Katepsiini B sihtimine tsükloastragenooliga suurendab CD8 T-rakkude kasvajavastast immuunsust MHC-I lagunemise inhibeerimise kaudu. 1. osa

ABSTRAKTNE

TaustKasvaja antigeenide kadu ja CD8 T-rakkude ammendumine, mis on põhjustatud PD-1/PD-L1 rajast, on olulised tegurid kasvaja immuunsüsteemi põgenemisel. Viimastel aastatel on üha rohkem uuritud traditsioonilist Hiina meditsiini kasvajate ravis. On leitud, et tsükloastragenoolil (CAG), mis on Astragalus membranaceus'e tõhus aktiivne molekul, on viirusevastane, vananemisvastane, põletikuvastane ja muud funktsioonid. Selle kasvajavastane toime ja mehhanism pole aga selged.

Tistanche glükosiid võib samuti suurendada SOD aktiivsust südame- ja maksakudedes ning oluliselt vähendada lipofustsiini ja MDA sisaldust igas koes, eemaldades tõhusalt erinevaid reaktiivseid hapnikuradikaale (OH-, H2O₂ jne) ja kaitstes tekitatud DNA kahjustuste eest. OH-radikaalide poolt. Tsistanche fenüületanoidglükosiididel on tugev vabade radikaalide eemaldamisvõime, suurem redutseerimisvõime kui C-vitamiinil, nad parandavad SOD aktiivsust sperma suspensioonis, vähendavad MDA sisaldust ja omavad teatud kaitset sperma membraani funktsioonile. Tsistanche polüsahhariidid võivad suurendada SOD ja GSH-Px aktiivsust D-galaktoosi poolt põhjustatud eksperimentaalselt vananevate hiirte erütrotsüütides ja kopsukudedes, samuti vähendada MDA ja kollageeni sisaldust kopsudes ja plasmas ning suurendada elastiini sisaldust. hea puhastav toime DPPH-le, pikendab hüpoksia aega vananevatel hiirtel, parandab SOD aktiivsust seerumis ja aeglustab eksperimentaalselt vananevatel hiirtel kopsude füsioloogilist degeneratsiooni Raku morfoloogilise degeneratsiooniga on katsed näidanud, et Cistanche'il on hea antioksüdantne võime ja sellel on potentsiaal olla ravim naha vananemishaiguste ennetamiseks ja raviks. Samal ajal on Cistanche ehhinakosiidil märkimisväärne võime eemaldada DPPH vabu radikaale ja see suudab eemaldada reaktiivseid hapniku liike ja takistada vabade radikaalide poolt indutseeritud kollageeni lagunemist, samuti on sellel hea parandav toime tümiini vabade radikaalide anioonide kahjustustele.

Klõpsake cistanche plusse ja miinuseid

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

meetodidCAG kasvajavastast toimet uuriti MC38 ja CT26 hiire siirdatud kasvaja mudelites. CAG kasvajavastast toimet analüüsiti täiendavalt üherakulise multi-omika järjestuse abil. CAG sihtvalgu leidmiseks kasutati sihtmärgile reageerivat juurdepääsetavuse profiilide koostamise tehnoloogiat. Seejärel uuriti CAG kasvajavastast mehhanismi konfokaalse mikroskoopia, immunosadestamise ja mutantsete plasmiidide transfektsiooni abil. Lõpuks uuriti CAG ja PD-1 antikehade kombineeritud kasvajavastast toimet hiirtel või organoididel.

TulemusedLeidsime, et CAG inhibeeris tõhusalt kasvaja kasvu in vivo. Meie üherakuline multi-omika atlas näitas, et CAG soodustas kasvajarakkude pinnaantigeenide esitlemist ja seda iseloomustas CD8 pluss T-rakkude tõhustatud tapmisfunktsioon. Mehaaniliselt seostus CAG oma sihtvalgu katepsiin B-ga, mis seejärel pärssis peamise histo-ühilduvuskompleksi I (MHC-I) lüsosomaalset lagunemist ja viis MHC-I agregaadi n rakumembraanile, suurendades kasvaja antigeeni eeljaama. . Samal ajal suurendas CAG-i kombinatsioon PD-1-antikehaga tõhusalt tuumorit tapavaid CD8- ja T-rakke ksenotransplantaadiga hiirtel ja kolorektaalse vähi organoididel. Kokkuvõte Meie andmed teatasid esimest korda, et katepsiin B alareguleerimine annab kasvajavastase immuunsuse ja aeglustab loodusliku toote CAG kasvajavastast mehhanismi.

