Abstraktne

Naha hüperpigmentatsioonihäired, nagu melasma, tedretähnid ja põletikujärgne hüperpigmentatsioon (PIH), on sageli põhjustatud ultraviolett-B (UVB) kiirgusest, nahavigastusest ja kohalikust nahapõletikust. Liigne melaniini ladestumine halvendab naha väljanägemist ja mõjutab negatiivselt patsiendi psühholoogilist heaolu. Tavalised depigmenteerivad ained, nagu hüdrokinoon, on suunatud peamiselt ühemoodilise toimega türosinaasile ja kannavad hästi dokumenteeritud ohutusriske. Mitme sihtmärgiga looduslikud botaanilised segud on kujunenud paljulubavate alternatiividena kaasaegsele funktsionaalsele kosmeetilisele koostisele.

Fenüületanoidglükosiidid (PhG-d) on iseloomulikud bioaktiivsed koostisosad, mis on eraldatudCistanche deserticola, hästi tuntud ravimtaim kuivadest kõrbepiirkondadest. Glabridiin (Gla), prenüleeritud isoflavan, mis on ekstraheeritudGlycyrrhiza glabra, on laialdaselt tunnustatud kui tugevatoimeline nahka sära andev looduslik ühend. Selles uuringus uuriti süstemaatiliselt glabridiiniga kombineeritud PhG-de sünergistlikku hüperpigmentatsioonivastast toimet. Massisuhte esialgseks sõelumiseks kasutati in vitro biokeemilisi analüüse, sealhulgas türosinaasi inhibeerimise, DPPH ja ABTS⁺ vabade radikaalide püüdmise teste. Edasi konstrueeriti kolm rakumudelit: UVB-kiirgusega kiiritatud B16F10 hiire melanoomirakkude pigmentatsioonimudel; lipopolüsahhariidi (LPS) poolt stimuleeritud HaCaT keratinotsüütide põletikumudel; AAPH-indutseeritud HaCaT oksüdatiivse stressi mudel. Kvantifitseeriti rakusisese türosinaasi aktiivsuse, melaniini sisalduse, põletikueelse tsütokiini vabanemise (IL-6, TNF-), superoksiiddismutaasi (SOD) ja katalaasi (CAT) ensüümi aktiivsuse näitajad. Kombinatsiooniindeksi (CI) arvutamine rakendati kahe botaanilise ekstrakti vahelise sünergilise koostoime kvantitatiivseks tuvastamiseks.

Testitud proportsioonide hulgas näitasid massisuhted m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 ja 10:1 silmapaistvat türosinaasi pärssivat ja antioksüdantset sünergiat. Kogukontsentratsioonil 0,4 g/l pH 6,8 fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS) saavutasid türosinaasi inhibeerimise määrad 94,37% (1:1), 92,93% (5:1) ja 88,06% (10:1). Vastavad DPPH radikaalide püüdmise protsendid olid 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %; ABTS⁺ katioonide radikaalide püüdmise võime saavutati 100,13%, 100,01%, 99,87%. Töökontsentratsioonil 25 ug/ml ei näidanud kõik kolm ühendipreparaati olulist tsütotoksilisust B16F10 ja HaCaT rakuliinide suhtes. 1:1 segatud rühm andis suurepärase tervikliku efektiivsuse: rakusisene türosinaasi jääkaktiivsus langes 23,80%-ni, suhteline melaniinisisaldus vähenes 30,90%-ni. Veelgi enam, PhGs/Gla (1:1) pärssis kõige tugevamalt IL-6 ja TNF-i sekretsiooni ning taastas maksimaalselt SOD ja CAT antioksüdantsete ensüümide aktiivsuse. Eksperimentaalsed tulemused kinnitasid, et glabridiiniga seotud PhG-d saavutavad sünergistlikke hüperpigmentatsioonivastaseid tulemusi kolmel viisil: melaniini biosünteesi pärssimine, nahapõletiku leevendamine ja oksüdatiivse stressi vastu võitlemine. 1:1 massisuhe tagab optimaalse integreeritud bioloogilise jõudluse. See uuring pakub eksperimentaalseid tõendeid, mis toetavad selle kasutamistCistanchefenüületanoidglükosiidid-glabridiini komposiitmaterjalid puhta iluga taimse päritoluga valgendava nahahoolduse tooraine väljatöötamisel.

Märksõnad: Cistanche deserticolafenüületanoidglükosiidid; glabridiin; sünergiline toime; hüperpigmentatsioonivastane toime; antioksüdant; põletikuvastane; kosmeetilised botaanilised toorained

1. Sissejuhatus

Melaniini liigne akumuleerumine epidermise kihtides põhjustab naha pigmentatsiooni fenotüüpide, sealhulgas melasma, efeliidide ja põletikujärgse hüperpigmentatsiooni (PIH) heterogeenset teket... Mitmed välised ja sisemised tegurid aitavad kaasa melaniini patoloogilisele ületootmisele. UVB ultraviolettkiirgus on esmane keskkonna vallandaja; nahatrauma ja kroonilised lokaalsed põletikulised reaktsioonid võimendavad veelgi pigmendihäireid. On hästi tõestatud, et epidermaalsete keratinotsüütide ja melanotsüütide vaheline ristkõne domineerib pigmendi progresseerumisel. Välise stimulatsiooni korral vabastavad aktiveeritud keratinotsüüdid reaktiivseid hapnikuliike (ROS) ja põletikueelseid vahendajaid. Need signaalmolekulid hajuvad ja toimivad külgnevatel melanotsüütidel, reguleerides türosinaasi katalüütilist aktiivsust, kiirendades melaniini sünteesi ja soodustades melanosoomi transportimist keratinotsüütide suunas, tekitades lõpuks nahapinnal nähtavaid pigmenteerunud kahjustusi. Seega ei saa hüperpigmentatsiooni tõhus sekkumine keskenduda ainult türosinaasi inhibeerimisele. Multimodaalsed ravistrateegiad peaksid samaaegselt hõlmama melanogeneesi inhibeerimist, põletikuvastast sekkumist ja oksüdatiivse stressi neutraliseerimist.

