Soopõhise ATRX mutatsiooni seos naissoost maovähiga patsientidel, kellel on tugevdatud immunoteraapiaga seotud vähivastane immuunsus

Abstraktne

Taust:

Geneetilised muutused on osutunud paljulubavateks biomarkeriteks ICI vastuse jaoks. Immunoteraapia valdkonnas on aga geneetiliste muutuste soolisi eelarvamusi sageli ignoreeritud, mis võib eriti mõjutada vähivastast immuunsust ja immunoteraapia efektiivsust mees- või naispatsientidel. Siin oleme süstemaatiliselt hinnanud maovähi (GC) patsientide somaatiliste mutatsioonide soolise eelarvamuse mõju vähivastasele immuunsusele ja immunoteraapia kliinilisele kasule.

Immuunsüsteem on inimkeha jaoks oluline süsteem, mis suudab vastu seista haigustele. Kui immuunsus on madal, põhjustab see kergesti organismi vastupanuvõime langust haigustele, muutes selle vastuvõtlikuks erinevatele haigustele.

Seetõttu on immuunsuse tugevdamine hea tervise säilitamiseks väga oluline. Cistanche on asi, mis võib parandada immuunsust meie elus. Cistanche on rikas ehhinakosiidi ja verbaskosiidi poolest, mis mõlemad parandavad immuunsust. Cistanche võib tugevdada immuunsust ja aidata kehal paremini vastu seista väliste mikroobide sissetungile, tugevdades seeläbi organismi immuunsust.

Click cistanche deserticola toidulisand

Meetodid:

Maovähi genoomilised ja transkriptoomilised andmed laaditi alla vähigenoomi atlasest (TCGA) ja rahvusvahelisest vähigenoomi konsortsiumist (ICGC). Samuti saime cbioportaali andmebaasist MSKCC ICI-ga töödeldud kohordi genoomilised ja kliinilised andmed. GC meeste ja naiste kasvaja somaatiliste mutatsioonide profiile võrreldi maftools R paketiga. Vähivastase immuunsuse näitajate, sealhulgas IFN-i signaaliülekande, tsütolüütilise aktiivsuse (CYT) ja antigeeni esitleva masina (APM) skoori arvutamiseks viidi läbi ühe proovi geenikomplekti rikastamise analüüs (ssGSEA).

Tulemused:

Leiti, et ATRX muteerub GC naispatsientidel sagedamini kui meespatsientidel (FDR = 0.0108). ATRX mutatsiooniga naissoost GC patsientidel ilmnes oluliselt rohkem MSI kõrgeid alatüüpe, suurenenud TMB ja PDL1 ekspressioon, samuti kõrgemad IFN-signalisatsiooni, CYT ja APM skoorid. Geenikomplekti rikastamise analüüs (GSEA) on näidanud, et ATRX mutatsioon võib suurendada immunogeensust ja vähivastast immuunsust, mõjutades DNA kahjustuste parandamise teid.

MSKCC ICI-ga ravitud kohordis seostati ATRX mutatsiooniga GC patsiente pikema üldise elulemusega. Kogu ICI-ga ravitud kohorti soo järgi kihistamisel saavutasid ATRX mutatsiooniga naispatsiendid oluliselt parema ellujäämise kasu kui ATRX mutantidega meespatsiendid (naispatsiendid, ATRX MT vs WT HR=0.636, 95 protsenti CI { {5}}.455–0.890, P=0.023; Meespatsiendid, ATRX MT HR vs WT=0.929, 95 protsenti CI=0. 596–1.362, P=0.712).

Järeldused:

ATRX mutatsioon võib olla potentsiaalne ennustav biomarker, mis annab ICI-le soodsa kliinilise kasu naissoost GC patsientidel. ATRX mutatsiooni saab rakendada koos teiste ICI vastuse biomarkeritega, et paremini tuvastada naissoost GC patsiente, kes saavad ICI-ravist suuremat kasu.

Märksõnad:

Maovähk, soolised eelarvamused, ATRX mutatsioon, vähivastane immuunsus.

Taust

Maovähk (GC) on suur ülemaailmne terviseprobleem. Hiinas on GC suuruselt teine ​​kasvajatüüp ja põhjustas 2015. aastal 291 000 surmajuhtumit [1]. Kaugelearenenud GC praeguste ravivõimaluste tõhusus on piiratud ja nende patsientide üldine elulemus on endiselt halb. Immuunsuse kontrollpunkti inhibiitorite (ICI) esindatud tuumori immunoteraapia areng on muutnud soliidtuumorite ravi ja tõestanud tõhusust mõne pahaloomulise kasvaja puhul, nagu melanoom, mitteväikerakk-kopsuvähk, neerurakk-kartsinoom ja korduv lamerakk-kartsinoom. pea ja kael [2–5].

Kuigi ICI-d on näidanud julgustavat esialgset efektiivsust kaugelearenenud GC puhul, ei pruugi üldine vastus ICI-le olla nii märkimisväärne kui nende tahkete kasvajate puhul, nagu melanoom ja mitteväikerakk-kopsuvähk [6]. Seega on kohustuslikud täiendavad GC-uuringud täpsete biomarkerite väljatöötamiseks, mis suudavad ennustada reaktsiooni ICI-le.

Spetsiifilised somaatilised mutatsioonid, nagu TET1 mutatsioon, NOTCH mutatsioon ning TP53 ja KRAS arvutus, on osutunud paljulubavateks biomarkeriteks ICI vastuse jaoks [7–9]. Spetsiifiliste geneetiliste muutuste korral võivad aga immunoteraapia valdkonnas sageli ignoreeritud soolised eelarvamused esineda. Võrreldes somaatiliste mutatsioonide profiile meestel ja naistel esinevate kasvajate vahel paljudes vähitüüpides, on Li et al. on avastanud, et mutatsioonide tiheduses ja sageduses on suured soolised eelarvamused, mis võivad mõjutada prognostilist biomarkeri jõudlust [10]. Lisaks võib seks mõjutada ka immunoteraapia efektiivsust.

Näiteks Wu et al. on teatanud, et ravi ICI-ga pikendab kasvajaga meespatsientide, eriti CTLA-4 inhibiitoriga ravitud patsientide üldist elulemust ja progresseerumisvaba elulemust [11]. Conforti et al. tegi vastavalt kaks metaanalüüsi ja leidis, et meespatsiendid saavad ainult ICI-st rohkem kasu kui naispatsiendid, samas kui naised saavad ICI-st ja keemiaravist rohkem kliinilist kasu kui mehed [12, 13]. Need tõendid annavad hüpoteesi, et teatud soopõhised biomarkerid võivad olla sobivamad mees- või naispatsientidele.