SISSEJUHATUS

Kolorektaalne vähk on üks levinumaid vähktõbe maailmas. Selle esinemissagedus ja suremus on esikolmikus, ohustades tõsiselt inimeste elu ja tervist.1 Levinud ravimeetodid hõlmavad kirurgilist keemia- ja kiiritusravi, sihipäraseid ravimeid ja immunoteraapiat.2–4 Kuid vähirakkudel on tavaliselt pinnaantigeenide kadu ja nende ekspressioon. inhibeerivate molekulide kõrge tase, et pääseda immuunrakkude järelevalve alt. Seetõttu on teadlased kasvaja immuunsüsteemi põgenemise probleemi lahendamiseks välja töötanud immuunkontrollpunkti inhibiitorid ja neoantigeenteraapia, et blokeerida vähirakkude maskeerumist immuunrakkudeks.5–8 Kuigi immuunsüsteemi kontrollpunkti inhibiitorid võivad taastada ammendunud immuunrakud, vähi pinnaantigeen. rakke ei ole oluliselt immutatud. Seetõttu on eriti oluline leida ravimid, mis võivad soodustada kasvaja pinnaantigeenide esitlemist. Vähirakkude äratundmine tsütotoksiliste CD8 pluss T-rakkude poolt sõltub TCR/CD3/major histocompatibility complex (MHC-I) rajast. TCR võtab vastu dendriitraku/vähiraku membraanivalgu CI sisalduva antigeeni ja edastab signaali CD3 tihedaks ühendamiseks, mis seejärel ulatub sügavamale tsütoplasmasse.{10}} Samal ajal CD28/B7 signaali aktiveerimisega CD8 pluss T-rakke saab koosaktiveerida vähirakkude äratundmiseks ja tapmiseks.11 Hiljutised uuringud on leidnud, et kasvaja progresseerumise protsessis põhjustavad lüsosoomid MHC-I agregatsiooni vähenemist vähirakkude pinnal, mis ei toimi tõhusalt. esinevad antigeenid.12 13 Liu jt teatasid, et PCSK9 inhibeerimine võib takistada MHC-I lagunemist lüsosoomides ja võimaldada MHC-I-l naasta rakumembraanile, et esitada antigeene.12 Seetõttu taastatakse antigeeni esitlemise funktsioon. MHC-I on eriti oluline kasvaja immuunsüsteemi põgenemise blokeerimiseks.

Üha enam uuringuid on leidnud, et traditsioonilise hiina meditsiini aktiivsete molekulide rakendamisel kasvajavastases sekkumises on suured väljavaated.{0}} Tsükloastragenool (CAG) on Astragalus membranaceus'e tõhus aktiivne molekul, millel on viirusevastane, antibakteriaalne ja antibakteriaalne toime. põletikulised ja muud farmakoloogilised toimed, kuid selle kasvajavastast toimet on teatatud harva.16–19 Selles uuringus avastasime, et CAG inhibeeris käärsoolevähi kasvajate transmissioonituumorite kasvu. Mehhanism hõlmas peamiselt MHC-I lagunemise pärssimist, mida vahendas katepsiin B (CTSB), soodustades vähirakkude antigeeni esitlust ja suurendades seejärel CD8 pluss T-rakkude tapmisvõimet.

MATERJALID JA MEETODID

Antikehad ja reaktiivid

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 protsenti). CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426), aktiini (Katnr{{) antikehad 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), tubuliin (Kat.nr osteti Proteintechilt. H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853) antikehad, ja CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) osteti ettevõttelt Santa Cruz Biotechnology. Antikeha Ki-67 (kat. nr 12202, PRID: AB_2620142) osteti ettevõttelt Cell Signaling Technology. Na/K ATPaasi antikeha (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) osteti ettevõttelt Abcam. CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003) ja CD{ voolutsütomeetria antikehad {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802) osteti ettevõttelt BD Bioscience. Gzmb-FITC voolutsütomeetria antikeha (kat. nr 515403, RRID: AB_2114575) osteti ettevõttelt BioLegend. NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) ja IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID) voolutsütomeetria antikehad :AB_466192) osteti ettevõttelt Thermo Fisher Scientific. DMEM-i sööde (Kat.nr Kitse seerum (Cat#88RNG001) ja Pierce BCA valguanalüüsi komplekt (Cat#23225) osteti firmalt Thermo Fisher Scientific. Inimese PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) ja hiirevastase PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) antikehad osteti ettevõttest Bio X cell. MACS Tumor Tissue Dissotsiatsiooni komplekt (Cat #130-095-929) osteti ettevõttelt Miltenyi Biotec.

Rakukultuur

Hiire käärsoolevähi rakuliine MC38 ja CT26 hoiti meie laboris.20 Inimese käärsoolevähi l liinid HCT-116 saadi Hiina Teaduste Akadeemia tüübikultuuride kollektsioonist (Shanghai, Hiina). MC38, CT26 ja HCT-116 rakke kultiveeriti DMEM söötmes, mis sisaldas 10 protsenti veise loote seerumit ja 1 protsenti penitsilliini/streptomütsiini 37 kraadi juures 5 protsenti CO2 inkubaatoris.