Traditsioonilised sünteetilised nahka valgustavad toimeained, nagu hüdrokinoon, tagavad depigmenteeriva toime peamiselt otsese türosinaasi supressiooni kaudu. Sellegipoolest piiravad ühe sihtmärgiga mehhanismid praktilist jõudlust ja hüdrokinooni pikaajaline paikne kasutamine võib põhjustada nahaärritust, kontaktdermatiiti ja potentsiaalseid ohutusriske, piirates kosmeetikatoodete kasutamist. Looduslikud taimse päritoluga biokoostisosad äratavad kosmeetikatoodete valmistajate ja tarbijate kasvavat huvi nende leebe profiili ja mitmesuunalise farmakoloogilise toime tõttu. Erinevate botaaniliste ekstraktide liitsegud on võimelised tekitama sünergistlikke bioloogilisi efekte, suurendades üldist tõhusust, vähendades samal ajal efektiivseid annustamisnõudeid, mis avab uued tehnilised suunad pigmentatsioonivastastele kosmeetika- ja tooraineuuringutele Google

Cistanche deserticola, mida tavaliselt nimetatakse "kõrbe ženšenniks", on traditsioonilises hiina meditsiinis klassikaline toonik. Kaasaegsed fütokeemilised uuringud näitavad, et fenüületanoidglükosiidid (PhG-d) moodustavad selle peamise farmakoloogiliselt aktiivse fraktsiooni, mille tüüpiliste ühenditena on ehhinakosiid ja akteosiid. Avaldatud farmakoloogilised uuringud näitavad, et PhG-del on tugev antioksüdantne võime, põletikuvastane bioaktiivsus ja mõõdukas türosinaasi inhibeeriv potentsiaal, mis viitab tulevastele kasutusvõimalustele dermatoloogilistes nahahooldusmaterjalides. Glabridiin on iseloomulik isoflavonoidühend, mis on eraldatudGlycyrrhiza glabrajuur, kosmeetikatööstuses tuntud kui valgendav kuld. See pärsib tugevalt melanogeneesi ja moduleerib samaaegselt naha põletikulisi kaskaade. Traditsioonilise meditsiini teoreetilisest vaatenurgast,Cistanchetoidab neeruessentsi ja toniseerib yangi, lagritsajuured aga toniseerivad põrna ja puhastavad soojustoksiini. Kombineeritud kasutamine vastab taimsete dermatoloogiliste teraapiate kombineeritud ühilduvuse põhimõtetele.

Mehaaniline hüpotees väidab, et PhGs-glabridiini kombinatsioon võib reguleerida naha pigmentatsiooni mitme sihtmärgi ja mitme tee režiimide kaudu: ühiselt inhibeerida türosinaasi katalüütilist funktsiooni, et katkestada melaniini tekke päritolu; reaktiivse hapniku liikide kogunemise summutamine; põletikueelse faktori ülevabastamise piiramine, et katkestada ROS- ja tsütokiinide vahendatud signaali võimendamine melanotsüütide aktiveerimiseks. Praeguseks on vähesed uurimistööd süstemaatiliselt teatanud selle binaarse segu sünergilisest hüperpigmentatsioonivastasest hindamisest.

Selle artikli eesmärk on uurida kombineeritud bioloogilisi mõjusidCistanchefenüületanoidglükosiidid ja glabridiin. Kõigepealt viidi läbi biokeemilised in vitro ensüümide inhibeerimise ja radikaalide eemaldamise sõeluuringud. Mitmemõõtmelise efektiivsuse hindamiseks koostati kolm tüüpilist rakumudelit, mis jäljendavad pigmendi ladestumist, nahapõletikku ja oksüdatiivseid kahjustusi. Sünergia või antagonismi interaktsioonide kvantifitseerimiseks kasutati kombinatsiooniindeksi metoodikat. Meie eesmärk oli määrata optimaalne ühendi massisuhe, selgitada kolmikrežiimi funktsionaalseid mehhanisme ja pakkuda eksperimentaalset andmetuge looduslike sünergistlike nahka helendavate kosmeetikatoodete toorainete väljatöötamiseks.

2. Materjalid ja meetodid

2.1 Reaktiivid, rakutüved ja laboriinstrumendid

B16F10 hiire melanoomi rakuliin (STCC20013G-1) osteti ettevõttelt Saierbio Co., Ltd. Immortaliseeritud inimese epidermise keratinotsüüt HaCaT (iCell-h066) saadi ettevõttelt iCell Bioscience Inc.Cistanchefenüületanoidglükosiide (PhG-d) ja glabridiini (Gla) tarnis kaubanduslikult Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. Seene türosinaas, arbutiin, L-türosiin, L-DOPA, DPPH, ABTS diammooniumisool, L-askorbiinhape, trivitamiin, L-SO1 ja muud AAPH-vitamiin, SO10 ja muud analüütilise kvaliteediga keemilised reaktiivid hangiti peamistelt biokeemiliste reaktiivide müüjatelt. Rakukultuuri tarbekaubad hõlmasid kõrge glükoosisisaldusega DMEM söödet, veise loote seerumit, penitsilliini-streptomütsiini segalahust. ELISA testikomplektid, mis on suunatud inimese IL-6, TNF-, CAT ja kogu-SOD tuvastamise komplektidele, hangiti vastavatelt biotehnoloogia tootjatelt.