Seetõttu püüdsime uurida, kas on olemas spetsiifilisi soolise eelarvamusega geenimutatsioone, mis mõjutaksid immunoteraapia efektiivsust nais- või meessoost GC-ga patsientidel. Selles uuringus hindasime süstemaatiliselt soolist dispersiooni GC somaatiliste mutatsioonide profiilides ja avastasime, et naissoost GC patsientidel sagedamini esinev ATRX mutatsioon oli seotud kõrgema TMB, suurenenud vähivastase immuunsuse ja soodsa kliinilise kasuga ICI-le.

meetodid

Andmeallikad

Laadisime TCGA-st alla 3. taseme RNA-seq andmed (n=375), vastavad kliinilised andmed (n=443) ja GC patsientide somaatiliste mutatsioonide profiili (n=433). Patsiendid, kellel polnud geeniekspressiooniprofiile, sooteavet ega mutatsiooniandmeid, jäeti välja. ICGC andmekogumitest laaditi alla ka Hiina ja Jaapani GC patsientide somaatilise mutatsiooni profiil (projekt: GACA-CN, n=123; GACA-JP; n ​​= 585). TCGA GC patsientide MSI staatuse andmed saadi eelmises uuringus [14]. ICI-ga töödeldud kohordi genoomi- ja ellujäämisandmed laaditi alla Samsteini et al. [15].

Somaatiliste mutatsioonide analüüs

Somaatiliste mutatsioonide andmeid analüüsiti paketiga maftools R [16]. Mees- ja naissoost GC patsientide mutatsiooniprofiile võrreldi mafComapre funktsiooni abil. Testisime ainult ühes rühmas vähemalt 5 proovis muteerunud geene. Vale avastamise määra (FDR) 0,05 peeti olulisuse piirväärtuseks.

PolyPhen{{0}} (Polymorphism Phenotyping v2) on tarkvaratööriist, mis suudab hinnata missense-mutatsioonist põhjustatud valgu struktuuri kahjustuste tõenäosust [17]. Kasutasime tarkvara Polyphen{3}}, et hinnata veelgi mutatsiooni mõju valgu struktuurile. Tuginedes lõplikule skoorile, milles hinnati missense mutatsiooni mõju valgu struktuurile, määrati läviväärtus 0, 69, et jagada missense mutatsioon healoomuliseks missense mutatsiooniks või kahjulikuks missense mutatsiooniks.

Kasvaja mutatsioonikoormuse (TMB) kvantifitseerimine

TMB hindamiseks kasutati TCGA ja ICGC poolt määratud somaatilisi variante. Eksoomi piirkonna suuruseks määrati 38 Mb. TMB hindamisest jäeti välja sünonüümsed mutatsioonid ja variandid intergeensetes või mittekodeerivates piirkondades. Nagu eelmises uuringus [18] kirjeldatud, arvutati iga proovi TMB skoor loendatud mutatsioonide koguarvu jagatuna eksoomi piirkonna suurusega.

Tsütolüütilise aktiivsuse (CYT) skoori hindamine

TGCA-st kogutud FPKM-vormingus geeniekspressiooniandmed kanti esmalt transkriptidesse miljoni kohta (TPM). Seejärel teisendati TPM väärtused log2. CYT skoori kirjeldati kui GZMA ja PRF1 ekspressiooniväärtuste geomeetrilist keskmist TPM-is [19].

Kasvajatesse infiltreeruvate immuunrakkude hindamine CIBERSORTiga

CIBERSORT on dekonvolutsioonitööriist, mis suudab täpselt hinnata inimese leukotsüütide alamhulkade arvukust kasvaja biopsias [20]. Immuunrakkude proportsioonide hindamiseks GC-s kasutasime meetodit CIBERSORT ja geenisignatuuri LM22 (valideeritud leukotsüütide geeni allkirjamaatriks, mis sisaldab 22 funktsionaalselt määratletud inimese vereloome alamrühma). Kriteeriumil P < 0,05 peeti CIBERSORTi immuunrakkude koostise tulemusi täpseks.

Ühe proovi geenikomplekti rikastamise analüüs (GSA)

SsGSEA meetod arvutab geenikomplekti rikastamise skoori proovi kohta, võrreldes geenide loendis olevate geenide auastmeid kõigi teiste transkriptoomi geenide auastmetega [21]. Me kasutasime seda lähenemisviisi IFN-i signaaliülekande ja antigeeni esitlemise masinate (APM) arvutuslikuks hindamiseks [22, 23]. Oleme kasutanud eelnevalt määratletud 7 geeni APM signatuuri, mis koosnes MHC I klassi geenidest ja geenidest, mis on seotud antigeenide töötlemise ja laadimisega. IFN-i signaaliülekanne hinnati KEYNOTE-012 [6] ja KEYNOTE-059 [24] täiustatud GC kahe kliinilise uuringu geenikomplekti abil. SsGSEA meetod rakendati GSVA R paketis [25]. Geenide loendit kuvati täiendavas failis 1.

Geenikomplekti rikastamise analüüs

Geenikomplekti rikastamise analüüsi (GSEA) rakendas javaGSEA rakendus (versioon 4.{1}}.3). GSEA-d kasutati ATRX mutatsiooni olekuga seotud võtmeradade tuvastamiseks. Annoteeritud geenikomplektid (c2.cp. Kegg.v7.1.symbols.gmt) GSEA jaoks valiti võrdlusgeenikomplektideks. Lävikriteeriumideks loeti FDR < 0.25 ja P < 0.05.

Statistiline analüüs

Rühmade ellujäämise erinevuste hindamiseks viidi läbi Kaplan-Meieri analüüsi log-rank test. Alarühmade erinevuste hindamiseks kasutati Wilcoxi testi või Kruskal-Wallise testi post hoc paarikaupa Bonferroni korrektsiooniga. Kliiniliste tunnuste jaotuse võrdlemiseks rühmade vahel kasutati hii-ruudu testi või Fisheri täpset testi. Sõltumatu prognostilise väärtusega tegurite tuvastamiseks viidi läbi ühe- ja mitmemõõtmelised Coxi regressioonianalüüsid. Lõppkriteeriumiks valiti P < 0,05.