Kasvaja siirdamise eksperiment

Kuue kaheksa nädala vanused emased C57BL/6JGpt hiired, BALB/c hiired ja BALB/,c nude hiired osteti firmalt GemPharmatech (Nanjing, Hiina). MC38 või CT26 vähirakud (1 × 106) inokuleeriti subkutaanselt igasse hiiresse. Kui kasvaja kasvab 100 mm3-ni, jagati mikrofon juhuslikult fosfaatpuhverdatud soolalahuse (PBS) rühma (nt üks kord päevas) ja CAG rühma (nt 50 mg/kg üks kord päevas). Kasvaja mahud määrati nihikuga, kasutades valemit V=pikkus × laius2 /2. Kui PBS-rühma hiirte kasvaja maht jõudis 1000 mm3-ni, võeti hiirte kasvaja välja, pildistati ja kaaluti.

Üherakuline dissotsiatsioon hiirest üherakulise RNA/ATACseq jaoks

Hiirte tahked kasvajad seediti, kasutades tuumori dissotsiatsioonikomplekti, et saada üksikrakulised üksikrakud. Single celSingle-cell s kontsentratsiooniga 1000 rakku/1000 rakku, mis on laaditud 10× genoomika kroomi kontrollerile üherakulised üksikrakud, järgides 10× genoomika tootja protokolli. Pöördtranskriptsioonireagendid, vöötkoodiga geelhelmed ja jaotusõli segati geeni rakkudega, et genereerida pöördtranskriptsiooniks emulsioonides geelhelmed (GEM). scRNA-seq andmete eeltöötlus ja qua y kontroll.

Põhineb hiire referentsgenoomil GRCm38 (mm10), CellRanger V.4.0.0 konveier (10×Genomics) üherakulise RNA töötlemiseks järjestuse andmed iga katse kohta (GSE197229). Digitaalsed geeniekspressiooni maatriksid määrati R-s (V.4.{13}}.4), kasutades Seurat (V.4.0.0) paketti.21 Enne dBeforem analüüsi filtreeriti rakud UMI numbri järgi (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq andmete eeltöötlus ja kvaliteedikontroll

Üksiku lahtri ATAC-seq andmed (GSE197229) eeltöötleti lahtri ranger-at (V.2.0.0) käsurea abil. Järgneva scATAC-seq andmetöötluse ja analüüsi jaoks kasutasime ArchR (V.1.0.1) paketti.24 Seejärel kasutasime genoomi annotatsiooniks funktsiooni addArchRGethe nome ('mm10') ja loosime noolefail funktsiooniga cre ArrowFiles vaikeparameetritega. Järgmisena kasutasime potentsiaalsete duplettide kustutamiseks funktsiooni filterDoublets ja lõime ArchR projekti, kasutades funktsiooni ArchRProject vaikeparameetritega. Seejärel kasutasime paketti Harmony, et eemaldada pakkefekti funktsiooni addHarmony abil.25 Mõõtmete vähendamiseks kasutame ArchR-is funktsiooni addIterativeLSI, et käitada def t parameetritega. Ühelahtri manustamiseks valisime redutseeritudDims-objekti harmooniaga ja kasutasime visualiseerimiseks funktsiooni addTSNE parameetriga „perplexity=30”.

SiRNA-seq ja scATAC-seq andmete integreeritud analüüs

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Prognooside täpsuse parandamiseks kahe andmekogumi paremaks integreerimiseks integreerisime taas kord scATAC-seq ja scRNA-seq andmed, kasutades režiimi "piiratud integreerimine". Lühidalt, me märkisime scATAC-seq andmed rakutüüpidega, mis põhinesid scATAC-seq geeniskooridel. Seejärel koostasime piiratud loendi, nii et geeniekspressiooni sarnasus arvutati ainult samas rakutüübis nii scATAC-seq kui ka scRNA-seq jaoks. Järelevalveta rühmitamine t-SNE-ga näitas 13 alamraku klastrit, millele lisati veebipõhises tabelis 1 teadaolevad või oletatavad markerid.

Pseudoaja liini trajektoor

Vähirakkude rakuliini trajektoor tuletati Monocle2 (V.2.18.0) R paketi abil.26 Monotsüüdid õpivad selgesõnalise põhigraafiku üheraku genoomikaandmetest rakkude sorteerimiseks Reversed Graph Embedding abil, lahendades nii keerulised Bioloogilised protsessid jõuliselt ja täpselt.27 Me kasutasime igast klastrist DEG tuletamiseks funktsiooni "differentialGeneTest" ja pärast raku trajektoori konstrueerimist tuvastasime pseudoaja jooksul erinevalt ekspresseeritud geenid. Kõik pseudoajast sõltuvad geenid visualiseeriti diagrammi _pseudotime_soojuskaardi funktsiooniga, võttes CellDataSeti objekti. CellDataSetil põhinevad liini trajektoori graafikud ja sujuvad ekspressioonikõverad genereeriti vastavalt plot_cell_trajektoori ja plot{13}}geenidega_pseudoajas_.28

Ühe lahtri koopia numbri variatsiooni helistamine

Klonaalsete suuremahuliste kromosomaalsete koopiate arvu variatsioonidega (CNV) pahaloomuliste rakkude tuvastamiseks kasutasime inferCNV R paketti, et järeldada iga raku geneetilised profiilid, mis põhinevad suurte geenikomplektide keskmisel ekspressioonil kasvaja genoomi igas kromosomaalses piirkonnas, võrreldes normaalsed rakud.29 Valimipõhiselt kasutati immuunrakke võrdlusena vähiga seotud rakkude CNV-de hindamiseks.