Peamised laboriseadmed sisaldasid Multiskan FC täislainepikkusega mikroplaadilugejat, Heracell 371 CO₂ inkubaatorit (Thermo Fisher); KQ-200VDB ultrahelipuhasti; konstantse temperatuuriga veevann; DHG-9246A kiirkuivatusahi; KN4006B UVB ultraviolettkiirguse instrument kiirgustihedusega 8 mW/cm².

2.2 Proovilahuse ettevalmistamine

PhG-de ja glabridiini põhilahused valmistati pH 6,8 PBS puhvris või 50% (maht/maht) etanool-vesi lahustis, lahjendati seeriaviisiliselt töökontsentratsioonideni: 0,001 g/L, 0,005 g/L, 0,025 g/L, 0,1 g/L, 0,04 g/L, 0,04,8 1,6 g/l, 2,0 g/l. Üheksa liitrühma konfigureeriti fikseeritud kogumassi kontsentratsiooniga 0,4 g/l erinevate massiproportsioonidega m(PhGs):m(Gla)=40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, Ph4Gs/Gla (Ph40/Gla) (1:40).

Rakukatsete jaoks lahustati pulbriproovid seerumivabas DMEM-söötmes, et valmistada töökontsentratsiooniga lahuseid.

2.3 Biokeemilised in vitro analüüsid

2.3.1 Türosinaasi inhibeerimise test

96-augulise mikroplaadi igasse süvendisse lisati järjestikku 50 μL proovilahust, 50 μL pH 6,8 PBS-i ja 50 μL 1 g/LL-türosiini substraadi lahust. Eelinkubeerimine toimus 37-kraadise veevanni all 10 minutit. Seejärel lisati 50 µl 0,4 g/l seene türosinaasi lahust (200 U/mL) ja inkubeerimist jätkati 37 kraadi juures 10 minutit. Arbutiin toimis positiivse kontrollainena, pimekontroll kasutas pH 6,8 PBS puhvrit. Neeldumisväärtust mõõdeti mikroplaadilugejal lainepikkusel 490 nm. Türosinaasi inhibeerimise määra arvutamise valem:

Türosinaasi inhibeerimise määr (%)={1 − [(A_reaktsioon − A_reaktsiooni kontroll) / (A_blank − A_blank-control)]} × 100 %

Kus: A_reaktsioon: neeldumine, mis sisaldab proovi, substraati, PBS-i ja türosinaasi; A_reaktsiooni kontroll: proovi, substraadi ja PBS-i neeldumine ilma ensüümita; A_blank: substraadi, PBS ja türosinaasi neeldumine; A_blank-control: neelduvus ainult substraadi ja PBS puhvri puhul.

2.3.2 DPPH vabade radikaalide eemaldamise määramine

DPPH pulber lahustati veevabas etanoolis, et saada 0,2 mmol/L DPPH töövedelik. PhG-d, glabridiin ja C-vitamiini võrdlusaine lahustati 50% etanool-vesi lahustis, et moodustada kontsentratsioonigradiendi põhilahused. Üheksa massisuhtega binaarsegu proovid segati ühtlaselt. Igasse süvendisse lisati 100 μL proovivedelikku pluss 100 μL DPPH töölahust. Pärast põhjalikku segamist hoiti mikroplaati ümbritseva keskkonna temperatuuril valguse eest 30 minutit. Neeldumisnäit registreeriti λ = 517 nm juures. C-vitamiin toimis positiivse kontrollina, iga katserühm kordas 3 bioloogilist kordust. DPPH puhastuskiiruse valem:

DPPH puhastusmäär (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A₁: proovi neeldumine + DPPH töövedelik; A₂: 50% etanooli + DPPH töövedeliku neeldumine; A3: 50% etanooli lahustiga segatud proovilahuse neeldumine.

2.3.3 ABTS⁺ katiooniradikaalide püüdmise test

7,4 mmol/l ABTS põhilahust ja 2,6 mmol/l kaaliumpersulfaadi lahust segati võrdselt, inkubeeriti pimedas keskkonnas 12 tundi, et saada stabiilne ABTS⁺ tööreagent. Proovilahused konfigureeriti vastavalt jaotises 2.3.2. 40 kirjeldatud protokollidele. Mikroplaadi süvenditesse pipeteeriti μL proovilahust ja 160 μL ABTS⁺ töövedelikku. Pärast valguse varjestatud inkubeerimist 6 minutit toatemperatuuril mõõdeti neeldumist lainepikkusel 734 nm. ABTS⁺ radikaali eemaldamise määra valem:

ABTS⁺ puhastusmäär (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A₁: proovilahuse ja ABTS⁺ töölahuse neeldumine; A2: ABTS⁺ tööreagendiga segatud deioniseeritud vee neeldumine; A₃: puhta deioniseeritud vee lahustiga segatud proovilahuse neeldumisväärtus.