Kõik statistilised analüüsid viidi läbi tarkvaraga R (versioon 3.6.2). Boksploti ja histogrammi joonised valmistas GraphPad Prism (versioon 8.0.1).

Tulemused

Somaatilised variatsioonid meeste ja naiste GC patsientidel

Esmalt võrdlesime TCGA kohorti somaatiliste mutatsioonide sagedust nais- ja meessoost GC patsientide vahel. Huvitaval kombel leiti, et pärast valede avastamise määra (FDR=0.0108) kohandamist esines naispatsientidel oluliselt rohkem ainult ATRX mutatsiooni kui meespatsientidel (joonis 1a).

Ühe kohordi põhjustatud juhuslike eelarvamuste vältimiseks kontrollisime täiendavalt ATRX mutatsiooni soolisi eelarvamusi GACA-CN ja GACA-JP kohortide puhul. ATRX-i mutatsioonisagedus GACA-CN-is ja GACA-JP-s oli vastavalt 31,7 protsenti (39/123) ja 6,3 protsenti (37/585). ATRX mutatsiooniga naispatsientide osakaal GACA-CN-is (naised 40,5 protsenti vs meessoost 27,9 protsenti, Fisheri täpne test, P=0.206) ja GACA-JP (naised 11,0 protsenti vs. meessoost 4,3 protsenti, Fisheri täpne test, P=0,004) olid mõlemad kõrgemad kui meespatsientidel (joonis 1b).

Seejärel püüdsime uurida, kas ATRX mutatsiooni soolisi erinevusi võib leida teistest ICGC vähiprojektidest. Jätsime välja soopiiranguga kasvajad ja vähiprojektid, mille ATRX mutatsiooni sagedus oli alla 5 protsendi. Tähelepanuväärne on see, et pooltel vähiprojektidest (50 protsenti, 17/34) ilmnes ATRX mutatsioonis olulisi soolisi erinevusi (joonis 1c, lisafail 2). Enamikus vähiprojektides (88,2 protsenti, 30/34) oli ATRX mutatsioonisagedus naispatsientidel kõrgem kui meespatsientidel, kuigi erinevus mõne vähiprojekti puhul ei näidanud statistilist olulisust. Lisaks hindasime tarkvara PolyPhen{11}} abil ATRX missense mutatsiooni võimalikku mõju valgu struktuurile. Naispatsientide kahjulikud missense mutatsioonid olid TGCA kohordis igasuguste ATRX mutatsioonide hulgas ülekaalus (lisafail 3). Üldiselt näitavad need tulemused, et ATRX mutatsioonil maovähiga patsientidel võib esineda soolisi eelarvamusi.

Korrelatsioon ATRX mutatsiooni ja kliiniliste tunnuste vahel

Esmalt võrdlesime kliiniliste tunnuste jaotust ATRX mutanditüüpi ja metsiktüüpi patsientide vahel (tabel 1). Märkimisväärne on see, et suurem osa ATRX-i mutantidest patsientidest olid mikrosatelliidi ebastabiilsusega (MSI-H) kasvajad võrreldes ATRX metsiktüüpi patsientidega (joonis 2a). Seejärel uurisime, kas ATRX mutatsioon võib mõjutada GC patsientide üldist elulemust. Kaplan-Meieri analüüsi log-rank test näitas, et ATRX mutantidega patsientidel oli üldine elulemus parem kui metsikutel patsientidel (joonis 2b). GACA-CN patsientide Kaplan-Meieri analüüs näitas samuti sarnast tulemust (joonis 2c).

Lisaks uurisime ATRX mutatsioonist saadava ellujäämise kasu paremaks hindamiseks TCGA andmebaasis täiendavalt ATRX mutatsiooni mõju prognoosi tulemustele mitte-GC kohortide puhul. Oleme valinud mitte-maovähi kohordid, mille ATRX mutatsiooni sagedus on üle 10 protsendi, sealhulgas LGG (39,2 protsenti), UCEC (24,3 protsenti), SARC (16,9 protsenti), GBM (10,4 protsenti), CESC (10,4 protsenti), COAD (10,3 protsenti). Samamoodi leidsime, et ATRX mutatsioon UCEC-ga patsientidel oli seotud ka pikema üldise elulemusega (lisafail 4). Lõpuks hindasime ATRX mutatsiooni mõju ATRX ekspressioonile. Leidsime, et ATRX mutantsete kasvajate ATRX ekspressioon oli madalam, kuigi erinevus ei avaldanud statistilist olulisust (joonis 2d). Kokkuvõttes korreleerus ATRX mutatsioon oluliselt MHS-H alatüübi ja parema elulemusega GC patsientidel.

ATRX mutatsioon on seotud suurenenud kasvaja mutatsioonikoormuse ja PDL1 kõrgema ekspressiooniga

Kasvaja mutatsioonikoormus (TMB) ja PDL1 ekspressioon olid kaks tavalist immunoteraapia vastuse ennustamise näitajat. Arvutasime iga GC patsiendi TMB vastavalt TCGA, GACA-CN ja GACA-JP põhjal. Nagu on näidatud joonisel 3a, täheldati kõrgemat TMB-d ATRX mutantse GC patsientidel TCGA kohordist (mediaan TMB 16,61 vs 2,526, P < 0.0001), GACA-CN (mediaan TMB 1,974 vs 1,211, P=0,0001) ja GACA-JP (mediaan TMB 27,82 vs 2,421, P < 0,0001). Seejärel võrdlesime PDL1 ekspressiooni ATRX mutatsiooniga või ilma GC patsientide vahel TCGA kohordis. ATRX mutantidega patsientidel oli PDL1 ekspressioon kõrgem (mediaanekspressioon 2,027 vs 1,098, P=0,0244) kui metsikutel patsientidel (joonis 3b).

