämmastikus ja säilitati temperatuuril -80 kraadi . RNA täielik ekstraheerimine, cDNA süntees ja qRT-PCR viidi läbi nagu kirjeldatud jaotises 3.2. Salitsüülhappe (SA), jasmoonhappe (JA) ja flavonoidide taset mõõdeti 15 infiltreeritud N. benthamiana lehes töötlemise kohta. Lehed koguti, külmutati vedelas lämmastikus ja säilitati -80 kraadi juures. Taimsete hormoonide kvantifitseerimiseks kasutati Plant Salicyclic Acid ja Plant Jasmonic Acid ELISA komplekte (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.) ja flavonoidid määrati Micro Plant Flavonoids Assay Kit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) abil. tootja juhised.

4.11. Statistiline analüüs

Andmeid analüüsiti SPSS v2-s0.0. Olulised erinevused MaCFEM85 ja MsWAK16 ekspressioonitasemetes määrati Studenti t-testi abil. Olulised erinevused SA, JA ja flavonoidide tasemetes määrati ühesuunalise ANOVA ja Duncani mitmevahemiku testi abil lävega p < 0,05.

5. Kokkuvõtted

Selles uuringus tuvastasime ja iseloomustasime M. anisopliae uudset sekreteeritud valku MaCFEM85. Leiti, et see on konserveerunud efektor, mis võib interakteeruda MsWAK16-ga ja aktiveerida N. benthamiana kaitsereaktsiooni. Näitasime, et CFEM domeen ja tsüsteiinijääk MaCFEM85 positsioonis 52 olid interaktsiooni jaoks kriitilised. See interaktsioon võib aktiveerida JA-ga seotud immuunvastuseid ning haigus- ja putukakindlaid mehhanisme taimes.

Viited

1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Bueno, MA; García, MB; Dardanelli, MS Taimede ja mikroobide partnerlus: mõju kasvule ja taimede tervisele. In Plant Microbe Symbiosis: Fundamentals and Advances; Springer: Berliin/Heidelberg, Saksamaa, 2013; lk 105–117. [CrossRef]

2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Taimede ja mikroobide interaktsioonide lahtiharutamine: kas mitme liigi transkriptoomika võib aidata? Trends Biotechnol. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]

3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Toidake oma sõpru: kas taimeeksudaadid kujundavad juuremikrobiomi? Trends Plant Sci. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]

4. Lugtenberg, B.; Kamilova, F. Taimekasvu soodustavad risobakterid. Annu. Rev. Microbiol. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]

5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Indutseeritud süsteemne resistentsus ja taimede vastused seente biotõrjevahenditele. Annu. Rev. Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]

6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Rhizobacterium Pseudomonas fluorescens SS101 poolt Arabidopsises indutseeritud metaboolsed ja transkriptoomilised muutused. Plant Physiol. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]

7. Lareen, A.; Burton, F.; Schafer, P. Taimejuure-mikroobi suhtlus juuremikrobioomide kujundamisel. Plant Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]

8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Putukate patogeenne seen Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) on samuti endofüüt, mis stimuleerib taimejuurte arengut. Olen. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]

9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Endofüütsete putukate patogeense seene Metarhizium robertsii antagonism oa taime patogeeni Fusarium solanif vastu. sp. phaseoli. Saab. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]

10. Ahmad, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii soodustab maisi kasvu, pärsib putukate kasvu ja muudab taimekaitsegeenide ekspressiooni. Biol. Kontroll 2020, 144, 104167. [CrossRef]

11. Chairin, T.; Petcharat, V. Metarhizium guizhouense kaitsereaktsioonide esilekutsumine Hongkongi puuviljades (Aglaia dookkoo Griff.) puuviljamädaniku seente vastu. Biol. Kontroll 2017, 111, 40–44. [CrossRef]

12. Hao, K.; Wang, F.; Nong, X.; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Maapähkli Arachis hypogaea juurte vastus kasulike ja patogeensete seente olemasolule transkriptoomianalüüsi abil. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]

13. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM 11. peatükk – seente esilekutsujate roll taimekaitsemehhanismis. In Molecular Aspects of Plant Beneficial Microbes in Agriculture; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., toim.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2020; lk 143–158. [CrossRef]

14. Dong, X.; Sa, JA Etüleen ja taimede haiguskindlus. Curr. Arvamus. Plant Biol. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]

15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Arabidopsises on eraldi jasmonaadist sõltuvad ja salitsülaadist sõltuvad kaitsereaktsioonirajad olulised resistentsuse tagamiseks erinevate mikroobsete patogeenide suhtes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]

16. Pant, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Fenüülalaniini ammoniaaklüaas (PAL) Soodustab viirusevastast kaitset Panicum mosaiikviiruse ja selle satelliitide vastu. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]