2.4 Rakukultuuri protseduurid

B16F10 melanoomirakke ja HaCaT keratinotsüüte kasvatati kõrge glükoosisisaldusega DMEM söötmes, millele oli lisatud 10% veise loote seerumit ja 1% penitsilliini-streptomütsiini. Inkubaatori parameetrid: 37 kraadi, 5% mahuosa CO₂, suhteline õhuniiskus 70%. Rakkude läbimine ja söötme värskendamine viidi läbi vastavalt rakkude kasvu tihedusele, mida täheldati pööratud optilise mikroskoobi all. Logaritmilise kasvufaasis olevad rakud koguti järgnevaks külvamiseks 96-augulistele kultuuriplaatidele.

2.5 Kolme rakulise funktsionaalse mudeli loomine

2.5.1 UVB-indutseeritud B16F10 pigmentatsioonimudel

Pärast 1-tunnist eeltöötlust vastava proovisöötmega kaeti rakukihi pind PBS puhvriga. UVB kiirituse intensiivsus määrati 8 mW/cm², kiirituskaugus 3 cm, kiiritamise kestus 110 s. Tavaline rühm sai identset söödet ilma UVB-kiirguse sekkumiseta. Mudeli kontrollrühm sai PBS-i eeltöötluse, millele järgnes UVB-kiirgus võrdse annusega ilma proovi lisamiseta.

2.5.2 LPS-i vahendatud HaCaT-i põletikulise aktiveerimise mudel

HaCaT rakke eelinkubeeriti 24 tundi testitava proovi DMEM söötmega. Seejärel lisati lipopolüsahhariidi LPS lahust, et saavutada lõppkontsentratsioon 20 ug/ml, ja kooskultuur kestis veel 24 tundi. Mudelrühma rakud nakatati LPS-iga ilma proovi eeltöötluseta. Normaalne rühm säilitas tavalise täissöötmekasvatuse.

2.5.3 AAPH-käivitatud HaCaT oksüdatiivse stressi mudel

Rakke eelinkubeeriti 24 tundi. Söötmele lisati AAPH reaktiiv, lõppkontsentratsioon 25 mmol/L, jätkates 24-tunnist inkubeerimist. Mudeli kontrollrühma stimuleeris AAPH ilma proovi sekkumiseta. Normaalne kontrollrühm kasvas tavalistes keskmistes tingimustes.

Kõik rakumudeli rühmad sisaldasid kolme tehnilist kordamiskaevu.

2.6 Tsütotoksilisuse test (CCK-8 meetod)

Rakususpensioon reguleeriti tihedusele 1 × 104 rakku/ml ja inokuleeriti 96-augulistele mikroplaatidele. Pärast rakkude kleepumist manustati gradiendi kontsentratsiooniga proovisöödet ja inkubeerimist jätkati 24 tundi, 48 tundi, 72 tundi. Värske DMEM söötmega segatud CCK-8 tuvastav reaktiiv (mahufraktsioon 10%) asendas vana söötme, inkubeerimine kestis 60 minutit. Mikroplaadilugeja mõõtis neeldumist lainepikkusel 450 nm. Rakkude suhtelise elujõulisuse protsendi arvutamise valem:

Rakkude elujõulisus (%)=[(A_proov − A_tühi) / (A_0 − A_blank)] × 100 %

A_sample: auku sisaldavate rakkude, CCK-8 reaktiivi ja proovisöötme neeldumine; A_blank: kultuurisöötme neeldumine pluss CCK-8 ilma külvatud rakkudeta; A_0: tühja söötmega kultiveeritud rakkude ja CCK-8 reaktiivi neeldumine (testiproove pole).

2.7 Intratsellulaarse türosinaasi aktiivsuse kvantifitseerimine

Pärast 48-tunnist mudeli loomise töötlemist rakkude supernatant visati ära. Raku monokihti pesti kaks korda pH 7,4-ga PBS. 50 μL 1% Triton X-100 lüüsilahust lisati igasse süvendisse. Mikroplaati külmutati -80 kraadises külmikus 30 minutit, seejärel sulatati toatemperatuuril rakumembraani täielikuks purunemiseks. Eelsoojendus 37 kraadi juures kestis 5 min. Lisati L-DOPA substraati (10 mmol/L, 10 μL). Mikroplaati inkubeeriti 1 tund CO₂ inkubaatoris. Suhtelise rakusisese türosinaasi aktiivsuse arvutamiseks tuvastati neeldumine 475 nm juures.

2.8 Intratsellulaarne melaniinisisalduse mõõtmine

Melaniinisisalduse tuvastamiseks võeti kasutusele NaOH lõhustamismeetod. Pärast 72-tunnist mudelisekkumist kultuuri supernatant eemaldati, rakke loputati kaks korda PBS puhvriga . 100 μL 1 mol/L NaOH vesilahust, mis sisaldas 10% DMSO-d. Mikroplaati inkubeeriti 90-kraadises ahjus 60 minutit melaniini täielikuks lahustumiseks. Suhtelise melaniinisisalduse protsendi arvutamiseks loeti neeldumine 490 nm juures.