Arvestades võimalikke soolisi erinevusi ATRX mutatsioonis, uurime täiendavalt ATRX mutatsiooni korrelatsiooni TMB ja PDL1 ekspressiooniga, mis on kihistunud soo järgi (Sub1: ATRX mutatsiooniga naispatsiendid; Sub2: naispatsiendid, kellel puudub ATRX mutatsioon; Sub3: ATRX mutatsiooniga meespatsiendid; Sub4: ATRX mutatsioonita meespatsiendid). GACA-CN ja GACA-JP kohortides oli nii ATRX mutatsiooniga nais- kui meespatsientidel kõrgem TMB kui ATRX metsiktüüpi patsientidel (joonis 3c). Kuid TCGA kohortide puhul näitasid ainult ATRX-i mutant-tüüpi naispatsiendid kõrgemat TMB-d kui teistel ATRX-mutatsioonita patsientidel. TMB-s ei ole ATRX-mutatsiooniga või ilma selleta meespatsientide vahel olulist erinevust. Lisaks ei täheldatud kolmes kohordis olulisi erinevusi ATRX mutatsiooniga nais- ja meespatsientide vahel. Võrreldes PDL1 ekspressiooni nelja alarühma vahel TCGA kohordis, leidsime, et PDL1 ekspressioon ATRX mutantsetel naispatsientidel oli kõrgem kui ATRX mutatsioonita patsientidel (joonis 3d).

Üldiselt näitasid need tulemused, et ATRX mutatsiooniga patsiendid, eriti naissoost GC patsiendid, olid märkimisväärselt seotud kõrgema TMB ja PDL1 ekspressiooniga.

ATRX mutatsiooniga naissoost GC patsientidel on suurenenud vähivastane immuunsus

Iseloomustamiseks kasutasime mitmeid tõestatud immunoteraapiaga seotud tegureid, sealhulgas tsütolüütilist aktiivsust (CYT) [26], IFN-i signaaliülekannet [6], antigeeni esitlevat masinat (APM) [27] ja kasvajasse infiltreeruvaid immuunrakke [28]. vähivastane immuunsus. Oleme kasutanud ssGSEA meetodit, et uurida ATRX mutatsiooni seost vähivastase immuunsusega. Kuigi ATRX mutatsiooniga patsientide vähivastase immuunsuse skoorid olid kõrgemad kui ATRX mutatsioonita patsientidel, ei olnud erinevus statistiliselt oluline (joonis 4a).

Siiski, hinnates ATRX mutatsiooni mõju vähivastasele immuunsusele soo järgi, leidsime, et ATRX mutatsiooniga naispatsientidel oli immunoteraapiaga seotud tegurite skoor oluliselt suurem kui ATRX mutatsioonita patsientidel (joonis 4b). ATRX mutantsete ja metsikute meespatsientide vähivastase immuunsuse skoorides ei olnud olulisi erinevusi. Lisaks näitasid ATRX mutatsiooniga naispatsiendid immunoteraapiaga seotud näitajaid kõrgemaid tulemusi kui ATRX mutantsed meespatsiendid.

Lõpuks kasutasime meetodit CIBERSORT, et uurida infiltreeruvate immuunrakkude osakaalu ATRX mutantsete naispatsientide (Sub1), ATRX metsikute naispatsientide (Sub2), ATRX mutantsete meespatsientide (Sub3) ja ATRX metsikute meespatsientide (Sub4) hulgas. T-folliikulite abistajarakud, M1 makrofaagid ja aktiveeritud dendriitrakud olid ATRX mutatsiooniga naispatsientidel oluliselt rikastatud, samas kui puhkeolekus olevate dendriitrakkude osakaal oli oluliselt väiksem kui teistel patsientidel (joonis 4c). T-folliikulite abistajarakud, M1 makrofaagid ja aktiveeritud dendriitrakud on seotud antigeeni esitlemismasinatega, mis oli kooskõlas ATRX mutatsiooniga naispatsientide suurenenud APM-iga.

Kokkuvõtteks võib öelda, et ATRX mutatsiooniga naissoost GC patsientidel oli tugevam vähivastane immuunsus kui ATRX metsikutel patsientidel või mutantsetel meespatsientidel. Ülaltoodud tulemust toetas ka T-folliikulite abistajarakkude, M1 makrofaagide ja aktiveeritud dendriitrakkude rikastamine ATRX mutantsetel naispatsientidel.

ATRX mutatsiooni mõju vähivastasele immuunsusele naispatsientidel ei mõjuta soopõhine immuunsuse heterogeensus

Et uurida, kas ATRX mutatsiooni mõju vähivastasele immuunsusele naispatsientidel oli tingitud soopõhisest immuunsüsteemi heterogeensusest, võrdlesime ülaltoodud vähivastaseid immuunsustegureid mees- ja naispatsientide vahel. Ainult TMB näitas soolisi erinevusi ja naispatsientidel oli TMB kõrgem kui meespatsientidel (lisafail 5). Kuid naiste ja meeste TMB erinevused kadusid, kui välistasime ATRX mutatsiooniga naiste proovid (lisafail 5). Need tulemused näitasid, et soopõhine immuunsuse heterogeensus ei mõjutanud ATRX mutantsete naispatsientide suurenenud vähivastast immuunsust.

ATRX mutatsiooni sõltumatu prognostiline analüüs

Esmalt viisime läbi Kaplan-Meieri analüüsi, et määrata ülaltoodud immunoteraapiaga seotud tegurite prognostilised väärtused. TMB ja PDL1 ekspressioon jagati X-tile tööriista põhjal kõrgeteks ja madalateks rühmadeks. Nagu on näidatud joonisel 5, avaldas TMB ja PDL1 ekspressioon mõju patsientide ellujäämisele. TMB ja PDL1 kõrge rühm tähendas paremat tulemust. Seejärel lisasime järgnevasse analüüsi TMB ja PDL1 ekspressiooni, et uurida ATRX mutatsiooni sõltumatut prognostilist väärtust. Ühe- ja mitmemõõtmelised Coxi regressioonianalüüsid näitasid, et ATRX mutatsioon oli sõltumatu prognostiline tegur (tabel 2).

ATRX mutatsiooni mõju DNA kahjustuste parandamisele

Tegime GSEA-d, et analüüsida ATRX mutatsiooni funktsionaalset konteksti. KEGG raja analüüs näitas, et ATRX mutatsioon oli peamiselt rikastatud aluse ekstsisiooni parandamise (BER), nukleotiidide ekstsisiooni parandamise (NER) ja homoloogse rekombinatsiooni parandamisega (HRR) (joonis 6a). ATRX mutatsiooni bioloogiline funktsioon oli märkimisväärselt seotud DNA kahjustuste parandamisega (DDR). Seejärel kasutasime ssGSEA-d, et iseloomustada BER, NER ja HRR rada ATRX mutantide ja metsikute patsientide vahel. Nagu on näidatud joonisel 6b, BER (mediaanskoor 0,8734 vs 0,7909, P=0.{{10}} 002), NER (mediaanskoor 0,4333 vs 0,3605, P = 0,044) ja HRR (mediaanskoor 0,7618 vs 0,6898, P = 0,0098) olid ATRX mutandiga oluliselt rikastatud patsiendid. Lisaks jätkasime ATRX mutatsiooni mõju uurimist soo järgi kihistatud BER, NER ja HRR radadele. Ainult ATRX mutatsiooniga naispatsientidel oli BER, NER ja HRR kõrgem kui teistel ATRX mutatsioonita patsientidel (joonis 6c).