Rikastamise analüüs

KEGG raja ja GO annotatsiooni analüüsid viidi läbi, kasutades R-paketti clusterProfiler (V.3.11.1) parameetritega PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 ja MaxGSSize=500.20 geenikomplekti rikastamise analüüsi (GSEA) rakendati 50 tunnusmärgi geenikomplekti (h.all.V.7.4.symbols. gmt) abil, et tuvastada oluliselt rikastatud. funktsionaalsed rajad GSEA tarkvara (V.4.1.0) kaudu nominaalse P-väärtuse sõelumiskriteeriumidega<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Kvantitatiivne reaalajas PCR analüüs

MC38 ja HCT-116 rakud külvati kuue süvendiga plaatidele 6 tunniks ja seejärel töödeldi CAG-ga veel 24 tundi. Rakke pesti kolm korda külma PBS-ga ja tsentrifuugiti 180g juures 5 minutit 4 kraadi juures. Samal ajal pärast kasvajakoe peenestamist. Kogu RNA ekstraheeriti MC38, HCT-116 rakkudest ja kasvajakoest, kasutades TRIzol reagenti vastavalt tootja juhistele. Reaktsiooni maht oli 20 µL, mis sisaldas: 1 µg RNA-d, 5 µL 5×Hiscript III qRT SuperMixi ja RNaasivaba dH2O. cDNA-le viidi läbi kvantitatiivne PCR reaktsioonimahuga 10 µL koos 1 µL cDNA-ga, 5 µL 0,5 µL qP7 sM segu (edasi ja tagurpidi) ja 3,25 µL RNaasi-vaba dH2O. Praimerid sünteesis GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Hiina) vastavalt järgmistele järjestustele (veebipõhine lisatabel 2).

Sihtmärgi avastamine sihtmärgile reageeriva juurdepääsetavuse profiilide koostamise lähenemisviisi kaudu

CAG-d siduvate valkude sõelumine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud.{1}} Lühidalt, sihtmärgile reageeriva ligipääsetavuse profileerimise (TRAP) meetodit kasutati CAG-ga seonduvate valkude avastamiseks rakukeskkonnas, jälgides ligandi seotusest põhjustatud lüsiini. juurdepääsetavus muutub proteoomi tasemel. Lühidalt, kahte tassi rakke töödeldi vastavalt 10µM CAG ja dimetüülsulfoksiidiga (DMSO). Pärast 1-tunnist inkubeerimist muudeti rakud läbilaskvaks M-PER puhvriga (Thermo Scientific) ja saadud lüsaadid märgistati kovalentselt formaldehüüdi ja boraanpüridiini kompleksi lisamisega, mis koos märgistavad ligipääsetavuse profileerimiseks toatemperatuuril valgulisi lüsiinijääke. . Seejärel sadestati lüsaadid orgaanilise lahustiga ja kogutud graanulid lahustati uuesti 8 mol/l uureas, redutseeriti ditiotreitooliga (DTT) 56 kraadi juures 30 minutit, millele järgnes alküülimine jodoatseetamiidiga (IAA) pimedas 30 minutit. Lisati uuesti sobiv kogus DTT lahust, et reageerida IAA liiaga. Seejärel lahjendati proteoomi ammooniumvesinikkarbonaadi lahusega, kuni karbamiidi lõppkontsentratsioon saavutas 1 mol/l. Kogutud valgulõigud eemaldati sooladest C18 HLB kolonnidel (Waters, Milford, Massachusetts, USA) ning rikastatud peptiidid kuivatati ja taastati 0,1-protsendilises sipelghappe (FA) vesilahuses. AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF süsteemi (Waters) kasutati proovide analüüsimiseks lüsiini ligipääsetavuse muutuste kvantitatiivseks profileerimiseks vastuseks CAG-i seondumisele sihtmärgi tuvastamiseks. Andmete kogumiseks kasutati positiivses režiimis andmete sõltuvust. Andmete analüüs viidi läbi kasutades PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Kanada). Täpsemalt, tsüs-alküülimine valiti fikseeritud modifikatsiooniks ning metioniini oksüdatsioon ja lüsiini dimetüülimine, mis saavutati TRAP-märgistusega, määrati muutuvateks modifikatsioonideks. Lühidalt, sihtmärgile reageerivateks peptiidideks määrati peptiidid, mis sisaldavad TRAP-indutseeritud dimetüülimist ja näitasid olulisi arvukuse muutusi koos CAG-i inkubeerimisega ja ilma. Iga TRAP-märgistatud peptiidi arvukuse suhe näitab ligipääsetavuse muutuse ulatust ja on tihedalt seotud ligandi sidumisafiinsusega. Studenti t-test viidi läbi, et hinnata, kas märgistatud peptiidide avastatud juurdepääsetavuse muutused on statistiliselt olulised. Rühmadevaheline p-väärtus (lk<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Organoidne kultuur