17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Astragalus membranaceus var. PAL geeni ekspressiooniprofiil. Mongholicus ja selle otsustav roll flavonoidide biosünteesi muutmisel. Plant Cell Rep. 2006, 25, 705–710. [CrossRef]

18. De Geyter, N.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Transkriptsioonimehhanismid jasmonaadi poolt esile kutsutud taimede sekundaarses metabolismis. Trends Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]

19. Mirjalili, N.; Linden, JC Gaasifaasi koostise mõjud Taxus cuspidata suspensioonikultuuridele. Biotehnoloogia. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [CrossRef]

20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Taxus chinensise rakkude transkriptsiooniprofiil vastuseks metüüljasmonaadile. BMC Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]

21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, ​​PA; Dubery, IA Metabolomikast pärinevad ülevaated terpenoidide sünteesi manipuleerimisest Centella asiatica rakkudes metüüljasmonaadi abil. Taimede biotehnoloogia. Vabariik 2015, 9, 125–136. [CrossRef]

22. Lu, M.; Wong, H.; Teng, W. Mõju esilekutsumiseks saponiini tootmisele Panaxi ženšenni rakukultuuris. Plant Cell Rep. 2001, 20, 674–677. [CrossRef]

23. Mandal, S.; Kar, I.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Elicitor-indutseeritud kaitsereaktsioonid Solanum lycopersicum'is Ralstonia solanacearum'i vastu. Sci. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]

24. Li, L.; Wang, S.; Yang, X.; Francis, F.; Qiu, D. Proteiini esilekutsuja PeaT1 suurendas resistentsust lehetäide (Sitobion avenae) vastu nisus. Pest Manag. Sci. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]

25. Bujalowski, W. Heksameerse DnaB helikaasi füsioloogilise rolli laiendamine. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]

26. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdansky, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Kolm Aspergillus fumigatus'e CFEM-domeeni GPI-ankurdatud valku (CfmA-C) mõjutavad rakuseina stabiilsust, kuid ei mängi seente virulentsuses rolli. Seeneline. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]

27. Zhao, S.; Shang, X.; Bi, W.; Yu, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Wang, X.; Wang, X. Genoomiga hõlmatud efektorkandidaatide identifitseerimine nisuleherooste seente Puccinia triticina konserveeritud motiividega. Esiosa. Microbiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]

28. Gong, A.; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q.; Wang, G.; Liu, W. CFEM-valkude bioinformaatiline analüüs ja funktsionaalne iseloomustus maisi antraknoosiseenes Colletotrichum graminicola. J. Integr. Põllumajandus. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]

29. Martin, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; et al. Laccaria bicolori genoom annab ülevaate mükoriisa sümbioosist. Loodus 2008, 452, 88–92. [CrossRef]

30. Stefan, V.; Lara, RJ Entomopatogeensed seened endofüütidena: taimede ja endofüütide ja herbivooride koostoimed ja väljavaated kasutamiseks bioloogilises tõrjes. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.

31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X.; Tu, X.; Zhang, Z.; Wang, G. Metarhizium anisopliae CFEM-valkude bioinformaatika analüüs ja funktsionaalne iseloomustus. J. Seened. 2022, 8, 661. [CrossRef]

32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; ja Kanyuka, K. WAKsing taime immuunsus, kahanevad haigused. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]

33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z.; Zou, CG Süstemaatilised analüüsid näitavad seente CFEM domeeni ainulaadsust ja päritolu. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]

34. Fang, A.; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Zhou, S.; Cui, F.; Sun, W. Uudne efektorgeen SCRE2 aitab kaasa Ustilaginoidea virensi täielikule virulentsusele riisile. Esiosa. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]

35. Zhu, W.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, X. BcCFEM1, CFEM domeeni sisaldav valk, millel on oletatav GPI-ga ankurdatud sait, osaleb Botrytis cinerea patogeensuses, koniidide tootmises ja stressitaluvuses. Esiosa. Microbiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]

36. Xu, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Pezizomycotina kuuluvate seente oletatavate Pth11--seotud G-valguga seotud retseptorite genoomi hõlmav võrdlev analüüs. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]

37. Peng, YJ; Hou, J.; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH CFEM-domeeni sisaldavate valkude süstemaatiline panus raua omandamisesse on filamentse patogeense seene Beauveria bassiana liikidevahelise interaktsiooni jaoks hädavajalik. Keskkond. Microbiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]

38. Roy, U.; Kornitzer, D. Heemi-raua omandamine seentes. Curr. Arvamus. Microbiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]

39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, Rbt5 valgu perekonda kuuluv liige, osaleb Candida albicansi hüüfi kasvu ajal inimese hemoglobiinist saadava raua kasutamises. FEMS Yeast Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]

40. Perez, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Casanova, M.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Biokile moodustumine Candida albicansi mutantide poolt geenide jaoks, mis kodeerivad kaheksa tsüsteiini sisaldavat CFEM domeeni. FEMS Yeast Res. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]