Lisaks valisime nendes kolmes rajas rikastatud põhigeenid, et uurida ekspressioonierinevusi ATRX mutantide ja metsikute patsientide vahel. Huvitav on see, et enamik tuumgeene ekspresseerisid ATRX-i mutant-tüüpi patsientidel tugevalt võrreldes metsiktüüpi patsientide omadega (joonis 6d). Pärast soolist kihistumist olid nende DDR-iga seotud tuumgeenide ekspressioonitasemed kõrgemad ka ATRX mutatsiooniga nais- ja meespatsientide alarühmades kui kahes teises metsikut tüüpi alarühmas (lisafail 6).

Kokkuvõttes tähendasid need tulemused DDR-i radade võimalikku aktiveerimist ATRX-i mutantidega patsientidel. Kõrgem TMB ja DDR-süsteemi aktiveerimine võivad viidata ägeda mutageneesi ja vastava kompenseeriva DDR-i aktiveerimise tõenäosusele ATRX mutantidega patsientidel.

ATRX mutatsiooni seostatakse soodsa kliinilise kasuga ICI-le

Et uurida, kas ATRX mutatsiooniga patsiendid võiksid ICI-st kasu saada, saime cbioportaali andmebaasist MSKCC ICItreated kohordi avalikult kättesaadavad genoomilised ja ellujäämise andmed [15]. MSKC C ICI-ga ravitud kohort sisaldab 1610 erinevat tüüpi vähiga patsienti mutatsiooniandmetega, sealhulgas 54 maovähiga patsienti. ATRX-i mutatsioonisagedus mao- või gastroösofageaalse vähiga patsientidel on 7,41 protsenti (4/54). Me täheldasime, et ATRX mutatsiooniga patsientidel oli TMB kõrgem kui ATRX metsiktüüpi patsientidel (joonis 7a). Maovähiga patsientidel oli ATRX mutatsiooniga patsientide üldine elulemus pikem (mediaan, ei saavutatud vs 13 kuud, log-rank P=0.194) (joonis 7b).

Sarnaselt oli ka ATRX mutatsiooniga patsientide üldine elulemus terves kohordis parem kui ATRX metsikutel patsientidel (mediaan, 30 kuud vs 18 kuud, log-rank P=0,075) ( joonis 7b). Seejärel jagasime kogu kohordi kahte rühma (naised ja mehed) ja võrdlesime üldist elulemust ATRX mutatsiooni staatuse vahel. Huvitav on see, et ainult ATRX mutatsiooniga naispatsiendid saavutasid metsikut tüüpi naispatsientidega võrreldes oluliselt pikema üldise elulemuse (mediaan, 30 kuud vs 14 kuud, log-rank P=0,023) (joonis 7c). Lisaks võrdlesime ATRX mutatsiooni ennustusvõimet mees- ja naispatsientidel. ATRX-i mutantse tüübi ja metsiktüübi HR naispatsientide puhul (HR=0.636, 95 protsenti CI=0.455–0,890, P=0.023) on parem kui HR meespatsiendid (HR=0,929, 95 protsenti CI = 0.596–1,362, P=0,7117) (joonis 7c).

Need andmed viitasid ühiselt sellele, et ATRX mutatsioon, eriti naispatsientidel, oli seotud ICI-ravi soodsa kliinilise kasuga.

Arutelu

Selles uuringus tuvastasime mees- ja naissoost GC patsientidelt saadud somaatiliste mutatsioonide profiilide võrdlemise kaudu esimest korda, et ATRX mutatsioon esines eelistatavalt naissoost GC patsientidel ja oli seotud kõrgema TMB-ga, suurenenud vähivastase immuunsusega ja soodsa kliinilise kasuga ICI-le. .

ATRX on kasvaja supressorgeen ja kodeerib SWI/SNF valkude perekonna liiget. Näidati, et ATRX on seotud DNA kahjustuste parandamisega [29], geneetilise stabiilsuse säilitamisega [30], sobiva DNA replikatsiooni hõlbustamisega [31] ja spetsiifiliste geenide ekspressiooni mõjutamisega [32]. ATRX mutatsioon on glioomide tavalised geneetilised kõrvalekalded.

IDH-metsiktüüpi glioomide korral oli ATRX mutatsioonide olemasolu patsiendi pikema elulemuse soodsaks markeriks [33]. ATRX-i kadumine kahjustas mittehomoloogset lõppliitmisaktiivsust ja suurendas MSI-d glioblastoomi korral, muutes suurema tundlikkuse DNA-d kahjustavate ainete suhtes [34]. Han et al. teatas, et ATRX võib reguleerida DNA kahjustuste parandamist, moduleerides ATM-i rada ja suurendades tundlikkust temosolomiidi suhtes glioomi korral [35]. Meie uuringus täheldati ATRX mutatsiooniga naispatsientidel kõrgemat TMB-d ja DNA kahjustuste parandamise radade aktiveerimist. TMB tuleneb mutatsiooni ja DNA parandamise vastasseisust. Need tulemused näitasid, et kompenseeriva DNA kahjustuse parandamise funktsioon võib olla nõrgem kui ATRX mutatsiooniga ägedam mutagenees. Oleme oletanud, et ATRX mutatsioon naissoost GC-patsientidel võib mõjutada sellega seotud DNA kahjustuste paranemist, mis põhjustab kõrgemat TMB-d ja vastavat suurenenud vähivastast immuunsust. Sellegipoolest vajab ATRX-i mutatsiooni täpne mehhanism vähivastase immuunsuse reguleerimisel naissoost GC-patsientidel täiendavaid uuringuid.