Inimese kolorektaalse vähi organoidid konstrueeris ja kultiveeris Chongqing Kingbiotech.33 Kirurgilise operatsiooni käigus saadud patsiendi koeproovid hakiti steriilsete kääridega võimalikult väikesteks tükkideks. Koetükid segati jääl põhjalikult Matrigeliga (Corning, Cat#356231) ligikaudu vahekorras 1:4. Edasine töötlemine viitas avaldatud protokollidele. Lühidalt, tükid-Matrigeli suspensioonid külvati kiiresti mitme süvendiga plaadile, moodustades poolkerakujulised tilgad, ja viidi 15–20 minutiks 37 kraadini, võimaldades tilkadel tahkuda. Lisati igasse süvendisse sobiv kogus söödet (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​ja vahetati söödet iga 2–4 ​​päeva järel.

Inimese CD8 T-rakkude eraldamine ja kasvatamine

Tervete inimeste perifeersesse verre, mis sisaldab antikoagulante, lisage täisvere lahjendamiseks sama kogus tavalist soolalahust. Lisage teatud kogus eralduslahust 15 ml tsentrifuugiklaasi, lisage aeglaselt lahjendatud täisveri piki katsuti seina eralduslahuse ülaossa ja tsentrifuugige 750 g juures 20 minutit. Pärast tsentrifuugimist imege keskmise valge kihi monotsüüdid pipetiga ettevaatlikult 15 ml tsentrifuugituubi, lisage resuspendeerimiseks teatud kogus PBS-i, tsentrifuugige 250 g 5 minutit ja visake supernatant ära. Pärast inimese CD8 magnethelmeste lisamist rakusademetele sorteeriti CD8 T-rakud LS sorteerimiskolonni abil. CD8 T-rakud lisati perforeeritud plaadile, mis oli eelnevalt kaetud 5 µg/ml CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) antikehaga ja seejärel 10 ng/ml IL{15} Lisati } (Peprotech Cat# 212-12) ja 5 µg/ml CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) funktsionaalsed antikehad, mida kasvatati 24 tundi.

Kokultuur

Pärast organoidide 24-tunnist inkubeerimist CAG-ga asendati värske sööde ning seejärel suspendeeriti organoidid ja aktiveeritud CD8 T-rakud maatriksgeelis, seejärel lisati suspensioon kuue süvendiga plaadile ja asetati 37 kraadi inkubaatoris 15 minutit ja seejärel lisati 24 tunniks 2 ml seerumivaba täielikku söödet.

Western blot

MC38 ja HCT-116 rakud külvati kuue süvendiga plaatidele 6 tunniks ja seejärel töödeldi CAG-ga veel 24 tundi. Rakke pesti kolm korda külma PBS-ga ja tsentrifuugiti 180 g juures 5 minutit 4 kraadi juures. Kogu valk lüüsiti WB-IP lüüsiga, mis sisaldas 1 protsenti proteaasi inhibiitorit 30 minutit jääl. Kogu valgusisaldust hinnati BCA valgu kvantifitseerimiskomplekti abil. Valguproovid eraldati 10–12-protsendilise SDS-polüakrüülamiidi geelelektroforeesiga ja kanti PVDF (polüvinülideenfluoriid) membraanidele 350 mA juures 90 minutiks. PVDF membraane blokeeriti 5% BSA-ga 1 tund, ribasid näidatud primaarse antikehaga üleöö ja sekundaarse antikehaga inkubeeriti 90 minutit toatemperatuuril. Lõpuks tuvastati ribad LumiGLO kemoluminestseeruva substraadisüsteemi abil (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).

Voolutsütomeetria

Pärast kasvajakoe seedimist valmistati üherakuline suspensioon. Pinna värvimine viidi läbi pinnaantigeeni antikehadega FCM (Flow Cytometry) puhvris (PBS, mis sisaldas 1 protsenti FBS-i) ja värviti jääl sobivate antikehadega 30 minutit. Surnud rakkude eemaldamiseks kasutati reaktiivseid värvaineid (eBioscience). Intratsellulaarne tsütokiinide värvimine viidi läbi BD raku fikseeriva lahuse / rakuvälise membraani lahusega ning rakud fikseeriti ja immutati ning seejärel värviti tsütokiinide vastaste antikehadega Perm/Wash puhvris (BD Biosciences).

Transfekteeritud CTSB mutantsed plasmiidid

HCT-116 rakud külvati 6-süvendiga plaatidele 12 tunniks ja seejärel transfekteeriti CTSB-WT-EGFP või CTSB mutantsete plasmiididega (Y75A, A77V ja G198A) 36 tundi.