2.9 Põletikufaktori ja antioksüdandi ja ensüümi indikaatorite tuvastamine

Pärast 48-tunnist mudelitöötlust kraabiti HaCaT rakud ja koguti, tsentrifuugiti rakkude supernatandi kogumiseks. IL-6 ja TNF-i põletikueelsete tsütokiinide kontsentratsioonide kvantitatiivseks määramiseks kasutati kaubanduslikke ELISA komplekte. Antioksüdantide ja ensüümide testimiseks allutati rakupelletitele korduvad külmutamise-sulatamise tsüklid, et saavutada rakkude killustumine. Tsentrifuugimise tingimus: 12 000 p/min, 4 kraadi, 10 min. Supernatandi fraktsioon koguti SOD elujõulisuse ja CAT ensüümi sisalduse määramiseks vastavalt komplekti tööspetsifikatsioonidele.

2.10 Kombineeritud indeksi (CI) analüüs

Chou-Talalay kombinatsiooniindeksi (CI) algoritm rakendati PhG-de ja glabridiini sünergistliku/additiivse/antagonistliku koostoime hindamiseks türosinaasi inhibeerimise ja antioksüdantide testides:

CI=D₁/DX₁ + D₂/DX₂

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >1 kujutab antagonistlikku interaktsiooni; CI ≈ 1 tähendab aditiivset mõju; CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Statistiline analüüs

Katse mõõtmistulemused väljendati kui keskmine väärtus ± standardhälve (keskmine ± SD). GraphPad Prism 9.5.0 tarkvara teostas statistilise arvutuse. Mitme rühma võrdlemiseks kasutati ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA). P-väärtus< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Tulemused ja arutelu

3.1 PhG-de, glabridiini ja binaarsegu proovide in vitro türosinaasi inhibeeriv toime

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhGs.

PBS-i lahuse kogukontsentratsioonil 0,4 g/l andsid PhGs/Gla (10:1), PhGs/Gla (5:1), PhGs/Gla (1:1) türosinaasi inhibeerimise määra 88,06%, 92,93%, 94,37%. Nii 5:1 kui ka 1:1 suhted ületasid ühekomponendiliste PhG-de (36,92%) ja ühekomponendiliste glabridiinide (92,71%) inhibeerimise efektiivsust sobiva massikontsentratsiooni korral. 1:1 rühm saavutas inhibeerimise ulatuse, mis oli võrreldav positiivse kontrolli arbutiiniga. Vastavalt CI väärtuse arvutamise tulemustele: m(PhGs):m(Gla) vahemikus 40:1 kuni 1:1 genereeritud CI< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, mis avaldab antagonistlikku koostoimet.

Fenoolsed hüdroksüülrühmad moodustavad türosinaasi inhibeeriva võime peamise funktsionaalse osa. PhG-d sisaldavad orto-dihüdroksüfenüüli struktuurseid fragmente, mis on võimelised kelaatima vase ioone türosinaasi katalüütiliselt aktiivses taskus, takistades konkureerivalt substraadi ja ensüümi sidumist. Glabridiini isoflavaani skelett kannab oma B-tsüklis 2-OH ja 4-OH rühmi, mis on struktuurilt analoogsed L-türosiini / L-DOPA aromaatse hüdroksüülrühmaga asendatud ringiga, võimaldades ensüümi aktiivse saidi domeeni konkureerivat hõivamist. Pärast segu segamist suureneb kumulatiivne fenool-hüdroksüülide kogus; vahepeal võivad kaks molekuli kinnituda türosinaasi valgu erinevatele sidumissaitidele, suurendades koos inhibeerivat efektiivsust.

3.2 Uuritavate proovide radikaali eemaldav antioksüdantne toime

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridiin. PhG-sid leidub rohkesti kofeoüülrühma ja 3,4-dihüdroksüfenüületanooli rühmades, kusjuures konjugeeritud kaksiksidemesüsteemid tugevdavad vabu radikaale neutraliseerivat toimet. Glabridiini flavonoidraamistik varustab ka hüdroksüülrühmi ja laiendatud konjugeeritud tsükli arhitektuuri, et stabiliseerida reaktiivse hapnikuga liikide paarituid elektrone.

Kolm paljulubavat ühendirühma PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) näitasid suurepärast DPPH- ja ABTS⁺-puhastusvõimet. ABTS⁺ eemaldamise määr saavutas peaaegu 100%, mis näitab katioonide vabade radikaalide peaaegu täielikku elimineerimist. Erinevad massisuhted tekitavad kahe molekuli vahel erinevaid molekulaarse interaktsiooni olekuid, mis põhjustavad erinevusi hüdroksüülrühma kokkupuute seisundis ja põhjustavad antioksüdantide sünergilise ulatuse lahknemist.

3.3 PhG-de, glabridiini ja segatud preparaatide tsütotoksilisuse hindamine

CCK-8 tsütotoksilisuse testid näitasid, et PhG-d kontsentratsioonivahemikus 62,5–500 ug/ml ja glabridiin 6,25–25 ug/ml ei põhjustanud B16F10 ja HaCaT rakuliinide elujõulisuse ilmset vähenemist. 25 ug/ml kogumassi kontsentratsiooni tingimustes säilitasid kolm ühendite suhterühma PhGs/Gla (1:1, 5:1, 10:1) rakkude kõrge elujõulisuse, mis ei näidanud tuvastatavat tsütotoksilist toimet mõlema rakutüve suhtes. Järelikult valiti järgnevaks rakufunktsiooni hindamiseks ohutuks töökontsentratsiooniks 25 ug/ml. Ühe toimeainega rühmade puhul määrati PhG-de madal/keskmine/suur annus 125 ug/mL, 250 ug/ml, 500 ug/ml; glabridiini madal/keskmine/suur annus: 6,25 ug/mL, 12,5 ug/mL, 25 ug/ml.