41. Hogg, PJ Disulfiidsidemed kui valgu funktsiooni lülitid. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]

42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R.; Woestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Tomatite patogeeni Cladosporium fulvum AVR4 looduslikud disulfiidsidemega mutandid on tundlikud proteolüüsi suhtes, väldivad Cf-4--vahendatud resistentsust, kuid säilitavad oma kitiini sidumisvõime. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Zhang, J.; Xia, F.; Võti.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; et al. Mitmete agronoomiliste tunnuste parandamine haigusresistentsuse geeni abil rakuseina tugevdamise kaudu. Nat. Plants 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]

44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; et al. Magnaporthe oryzae ulatuslik geenikatkestus tuvastab MC69, sekreteeritud valgu, mis on vajalik ühe- ja kaheiduleheliste seente patogeenidega nakatumiseks. PLoS patog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]

45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. Kaheksa tsüsteiini sisaldav CFEM domeen, mis on ainulaadne seente membraanivalkude rühmale. Trends Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Peng, J.; Wu, L.; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q.; Wang, X.; Li, X.; Yan, J. Lasiodiplodia theobromae seente rakuvälise membraani valkude süsteemne tuvastamine ja funktsionaalne iseloomustus. Esiosa. Plant Sci. 2021, 12, 804696. [CrossRef]

47. Bari, R.; Jones, JD Taimsete hormoonide roll taimekaitsereaktsioonides. Plant Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]

48. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP Taimsete hormoonide poolt vahendatud stressireaktsioonide reguleerimine. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]

49. Javed, K.; Qiu, D. Brevibacillus laterosporuse valgu esilekutsuja PeBL1 suurendab tomatite resistentsust Myzus persicae vastu. Pathogens 2020, 9, 57. [CrossRef]

50. Basit, A.; Hanan, A.; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Botrytis cinerea'st ekstraheeritud esilekutsuja PeBC1 molekulaarne ja funktsionaalne iseloomustus, mis on seotud resistentsuse esilekutsumisega rohelise virsiku lehetäi (Myzus persicae) vastu tavalistes ubades (Phaseolus vulgaris L.). Putukad 2019, 10, 35. [CrossRef]

51. Nazir, T.; Hanan, A.; Basit, A.; Majeed, MZ; Anwar, T.; Navaz, I.; Qiu, D. Veel iseloomustamata valgu esilekutsuja oletatav roll PeBb1 Tuletatud Beauveria bassiana ARSEF 2860 tüvest Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) vastu Brassica rapa ssp. pekinensis. Pathogens 2020, 9, 111. [CrossRef]

52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Classens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Mueller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Brown, R.; Kaasan, K.; et al. NPR1 moduleerib ristkõnet salitsülaadist ja jasmonaadist sõltuvate kaitseradade vahel läbi uudse funktsiooni tsütosoolis. Plant Cell 2003, 15, 760–770. [CrossRef]

53. Xin, XF; Tema, SY Pseudomonas syringae pv. tomat DC3000: mudelpatogeen taimede haigustele vastuvõtlikkuse ja hormoonide signaaliülekande tuvastamiseks. Annu. Rev. Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]

54. Zhang, X.; Wang, C.; Zhang, Y.; Sun, Y.; Mou, Z. Arabidopsise vahendaja kompleksi subühik16 reguleerib positiivselt salitsülaadi poolt vahendatud süsteemset omandatud resistentsust ja jasmonaadi/etüleeni poolt põhjustatud kaitseradasid. Plant Cell 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]

55. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Conconi, A.; Ryan, CA Salitsüülhape pärsib proteinaasi inhibiitorite sünteesi tomatilehtedes, mis on indutseeritud süsteemiini ja jasmoonhappe poolt. Plant Physiol. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]

56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC Väikemolekuliliste hormoonide võrgustik taimede immuunsuses. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]

57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Arabidopsises taime defensiini geeni indutseerimiseks on vajalik jasmonaadi ja etüleeni vastuseradade samaaegne aktiveerimine. Plant Cell 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]

58. Fang, W.; Bidochka, MJ Metarhizium anisopliae idanemise, konidiogeneesi ja patogeneesiga seotud geenide ekspressioon kvantitatiivse reaalajas RT-PCR abil. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]

59. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Lutsern Tselluloosi süntaasi geeni ekspressioon abiootilise stressi all: autostopi juhend RT-qPCR normaliseerimiseks. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]

60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong, Y.; Qiu, D. Verticillium dahliae pektaatlüaas kutsub esile taimede immuunvastuse ja soodustab virulentsust. Esiosa. Plant Sci. 2018, 9, 1271. [CrossRef]

61. Livak, KJ; Schmittgen, TD Suhteliste geeniekspressiooniandmete analüüs, kasutades reaalajas kvantitatiivset PCR-i ja 2(-Delta Delta C(T)) meetodit. Methods 2001, 25, 402–408. [CrossRef]