CTSB transfektsioonihäired või üleekspressioon MC38 rakkudesse või HCT-116 rakkudesse

MC38 rakke (1 × 106 süvendi kohta) inokuleeriti 6-süvendiga plaatidele 6 tunniks, seejärel transfekteeriti CTSB-d segava RNA-ga (järjestus: edasi-GGACAUAGAUCUACCUGAATT ja tagurpidi-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) 48 tundi ning mRNA või valgu ekspressioonitasemed tuvastati Ctsb ja H2-k1. HCT-116 rakke (1 × 106 süvendi kohta) inokuleeriti 6-süvendi plaatidel 6 tundi, seejärel transfekteeriti CTSB interferentsiga (järjestus: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) või üleekspressiooniplasmiidiga 48 tundi ja mRNA-ga või tuvastati CTSB ja HLA-A valgu ekspressioonitasemed.

Dokkimistehnoloogia

CTSB 3D-struktuur laaditi alla valguandmebaasist (PDB ID: 2iPP) ja CAG-i struktuurid laaditi alla PubChemist. Dokkimisprotsess viidi läbi Autodock 2-s jämeda dokkimisega, kasutades simuleeritud lõõmutamisalgoritmi ja sellele järgnevat täpsustamist geneetilise algoritmi abil.

Raku termilise nihke test

MC38 rakud külvati 10 cm plaatidele üleöö ja seejärel töödeldi CAG-ga või 0,1% DMSO-ga veel 2 tundi. Rakud koguti, pesti külma PBS-ga ja tsentrifuugiti 180 g juures 5 minutit. Seejärel jaotati rakud ühtlaselt tsentrifuugimistorudesse (iga katsuti 70 µL) ja kuumutati 3 minutit järgmisel temperatuuril: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 ja 67 kraadi, proove jahutati 3 minutit temperatuuril ja siis hoiti jääl. Seejärel asetati proovid ööseks külmkappi temperatuurile -80 kraadi. Proove sulatati toatemperatuuril 30 minutit ja seejärel jahutati -80 kraadi juures 4 tundi. Lõpuks tsentrifuugiti proove 12, 000g juures 25 minutit, supernatant lisati laadimispuhvrisse ja analüüsiti Western blot meetodil.

Immunohistokeemiline värvimine

Kasvajakoe parafiinilõigud sukeldati vaha eemaldamiseks 20 minutiks ksüleeni ja seejärel 10 minutiks 100-protsendilisse, 75-protsendilisse ja 50-protsendilisse etanooli. Pärast viiludele antigeeni parandamist naatriumtsitraadi antigeeni parandamise lahusega inaktiveeriti endogeenne vesinikperoksiid 3-protsendilise vesinikperoksiidiga. Pärast 1-tunnist blokeerimist 5% kitse seerumiga lisati Ki67-vastane antikeha (1:200) ja inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 °C. Lisati anti-hiire/küüliku HRP-ga märgistatud polümeer (100 µL) ja proove inkubeeriti 37 kraadi juures 30 minutit, seejärel 100 µL DAB töölahust ja inkubeeriti toatemperatuuril 5 minutit. Pärast 1-minutilist hematoksüliiniga värvimist pesti proove 50-protsendilise, 75-protsendilise ja 100-protsendilise etanooli ja ksüleeniga 5 minutit ning kile sulgemiseks kasutati neutraalset kummi. Filmi vaadeldi ja pildistati mikroskoobi all.

Statistilineanalüüs

Statistiline analüüs viidi läbi GraphPad Prism tarkvaraga (V.8.0). Kõik tulemused on väljendatud kolme sõltumatu katse keskmisena ± SEM. Kui rühmi oli rohkem kui kaks, kasutati erinevuste hindamiseks ühesuunalist dispersioonanalüüsi, millele järgnes Dunnetti post hoc test. Kahe rühma olulise erinevuse hindamiseks kasutati Studenti t-testi. Statistiline olulisus määrati p<0.05.

TULEMUSED

CAG-i üherakuline multi-omika analüüs, mis pärsib siirdatud käärsoolevähi kasvu hiirtel

Et uurida, kas CAG-l on kasvajavastane toime, siirdasime esmalt MC38 vähirakud C57BL / 6 hiirtele. Märkasime, et CAG pärssis oluliselt kasvajate kasvu (veebipõhine lisajoonis S1A, B). Seejärel siirdasime CT26 rakud BALB / c hiirtele ja leidsime, et CAG pärssis ka kasvajate kasvu (veebipõhine lisajoonis S1C, D).