3.4 Mõju rakusisese türosinaasi aktiivsusele ja melaniini sisaldusele UVB-stimuleeritud B16F10 rakkudes

Pärast UVB kiiritusravi näitas B16F10 mudelirühma rakusisese türosinaasi aktiivsuse ja melaniini akumulatsiooni statistiliselt olulist suurenemist (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

Ühtse kogukontsentratsiooni 25 ug/ml korral näitasid ühendirühmad paremaid bioloogilisi tulemusi võrreldes ühekomponendiliste analoogidega. Kolme vahekorra hulgas andis PhGs/Gla (1:1) optimaalse efekti: rakusisene türosinaasi jääkaktiivsus vaid 23,80%, suhteline melaniinisisaldus langes 30,90%-ni. Statistiline võrdlus näitas olulist erinevust võrreldes 5:1 ja 10:1 ühendirühmadega. Suhe 1: 1 näitas silmapaistvat sünergistlikku võimendust melaniini biosünteesi piiramiseks melanotsüütide rakkudes.

UVB-kiirgus kutsub esile melanotsüütidele omase melanogeense signaaliülekande kaskaadi, reguleerides üles MITF-i transkriptsioonifaktori ekspressiooni ja indutseerides veelgi türosinaasi valgu üleekspressiooni. Meie rakueksperimendi tulemused kinnitasid, et PhG-d koos glabridiiniga võivad tõhusalt muuta UVB-indutseeritud türosinaasi aktivatsiooni ja vähendada melaniini teket.

3.5 Põletikuvastane toime LPS-ga nakatunud HaCaT keratinotsüütidele

LPS-i stimuleerimine suurendas tugevalt IL-6 ja TNF-i põletikueelset tsütokiini sekretsiooni HaCaT mudelirühmas (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhGs/Gla (10:1). 1:1 preparaat vähendas maksimaalselt IL-6 ja TNF-i vabanemist, ületades PhG-de või glabridiini eraldi manustamisel saadud inhibeerivat toimet.

Molekulaarse mehhanismi seletus: PhG-de fenool-hüdroksüülrühm hävitab põletikku vallandavaid vabu radikaale; pealegi võivad PhG-d häirida NF-κB ja MAPK rakusiseseid signaaliülekandekaskaade, et piirata põletikueelse geeni transkriptsiooni. Glabridiin pärsib stressiga aktiveeritud kinaasi JNK ja p38 fosforüülimist, blokeerides allavoolu põletikuliste signaalide ülekande. Üksik aine võib ainult osaliselt pärssida põletikuliste signaalide raja aktivatsiooni. Binaarne kombinatsioon sekkub samaaegselt mitmesse põletikusignaalivõrgu sõlme, saavutades sünergilise põletikuvastase toime.

Nahapõletik on PIH esinemise kriitilise ülesvoolu põhjustaja. Keratinotsüütide poolt sekreteeritud põletikulised tsütokiinid toimivad parakriinsete signaaliülekannetena, stimuleerides külgnevaid melanotsüüte, et kiirendada melaniini tootmist ja melanosoomide ülekannet. Epidermise põletiku tõhus leevendamine on hüperpigmentatsioonikahjustuste ennetamiseks ja parandamiseks hädavajalik. Seetõttu annab PhGs-glabridiini ühendi põletikuvastane eelis pigmentatsioonivastase kosmeetilise materjali pealekandmisel lisaväärtust.

3.6 Antioksüdantide ja ensüümide reguleerimise võime AAPH-indutseeritud oksüdatiivse stressi tingimustes

AAPH oksüdatiivse stressi mudelirühm näitas intratsellulaarse SOD ja CAT antioksüdant-ensüümi elujõulisuse ilmset langust (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

Nahk, mis puutub kokku ultraviolettkiirgusega, tekitab suures koguses reaktiivse hapniku liike. Liigne ROS mitte ainult ei oksüdeeri otseselt melaniini sünteesiga seotud biomolekule, vaid aktiveerib ka mitut melanogeenset signaaliülekande rada. Endogeenne antioksüdant-ensüümsüsteem (SOD, CAT) on peamine kaitsebarjäär rakusisese ROS-i kõrvaldamiseks. Kui oksüdatiivne stress ületab sisemise antioksüdandi võime, kiirendab ROS-i kogunemine pigmentatsiooni progresseerumist. PhGs-glabridiini ühend mitte ainult ei eemalda fenool-hüdroksüül keemilise reaktsiooni kaudu vabu radikaale, vaid parandab ka raku antioksüdantide-ensüümide süsteemi funktsiooni, leevendades oksüdatiivse stressi põhjustatud kahjustusi kahest mõõtmest. Erinevad massisuhted muudavad kahe loodusliku molekuli molekulaarset interaktsioonimustrit, mille tulemuseks on lahknevus lõplikus antioksüdantide reguleerimise efektiivsuses.