Olemasolevad teadlased on teatanud ATRX-i soolisest eelarvamusest. Young et al. on avastanud, et emastel hiirtel, kellel puudus kõhunäärmes ATRX, ilmnes ainult suurenenud tundlikkus vigastuste ja muteerunud KRAS-i onkogeense toime suhtes, samas kui ATRX-ita isased hiired olid kaitstud [36]. Samamoodi avastasime ka, et ATRX mutatsiooniga naispatsientidel oli suurenenud immunogeensus, eriti tugevam vähivastane immuunsus kui ATRX mutantsed meespatsiendid, mis võib osaliselt olla tingitud suurenenud tundlikkusest DNA kahjustuste suhtes ATRX mutantsete naispatsientidel. Dunford et al. on teatanud, et osa chrX-is olevatest kasvaja supressorgeenidest (sealhulgas ATRX) võib embrüogeneesi ajal inaktivatsioonist pääseda, mis viib nende geenide bialleelse ekspressioonini ja suurendab naistel vähikaitset [37]. See uuring võib selgitada tulemust, et ATRX-i mutatsiooniga naissoost GC-patsientidel ATRX-i ekspressioon ei vähenenud, kuigi ATRX-i mutantsete naispatsientide puhul olid ülekaalus kärbitud ja kahjulikud missense-mutatsioonid.

Lisaks soolistele erinevustele mees- ja naispatsientide immunogeensuses esinesid ka soolised erinevused ATRX mutatsiooni toimimises ICI prognoosimisel. Kuigi ICI-ga ravitud ATRX mutatsiooniga patsientidel täheldati pikemat üldist elulemust, oli ATRX mutatsiooni ennustusvõime naispatsientide puhul parem kui meessoost patsientidel. ATRX mutatsiooniga naispatsiendid saavutasid ICI-ravist oluliselt suurema elulemuse. Wang et al. on teatanud ka sarnasest tulemusest, et TMB näitas paremat ennustamisvõimet ICI vastuses naissoost NSCLC patsientidel kui meespatsientidel [38]. ICI biomarkerite edasine arendamine ja rakendamine peaks arvestama soolisi erinevusi.

Sellel uuringul on mitmeid piiranguid. Esiteks on ATRX üldine mutatsioonisagedus GC patsientidel suhteliselt madal, eriti meessoost GC patsientide puhul. Lisaks saime transkriptsiooniandmed ainult ühest kohordist. Need piirangud võivad mõjutada nais- ja meespatsientide vähivastase immuunsuse võrdluse tugevust. Teiseks on ATRX mutatsiooni sagedus erinevates populatsioonides erinev.

Meie uuringus oli ATRX mutatsiooni sagedus kolmes GC kohordis erinev (31,7 protsenti GACA-CN kohordis, 6,3 protsenti GACA-JP kohordis ja 5,3 protsenti TCGA kohordis). Lisaks oli GACA-CN-is ATRX mutatsiooniga naispatsientide osakaal (40,5 protsenti) palju suurem kui kahes teises kohordis (12,3 protsenti TCGA kohordis ja 11,0 protsenti GACA-JP kohordis). . ATRX mutatsiooni sageduse erinevus erinevates populatsioonides võib kuidagi piirata ATRX mutatsiooni kasutamist soodsa prognoosi biomarkerina. Kolmandaks tõestas meie analüüs ainult ATRX mutatsiooni seost TMB-ga, vähivastast immuunsust ja ICI-ravi efektiivsust. ATRX-i mutatsiooni võimalik mehhanism ICI-ravis, eriti meespatsientide puhul, vajab veel täiendavat uurimist. Lõpuks oleks parem võrrelda nais- ja meessoost GC patsientide ellujäämise eeliseid pärast ICI-ravi, mis võib otseselt kinnitada ATRX mutatsiooni soolisi erinevusi immunoteraapiaga seotud vähivastases immuunsuses. Siiski ei õnnestunud meil võrdlust teha, kuna MSKCC ICI-ga ravitud kohordis oli ATRX mutantse GC patsientide valim piiratud.

Seetõttu püüdsime esialgselt uurida, kas ATRX mutatsioonist tulenevad ellujäämise eelised võivad olla soolised erinevused, võrreldes nais- ja meespatsientide ATRX mutatsiooni prognoositulemuste erinevusi erinevate vähitüüpide vahel kogu kohordis. Kuigi ICI-ravist täheldati suuremat ellujäämise kasu ATRX-mutatsiooniga naispatsientidel erinevate vähitüüpide puhul, võivad need andmed GC-patsientide kohta tehtud järeldustega liialdada. Siin on vaja rohkem ICI-ga töödeldud kohorte, mis sisaldavad suuremaid ATRX-i mutantsete GC patsientide valimeid, et kinnitada soolisi erinevusi ellujäämise eelistes.

Järeldused

Kokkuvõttes leiti meie uuringus, et naissoost GC patsientidel eelistatavalt muteeriv ATRX oli seotud suurenenud immunogeensuse, suurenenud vähivastase immuunsuse ja soodsa kliinilise kasuga ICI-le. Mutatsioonide sageduse, vähivastase immuunsuse ja kliiniliste eeliste soolised erinevused viitasid sellele, et ATRX mutatsioon võib olla sobivam ICI-le soodsa kliinilise kasu ennustajana naissoost GC-ga patsientidel. ATRX mutatsiooni saab kombineerida teiste ICI vastuse biomarkeritega, et paremini tuvastada naissoost GC patsiente, kes saavad immunoteraapiast suuremat kasu. Kuid meie tulemuste kinnitamiseks ja ATRX mutatsiooni väärtuse hindamiseks meespatsientidel on vaja täiendavaid kliinilisi uuringuid.

Lühendid

GC: maovähk; ICI: Immuunsuse kontrollpunkti inhibiitorid; TCGA: vähi genoomi atlas; ICGC: International Cancer Genome Consortium; FDR: valede avastamise määr; TMB: kasvaja mutatsioonikoormus; CYT: tsütolüütiline aktiivsus; APM: antigeeni esitlemise masinad; GSEA: geenikomplekti rikastamise analüüs; ssGSEA: ühe proovi geenikomplekti rikastamise analüüs; MSI: mikrosatelliidi ebastabiilsus; BER: Aluse väljalõikamise remont; NER: nukleotiidide ekstsisiooni parandamine; HRR: homoloogse rekombinatsiooni parandamine; DDR: DNA kahjustuste parandamine.

Tänuavaldused

Täname TCGA ja ICGC projekte genoomikaandmete analüüsi jaoks kättesaadavaks tegemise eest. Täname ka autoreid, kes esitasid cbioportaali hoidlas ICI-ga töödeldud kohordi genoomi- ja ellujäämisandmed.