Et veelgi paljastada spetsiifilist mehhanismi, mille abil CAG inhibeerib kasvaja kasvu, analüüsisime seda scRNA-seq ja scATAC-seq tehnikate abil (joonis 1A). Jagasime rakupopulatsiooni nelja rühma: vähirakud, fibroblastid, müeloidrakud ja lümfotsüüdid (joonis 1B, veebipõhine lisajoonis S2A, B). Leidsime, et vähirakud (52 protsenti) ja fibroblastid (41 protsenti) infiltreerusid peamiselt kasvajakudedesse, samas kui immuunrakud moodustasid vaid 7 protsenti. Seejärel jagasime vähirakud kaheksaks alamrühmaks ja fibroblastid kolmeks alamrühmaks (joonis 1C – E). Seejärel näitas iga rakupopulatsiooni kõrgelt ekspresseeritud geenide rikastamise analüüs, et MHC-I molekulaarsed rajad vähirakkudes olid rikastatud, nagu ka T-rakkude ja NK-rakkude kasvajavastased signaalid (veebipõhine lisajoonis S2C). Seejärel leiti neli rakurühma, kasutades scATAC-seq ja scRNA-seq integratsioonianalüüsi (joonis 2D – G). Pärast võrdlust leidsime, et vähirakud (C01, C03 rakud), CD8 pluss T-rakud, Spp1 pluss TAM-rakud ja fibroblastid (F01 ja F02 rakud) ilmusid ATAC-i sekveneerimisel (joonis 1F, G) ja lisaks tugevalt ekspresseeritud. nendes rakkudes rikastati transkriptsioonifaktoreid (joonis 1H). Nende analüüside kaudu oletame, et kasvaja kasvu pärssimine CAG poolt on tihedalt seotud muutustega nendes rakkudes.

Cag soodustab kasvajarakkude antigeeni esitlust

CAG kasvajavastase mehhanismi analüüsimiseks analüüsisime esmalt kasvajarakkude populatsiooni ja jagasime vähirakud kaheksasse alarühma (joonis 2A, B, veebipõhine lisajoonis S3A). Tulemused näitasid, et võrreldes PBS rühmaga vähenesid C05 rühma rakud märkimisväärselt, samas kui C07 rühma rakud suurenesid (joonis 2C). Vahepeal võrdlesime meie kasvajarakkude klastrite täpsuse kontrollimiseks lümfotsüütide ja müeloidrakkude CNV-d võrdlusrakkudena. Tulemused näitasid, et vähirakkude CNV oli oluliselt kõrgem kui immuunrakkudel (veebipõhine lisajoonis S3B). Vähirakkude alamhulkade analüüsimisel leidsime, et interferooni vastuse geenid Isg15, Irf7, Ifit3 ja Ifi47 ekspresseerusid CAG rühma C07 ja C08 rakupopulatsioonides võrreldes PBS rühmaga kõrgelt (veebipõhine lisajoonis S3C). Kasvajarakkude populatsiooni analüüs näitas, et antigeeni esitlemisega seotud rajad olid märkimisväärselt rikastatud mitmes rakupopulatsioonis. Seetõttu oletame, et CAG võib soodustada vähirakkude antigeeni esitlemist, et mängida kasvajavastast rolli (joonis 2D). Seejärel valisime antigeeni esitlusega seotud geenid ja leidsime, et ekspressioonitase CAG-rühmas oli oluliselt kõrgem kui PBS-rühmas (joonis 2E, veebipõhine lisajoonis S3D). Samuti leidsime, et CAG soodustas kasvaja kudedes antigeeni esitlust (joonis 2F, G).

Järgmisena kasutasime scATAC-seq-i, et analüüsida CAG-i soodustava kasvajarakkude antigeeni esitluse spetsiifilisi põhjuseid. Leidsime, et kasvajarakkude populatsioon ekspresseeris tugevalt transkriptsioonifaktoreid Fos, Junb, Jund, Fosb ja Fosl1 (joonis 2H, I). Seejärel koostasime transkriptsioonifaktorite ja vastavate geenide vahelise interaktsiooni kaardi, et selgitada, et CAG soodustas kasvajarakkude antigeeni esitlevate geenide ekspressiooni (joonis 2J). Kasvajate kudedes leidsime ka, et transkriptsioonifaktorid Junb, Fos, Jund ja Fosb olid CAG-ravi saanud PBS-rühmas oluliselt üleekspresseeritud (joonis 2K – N, veebipõhine lisajoonis S3E-I). Siiani oleme leidnud, et CAG võib soodustada antigeeni esitlevate geenide transkriptsioonifaktorite ekspressiooni, suurendades seeläbi vähirakkude antigeeni esitlevat funktsiooni. Siiski jääb ebaselgeks, kuidas need vähirakud reageerivad immuunrakkude vastustele.

Et paljastada nähtus, mille abil CAG soodustab vähirakkude antigeeni esitlust, viisime läbi trajektoorianalüüsi, et uurida, kuidas vähirakud muudavad üksteist vastuseks immuunrakkude vastustele. Leidsime, et aja jooksul muutusid C07 vähirakud C05, C06 ja C08 rakkudeks ning geenide rikastamine näitas ka, et vähirakud muunduvad antigeeni esitluseks (joonis 3A–E).