3.7 Sünergilise antihüperpigmentatsiooni mehhanismi põhjalik arutelu

Naha hüperpigmentatsiooni patoloogiline protsess moodustab keeruka signaalivõrgu: UVB-kiirgus mõjutab nii melanotsüüte kui ka ümbritsevaid keratinotsüüte. Keratinotsüüdid vabastavad ROS-i ja põletikuvastaseid tsütokiine. Need biosignaalid aktiveerivad veelgi melanotsüüte, reguleerivad türosinaasi aktiivsust, suurendavad melaniini biosünteesi ja hõlbustavad melanosoomi transportimist epidermise keratinotsüütide suunas, viies lõpuks nähtava pigmendi ladestumiseni nahapinnale. Seega ei saa ühe sihtmärgi türosinaasi inhibeerimine patoloogilist pigmentatsiooni täielikult tagasi pöörata. Mitmerajaline sekkumisstrateegia peaks hõlmama melanogeneesi inhibeerimist, põletikuvastast toimet ja antioksüdantide kaitset.

Meie katsetulemused näitasid, et PhG-d koos glabridiiniga realiseerivad multimodaalset sekkumist hüperpigmentatsiooni vastu:

Melaniini biosünteesi allika pärssimiseks surub otse maha türosinaasi katalüütilise aktiivsuse melanotsüütides;

Inhibeerib põletikueelsete tsütokiinide liigset sekretsiooni keratinotsüütidest, katkestades parakriinse põletikulise stimulatsiooni signaali melanotsüütide suunas;

Likvideerige liigsed reaktiivsed hapniku liigid ja taastage endogeenne SOD/CAT antioksüdant-ensüümi aktiivsus, leevendades oksüdatiivse stressi vahendatud pigmendi võimendamist.

Suhe m(PhGs):m(Gla) = 1:1 näitas optimaalset kõikehõlmavat sünergistlikku jõudlust biokeemilise ensüümi inhibeerimise, radikaalide püüdmise, melanotsüütide pigmendimudeli, keratinotsüütide põletikumudeli ja oksüdatiivse stressi mudeli puhul. See suhe ületas peaaegu kõigis testimisnäitajates rühmi 5:1 ja 10:1. Sünergia võib tuleneda täiendavatest molekulaarstruktuuri omadustest: PhG-del ja glabridiinil on erinevad fenool-skeleti raamistikud, mis interakteeruvad erinevate sihtvalkudega (türosinaas, põletikku signaalivad kinaasid, antioksüdantide ja ensüümidega seotud rajad). Pärast ühendite segamist optimeeritakse fenool-hüdroksüülrühma kokkupuute olek molekulidevahelise interaktsiooni kaudu, suurendades üldist bioloogilist aktiivsust.

Kosmeetikatööstuse praktilises perspektiivis toovad sünergilised botaanilistest ühenditest toorained kaks suurt eelist. Esiteks võimaldab sünergiline toime vähendada iga üksiku toimeaine vajalikku annust, mis vähendab koostise maksumust; teiseks, mitmesuunaline funktsionaalne profiil sobib kliiniliselt täheldatud naha hüperpigmentatsiooni, nagu PIH ja melasma, keeruka patoloogilise mehhanismiga, pakkudes teoreetilise aluse kõrge efektiivsusega looduslike nahka heledamaks muutvate kosmeetiliste koostiste väljatöötamiseks.

4. Järeldus

Selles uuringus hinnati süstemaatiliselt sünergistlikku hüperpigmentatsioonivastast bioaktiivsustCistanche deserticola päritolufenüületanoidglükosiidid (PhG-d) kombineerituna glabridiiniga (Gla). Tõhususe mitmemõõtmeliseks iseloomustamiseks kasutati biokeemilist in vitro sõeluuringut ja kolme tüüpilist rakumudelit. Peamised eksperimentaalsed järeldused on kokku võetud järgmiselt:

Türosinaasi inhibeerimise ja vabade radikaalide püüdmise in vitro biokeemilistes testides näitasid ühendid m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 soodsat inhibeerivat toimet ja sünergistlikku koostoimet. Kogukontsentratsioonis 0,4 g/l pH 6,8 PBS-is saavutasid türosinaasi inhibeerimise määrad 94,37% (1:1), 92,93% (5:1), 88,06% (10:1). DPPH-radikaalide eemaldamise määr: 89,44%, 88,72%, 88,10%. ABTS⁺-radikaalide eemaldamise määr: 100,13%, 100,01%, 99,87%.

Ohutu töökontsentratsiooni 25 ug/ml korral ei näidanud PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) DMEM lahused tsütotoksilisust B16F10 melanoomirakkude ja inimese HaCaT keratinotsüütide suhtes. Nende rühmade seas saavutas PhGs/Gla (1:1) parima integreeritud efektiivsuse: rakusisene türosinaasi aktiivsus vähenes 23,80%-ni, melaniinisisaldus vähenes 30,90%-ni. See inhibeeris tugevaimalt IL-6, TNF-põletikuliste tsütokiinide vabanemist ning SOD ja CAT antioksüdantide-ensüümide elujõulisuse maksimaalset taastumist. 1:1 massisuhtega rühmal oli ilmselge sünergistlik võimendusefekt, mis on parem kui ühe toimeaine rühmad ja muud ühendi suhte rühmad.

PhG-de ja glabridiini kahekomponentne segu avaldab naha hüperpigmentatsioonivastast toimet kolmel viisil: pärsib melaniini biosünteesi, leevendab epidermise põletikku ja neutraliseerib oksüdatiivse stressi tekitatud kahjustusi. Optimaalne sünergistlik massisuhe m(PhGs):m(Gla) = 1:1. See uuring pakub eksperimentaalseid tõendeid ja tehnilist tuge looduslike taimse päritoluga multifunktsionaalsete kosmeetiliste toorainete väljatöötamiseks naha sära andmiseks ja pigmentatsioonivastasteks rakendusteks.