Autorite kaastööd

Uuringu kontseptsioon ja disain: YG ja PMW. Andmekogumite kogumine: YG, GPD, XSL, GQF ja JJC. Andmete analüüs ja tõlgendamine: YG, FRW ja WL. Käsikirja kirjutamine, läbivaatamine ja läbivaatamine: YG, FRW ja PMW. Õppetöö juhendamine: PMW. Kõik autorid lugesid lõpliku käsikirja läbi ja kiitsid selle heaks.

Rahastamine

Seda tööd toetas Hiina haridusministeeriumi humanitaar- ja sotsiaalteaduste planeerimise fond (NR 16YJA840014).

Deklaratsioonid

Eetiline kinnitus ja nõusolek osaleda

See uuring põhines avalikult kättesaadavatel andmetel TCGA, UCSC Xena ja cbioportaali hoidlast, selle uuringu läbiviimiseks ei olnud luba vaja. See uuring ei hõlmanud inimeste isendeid ega isikut tuvastava teabe kasutamist. Kõik selles uuringus kasutatud andmed olid identifitseerimata ja avalikult kättesaadavad, eetilist heakskiitu polnud vaja.

Nõusolek avaldamiseks

Ei kohaldata.

Konkureerivad huvid

Autorid ei kinnita huvide konflikti.

Autori üksikasjad

1 Epidemioloogia ja tervisestatistika osakond, Kaguülikooli rahvatervise kool, 87 Dingjiaqiao Road, Nanjing 210009, Jiangsu, Hiina. 2 Hematoloogia ja onkoloogia osakond, Zhongda haigla, meditsiinikool, Kagu ülikool, Nanjing, Hiina. 3 Southeast University Hospital, Nanjing, Hiina. 4 Nanjingi meditsiiniülikooli Wuxi rahvahaigla kopsusiirdamise keskuse osakond, Wuxi, Jiangsu, Hiina.

Saadud:

26. oktoober 2020 Vastuvõetud: 25. veebruar 2021.

Viited

1. Zheng RS, Sun KX, Zhang SW, Zeng HM, Zou XN, Chen R jt. Hiina vähi epidemioloogia aruanne, 2015. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 2019; 41(1):19–28.

2. Robert C, Schachter J, Long GV, Arance A, Grob JJ, Mortier L jt. Pembrolizumab versus ipilimumab kaugelearenenud melanoomi korral. N Engl J Med. 2015;372(26):2521–32.

3. Garon EB, Rizvi NA, Hui R, Leigl N, Balmanoukian AS, Eder JP jt. Pembrolizumab mitteväikerakk-kopsuvähi raviks. N Engl J Med. 2015;372(21):2018–28.

4. Motzer RJ, Escudier B, McDermott DF, George S, Hammers HJ, Srinivas S jt. Nivolumab versus everoliimus kaugelearenenud neerurakulise kartsinoomi korral. N Engl J Med. 2015;373(19):1803–13.

5. Ferris RL, Blumenschein G Jr, Fayette J, Guigay J, Colevas AD, Licitra L jt. Nivolumab pea- ja kaelapiirkonna korduva lamerakk-kartsinoomi raviks. N Engl J Med. 2016;375(19):1856–67.

6. Muro K, Chung HC, Shankaran V, Geva R, Catenacci D, Gupta S jt. Pembrolizumab PD-L1-positiivse kaugelearenenud maovähiga patsientidele (KEYNOTE-012): mitmekeskuseline avatud 1b faasi uuring. Lancet Oncol. 2016; 17(6):717–26.

7. Dong ZY, Zhong WZ, Zhang XC, Su J, Xie Z, Liu SY jt. TP53 ja KRAS mutatsiooni staatuse potentsiaalne ennustav väärtus vastuseks PD-1 blokaadi immunoteraapiale kopsu adenokartsinoomi korral. Clin Cancer Res. 2017; 23(12):3012–24.

8. Wu HX, Chen YX, Wang ZX, Zhao Q, He MM, Wang YN jt. TET1 muutumine potentsiaalse biomarkerina immuunkontrollpunkti blokeerimiseks mitme vähi korral. J Immuunsusvähk. 2019;7(1):264.

9. Zhang K, Hong X, Song Z, Xu Y. Kahjuliku NOTCH-mutatsiooni tuvastamine kui uudne ennustaja tõhusale immunoteraapiale NSCLC korral. Clin Cancer Res. 2020;26(14):3649–61.

10. Li CH, Haider S, Shiah YJ, Thai K, Boutros PC. Soolised erinevused vähijuhi geenides ja biomarkerites. Cancer Res. 2018;78(19):5527–37.

11. Wu Y, Ju Q, Jia K, Yu J, Shi H, Wu H jt. Korrelatsioon soo ja immuunsüsteemi kontrollpunkti inhibiitorite (PD-1 ja CTLA-4 inhibiitorite) efektiivsuse vahel. Int J Vähk. 2018;143(1):45–51.

12. Conforti F, Pala L, Bagnardi V, De Pas T, Martinetti M, Viale G jt. Vähi immunoteraapia efektiivsus ja patsientide sugu: süstemaatiline ülevaade ja metaanalüüs. Lancet Oncol. 2018;19(6):737–46.

13. Conforti F, Pala L, Bagnardi V, Viale G, De Pas T, Pagan E jt. Soopõhine heterogeensus vastuseks kopsuvähi immunoteraapiale: süstemaatiline ülevaade ja metaanalüüs. J Natl Cancer Inst. 2019;111(8):772–81.

14. Liu Y, Sethi NS, Hinoue T, Schneider BG, Cherniack AD, Sanchez-Vega F jt. Seedetrakti adenokartsinoomide võrdlev molekulaarne analüüs. Vähirakk. 2018;33(4):721–735.e728.

15. Samstein RM, Lee CH, Shoushtari AN. Kasvaja mutatsioonikoormus ennustab ellujäämist pärast immunoteraapiat mitme vähitüübi korral. Nat Genet. 2019; 51(2):202–6.

16. Mayakonda A, Lin DC, Assenov Y, Plass C, Koeffler HP. Maftools: tõhus ja põhjalik vähi somaatiliste variantide analüüs. Genome Res. 2018; 28(11):1747–56.