CAG suurendab immuunrakkude tapmisfunktsiooni

Need tulemused näitavad, et CAG võib esitleda kasvajaraku antigeene, seega kas kasvajarakkude antigeeni esitluse suurendamine suurendab immuunrakkude funktsiooni? Selle väljaselgitamiseks analüüsisime vastavalt lümfotsüüte ja müeloidrakke. Tulemused näitasid, et CAG soodustas CD8 pluss T-rakkude infiltratsiooni kasvajakudedes ning CD8 pluss T-rakkude ja NK-rakkude infiltratsioon suurenes ka voolutsütomeetria abil (veebipõhine lisajoonis S4A-F). Samuti täheldasime, et CAG suurendas Ifitm2, Cxcr6 ja S100a6 geenide ekspressiooni CD8 pluss T-rakkudes,

Fcer1g, Gzmb, AW112010 ja Zfp36i2 geenid NK-rakkudes ning Nfkbia ja Junb geenid CD4 pluss T-rakkudes (veebipõhine lisajoonis S4G). Ifng ja Gzmb ekspressioon CD8 pluss T-rakkudes paranes samuti märkimisväärselt, nagu tuvastati voolutsütomeetria abil (veebipõhine lisajoonis S4H, I). Lisaks leidsime, et pärast CAG-ravi vähenes inhibeerivate retseptorite Lag3, Tigit ja Havcr2 ekspressioon CD8 pluss T-rakkude pinnal ning geenide Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 ja Pdcd1 ekspressioon, mis iseloomustavad CD8 pluss T-rakkude aktiveerimine suurenes märkimisväärselt (veebipõhine lisajoonis S4J). Et täiendavalt kontrollida, kas CAG suurendas CD8 pluss T-rakkude tapmisfunktsiooni, soodustades kasvaja antigeeni paremat esitlust, siirdasime CT26 rakud karvutute hiirte siirdatud kasvajatesse ja täheldasime, et CAG ei suutnud kasvajate kasvu tõhusalt pärssida (veebipõhine lisajoonis S4K-M ).

Pärast seda analüüsisime müeloidrakke ja leidsime, et Spp1 pluss TAM-rakud suurenesid pärast CAG-ravi, samas kui C1qc pluss TAM-rakkude arv vähenes ja Il1b pluss monotsüütide arv suurenes (veebipõhine lisajoonis S5A-D). Pärast CAG-ravi olid Spp1 pluss TAM ja C1qc pluss TAM rakud vastuvõtlikumad põletikueelsele TAM transformatsioonile. Rikastamise analüüs näitas, et see keskendus peamiselt Tnf-, Ifn-g-le ja põletikulise vastuse signaalirajale (veebipõhine lisajoonis S5E-H). Eespool nimetatud tulemuste põhjal järeldame, et CAG suurendab immuunrakkude äratundmist ja tapmisfunktsiooni, soodustades antigeeni esitlust vähirakkudes. Siiski pole selge, kuidas CAG-i reguleeritakse.

CAG sihtvalgu CTSB avastamine lõksuga

Järgmisena uurime spetsiifilist CAG sihtvalku, mis mängib kasvajavastast rolli. Valisime uurimisobjektiks vähirakud, kuna leidsime, et CAG võib suurendada vähirakkude antigeeni esitlust, suurendades seeläbi immuunrakkude tapmisfunktsiooni. Esmalt sünteesisime CAG biotiini derivaadi ja leidsime, et reageerida võib ainult 3-OH (veebi lisajoonis S6A). Seejärel uurisime, kas CAG-biotiin soodustab ka antigeeni esitlusega seotud geenide ekspressiooni hiire MC38 kasvaja rakuliinis. Tulemused näitavad, et CAG-biotiin ei mõjutanud H2-K1, Cd74 ja Anxa1 geenide ekspressiooni (online lisajoonis S6B-D).

Seetõttu kasutasime laboris eelmist TRAP-i sihtmärgi otsimise meetodit. 32 CAG-d ja DMSO-d inkubeeriti mõlemat rakuliiniga MC38 (joonis 4A). Valisime CAG sihtvalguks valgu, mille FC on suurem või võrdne 2 ja ap väiksem või võrdne 0,05. Järgides põhimõtet, et väikeste molekulide seondumine valkudega toob kaasa lüsiini madala märgistamise efektiivsuse, valisime uuringu jaoks CTSB (joonis 4B). Järgmisena kasutasime CAG ja CTSB vahelise seondumise kontrollimiseks raku termilise nihke testi (joonis 4C) ja mikroskaala termoforeesi (MST) (joonis 4D) ning leidsime, et CAG ja CTSB vaheline afiinsus oli 26,6 nM (joonis 4D). Seejärel ennustasime CAG ja CTSB vahelisi seondumiskohti vastavalt CTSB valgu kristallstruktuurile PDB raamatukogus. Leidsime, et hüdroksüülrühmad CAG mõlemas otsas ning CTSB ALA77 ja GLY198 saidid olid seotud vesiniksidemega, samas kui CAG ja CTSB TYR75, PRO76 ja ALA173 saidid olid seotud van der Waalsi jõuga (joonis 4E) . CAG ja CTSB vahelise seondumiskoha kontrollimiseks transfekteerisime CTSB mutantse plasmiidi HCT-116 rakkudesse. Tulemused näitavad, et mutantse plasmiidi afiinsus A77V ja G198A ja CAG vahel oli sadu kordi kõrgem kui WT plasmiidil (joonis 4F, G). Järgmises osas uurime spetsiifilist mehhanismi, mille abil CAG mängib CTSB kaudu kasvajavastast rolli.

【Lisateabe saamiseks:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】