Tänuavaldused

Seda tööd toetas rahaliselt Hiina riiklik loodusteaduste sihtasutus (grandi nr. 82160772). Täname Xinjiangi kliiniliste ravimiuuringute võtmelaborit eksperimentaalse platvormi toe eest.

Viited

[1] Nautiyal A, Wairkar S. Hüperpigmentatsiooni juhtimine: praegused ravimeetodid ja uued ravimeetodid [J]. Pigment Cell & Melanoma Research, 2021, 34(6):1000–1014.

[2] Yardman-Frank J M, Fisher D E. Naha pigmentatsioon ja selle kontroll: ultraviolettkiirgusest tüvirakkudeni [J]. Experimental Dermatology, 2021, 30(4):560–571.

[3] Neagu N, Conforti C, Agozzino M jt. Melasma ravi: süstemaatiline ülevaade [J]. Journal of Dermatological Treatment, 2022, 33(4):1816–1837.

[4] Hossain M R, Ansary T M, Komine M jt. Mitmekesised stiimulitest põhjustatud põletikulised rajad põhjustavad naha pigmentatsiooni [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(8):3970.

[5] Laul X, Ni M T, Zhang Y jt. Epigallokatehhiin-3-galaadi ja gallokatehhiingalaadi inhibeerivate võimete võrdlemine türosinaasi suhtes ja nende kombineeritud toime kojichappega [J]. Food Chemistry, 2021, 349(1):129172.

[6] Zolghadri S, Beygi M, Mohammad T F jt. Türosinaasi sihtimine hüperpigmentatsiooni korral: praegune seisund, piirangud ja tulevased lubadused [J]. Biochemical Pharmacology, 2023, 212:115574.

[7] Cicero A L, Delevoe C, Gilles-Marsens F jt. Keratinotsüütide poolt vabastatud eksosoomid moduleerivad melanotsüütide pigmentatsiooni [J]. Looduskommunikatsioonid, 2015, 6:7506.

[8] Serre C, Busuttil V, Botto, J. M. Inimese naha melanogeneesi ja pigmentatsiooni sisemine ja väline regulatsioon [J]. International Journal of Cosmetic Science, 2018, 40 (4): 328–347.

[9] Irfan M, Shafeeq A, Siddiqui U jt. Mehaaniline lähenemisviis raskmetallide, hüdrokinooni ja mikroorganismide toksilisuse ja riskide hindamiseks kosmeetikakreemides[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 433:128806.

[10] Zheng Y, Du X S, Zhang L jt. Hüdrokinoonist põhjustatud nahka ärritava reaktsiooni saab saavutada nuumrakkude aktiveerimisega massiga seotud G-valguga seotud retseptori X2[J] kaudu. Experimental Dermatology, 2023, 32(4):436–446.

[11] Meng H, Liu X K, Li J R jt. Ženšenni nahale avalduva mõju bibliomeetriline analüüs[J]. Journal of Cosmetic Dermatology, 2022, 21 (1): 99–107.

[12] Liu F, Qu L K, Li H jt. Looduslike valgendavate ainete biomeditsiiniliste funktsioonide edusammud naha pigmentatsioonihaiguste ravis[J]. Pharmaceutics, 2022, 14(11):2308.

[13] Wang T T, Zhang D, Wang Y J jt. Lonicera japonica polüfenoolide ja Vaccinium vitis-idaea L etanooliekstrakti sünergiline nahahooldus.[J]. Fine Chemicals, 2023, 40 (3): 627–637.

[14] Wu Y, Liu Q, Tang W jt. Salvia miltiorrhiza lenduva õli ja võililleekstrakti komplekside kasutamine kosmeetikas[J]. Fine Chemicals, 2022, 39(3):562–568.

[15] Chen J R, Zhu X Y, Cui H Y jt. Xinjiangi provintsi erinevatest tõugudest ja osadest pärit Cistanche deserticola toimeainete variatsioonide ja antioksüdantse toime analüüs[J]. Toiduainetööstuse teadus ja tehnoloogia, 2024, 45 (21): 227–233.

[16] Xiao L Y, Yao J, Miao Y Y jt. Cistanche tubulosast eraldatud tubulosiid B on paljutõotav aine M1 makrofaagide aktiveerimise vastu Mob1 ja ERK1/2 [J] sünergistliku sihtimise kaudu. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2022, 153:113414.

[17] Xu H H. Uuring Herba cistanches'i fenüületanoidglükosiidide kohta transdermaalsel manustamisel ja melaniini sünteesi pärssiv toime B-indutseeritud pigmentatsiooni korral pruunil meriseal[D]. Urumqi: Xinjiangi meditsiiniülikool, 2020.

[18] Huang J, Xie C, Pan Z. Glabridiini, resveratrooli ja poldatiini kompleksi sünergistlik valgendamine, antioksüdant ja põletikuvastane toime[J]. Flavor Fragrance Cosmetics, 2024 (3): 99–107 233.

[19] Wang S Q, Zhu Y Z, Zheng X B. Chou-Talalay meetodi uurimine ja rakendamine kasvajavastaste ravimite kombinatsiooni jaoks[J]. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2013, 30(4):449–453.

[20] Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Naha valgendavad ained: türosinaasi inhibiitorite meditsiiniline keemia perspektiiv [J]. Journal of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry, 2017, 32(1):403-425