17. Adžubei IA, Schmidt S, Peshkin L, Ramensky VE, Gerasimova A, Bork P jt. Meetod ja server kahjustavate missense mutatsioonide ennustamiseks. Nat meetodid. 2010;7(4):248–9.

18. Chalmers ZR, Connelly CF, Fabrizio D, Gay L, Ali SM, Ennis R jt. 100,000 inimese vähigenoomi analüüs paljastab kasvaja mutatsioonikoormuse maastiku. Genome Med. 2017;9(1):34.

19. Narayanan S, Kawaguchi T, Yan L, Peng X, Qi Q, Takabe K. Tsütolüütilise aktiivsuse skoor vähivastase immuunsuse hindamiseks kolorektaalse vähi korral. Ann Surg Oncol. 2018;25(8):2323–31.

20. Newman AM, Liu CL, Green MR. Rakkude alamhulkade täpne loendamine koeekspressiooniprofiilidest. Nat meetodid. 2015;12(5):453–7.

21. Barbie DA, Tamayo P, Boehm JS, Kim SY, Moody SE, Dunn IF jt. Süstemaatiline RNA interferents näitab, et onkogeensed KRAS-i juhitud vähid nõuavad TBK1. Loodus. 2009;462(7269):108–12.

22. Şenbabaoğlu Y, Gejman RS, Winer AG, Liu M, Van Allen EM, de Velasco G jt. Kasvaja immuunmikrokeskkonna iseloomustus selge rakulise neerurakulise kartsinoomi korral tuvastab prognostilised ja immunoterapeutilised liitlastega seotud messenger RNA signatuurid. Genome Biol. 2016;17(1):231.

23. Mandal R, Şenbabaoğlu Y, Desrichard A, Havel JJ, Dalin MG, Riaz N jt. Pea- ja kaelavähi immuunmaastik ja selle immunoterapeutilised tagajärjed. JCI Insight. 2016;1(17):e89829.

24. Fuchs CS, Doi T, Jang RW, Muro K, Satoh T, Machado M jt. Pembrolizumabi monoteraapia ohutus ja efektiivsus patsientidel, kellel on varem ravitud kaugelearenenud mao- ja gastroösofageaalse ristmiku vähiga: 2. faasi kliiniline KEYNOTE-059 uuring. JAMA Oncol. 2018;4(5):e180013.

25. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinform. 2013;14:7.

26. Rooney MS, Shukla SA, Wu CJ, Getz G, Hacohen N. Kohaliku immuuntsütolüütilise aktiivsusega seotud kasvajate molekulaarsed ja geneetilised omadused. Kamber. 2015;160(1–2):48–61.

27. Zaretsky JM, Garcia-Diaz A, Shin DS, Escuin-Ordinas H, Hugo W, HuLieskovan S jt. Mutatsioonid, mis on seotud omandatud resistentsusega PD-1 blokaadi suhtes melanoomi korral. N Engl J Med. 2016;375(9):819–29.

28. Li B, Severson E, Pignon JC, Zhao H, Li T, Novak J jt. Kasvaja immuunsuse põhjalikud analüüsid: mõju vähi immunoteraapiale. Genome Biol. 2016;17(1):174.

29. Juhász S, Elbakry A, Mathes A, Löbrich M. ATRX soodustab DNA parandamise sünteesi ja sõsarkromatiidide vahetust homoloogse rekombinatsiooni käigus. Mol Cell. 2018;71(1):11–24.e17.

30. Lovejoy CA, Li W, Reisenweber S, Thongthip S, Bruno J, de Lange T jt. ATRX-i kadu, genoomi ebastabiilsus ja muutunud DNA kahjustusreaktsioon on telomeeride raja alternatiivse pikenemise tunnused. PLoS Genet. 2012;8(7):e1002772.

31. Clynes D, Jelinska C, Xella B, Ayyub H, Taylor S, Mitson M jt. ATRX düsfunktsioon kutsub esile replikatsioonidefektid primaarsetes hiirerakkudes. PLoS One. 2014;9(3):e92915. 32. Levy MA, Kernohan KD, Jiang Y, Bérubé NG. ATRX soodustab geeniekspressiooni, hõlbustades transkriptsiooni pikenemist guaniinirikaste kodeerivate piirkondade kaudu. Hum Mol Genet. 2015;24(7):1824–35.

33. Pekmezci M, Rice T, Molinaro AM, Walsh KM, Decker PA, Hansen H jt. Täiskasvanute infiltreeruvad glioomid WHO 2016 integreeritud diagnoosiga: ATRX ja TERT täiendavad prognostilised rollid. Acta Neuropathol. 2017;133(6):1001–16.

34. Koschmann C, Calinescu AA, Nunez FJ, Mackay A, Fazal-Salom J, Thomas D jt. ATRX-i kadu soodustab kasvaja kasvu ja kahjustab mittehomoloogset lõpp-liituvat DNA parandamist glioomi korral. Sci Transl Med. 2016;8(328):328ra328.

35. Han B, Cai J, Gao W, Meng X, Gao F, Wu P jt. ATRX-i kadumine pärsib ATM-st sõltuvat DNA kahjustuse paranemist, moduleerides H3K9me3, et suurendada glioomi temosolomiidi tundlikkust. Cancer Lett. 2018;419:280–90.

36. Young CC, Baker RM, Howlett CJ, Hryciw T, Herman JE, Higgs D jt. ATRX-i kadumine suurendab vastuvõtlikkust pankrease vigastustele ja onkogeensele KRAS-ile emastel, kuid mitte isastel hiirtel. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2019; 7(1):93–113.

37. Dunford A, Weinstock DM, Savova V, Schumacher SE, Cleary JP, Yoda A jt. Kasvaja supressorgeenid, mis põgenevad X-inaktiveerimisest, aitavad kaasa vähi soolisele eelarvamusele. Nat Genet. 2017;49(1):10–6.

38. Wang S, Zhang J, He Z, Wu K, Liu XS. Kasvaja mutatsioonikoormuse ennustavat jõudu kopsuvähi immunoteraapia vastuses mõjutab patsientide sugu. Int J Vähk. 2019;145(10):2840–9.

Väljaandja märkus

Springer Nature jääb avaldatud kaartide ja institutsionaalsete seoste suhtes erapooletuks.

You Ge1 , Feiran Wei2 , Guoping Du3 , Gaoqiang Fei1 , Wei Li1 , Xiaoshan Li4 , Jinjin Chu1 ja Pingmin Wei1*.

For more information:1950477648nn@gmail.com