Cistanche Tubulosa sahharoosi süntaasi geenide kloonimine, funktsionaalne identifitseerimine, struktuuri- ja ekspressioonianalüüs Ⅲ

4 CtSus ekspressioonianalüüs Cistanche tubulosa ja rakukultuurisüsteemi erinevates osades põua stressi all

4.1 CtSus ekspressioonianalüüs Cistanche tubulosa erinevates osades

In vitro, terve raku transformatsiooni katsed ja ensümaatilise katalüütilise reaktsiooni katsed kinnitasid, et CtSus geeni poolt kodeeritud valk võib katalüüsida UDP-glükoosi sünteesi. Selle geeni ja Cistanche tubulosa glükosiidühendite biosünteesi vahelise seose edasiseks uurimiseks analüüsiti selle geeni ekspressioonitaset Cistanche tubulosa erinevates osades.

KÕRGE KVALITEETNE CISTANŠI ürti 10-98% EHHINAKOOSIDEGA

Echinacoside is the most representative glycoside compound in Cistanche tubulosa, and its content can reach more than 30% of the dry weight of Cistanche tubulosa plants [23]. The research group previously measured the content of echinacoside in different parts of Cistanche tubulosa plants. Specifically, the content of echinacoside in different tissues is as follows: haustoria>underground part>>õhust osa; nende hulgas on ehhinakosiidi sisaldus haustorias kõrgeim.

Reaalajas fluorestsents-kvantitatiivne PCR viidi läbi, kasutades matriitsina Cistanche tubulosa erinevatest osadest pärit cDNA-d ning tulemusi analüüsiti 2-ΔΔCT meetodil ja viidi läbi diferentsiaalanalüüs. Tulemused on näidatud joonisel 4A. CtSus geeni ekspressioonitase haustorias oli kõrgeim, 1,5 korda kõrgem kui õhust ja maa-aluses osas oli ekspressioonitase oluliselt kõrgem kui õhust, mis on kooskõlas fenüületanoidglükosiidide akumulatsiooni mustriga. mida esindab ehhinakosiid Cistanche tubulosa erinevates osades.

Joonis 4 CtSus suhtelised ekspressioonitasemed PEG6000-ga töödeldud C. tubulosa ja suspensioonirakkude erinevates osades. A: CtSus suhteline ekspressioonitase C. tubulosa erinevates osades; B: CtSus suhteline ekspressioonitase PEG6000-ga töödeldud C. tubulosa suspensiooni rakkudes erinevatel ajahetkedel. n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

4.2 CtSus ekspressioonianalüüs Cistanche deserticola suspensioonirakkudes põua stressi tingimustes

Projekti esialgsed uuringud näitasid, et PEG6000 põhjustatud põuastress võib oluliselt suurendada fenüületanoolglükosiidide akumuleerumist Cistanche deserticola suspensioonirakkudes. 3 kuni 9 päeva pärast induktsiooni suurenes ehhinatsasiidi sisaldus märkimisväärselt. 12. kuni 15. päevani ehhinakosiidide sisalduse kasvutempo aeglustus ja saavutas maksimumväärtuse 15. päeval. Seejärel kasvas kultiveerimisaja pikenedes ehhinakosiidide sisaldus märkimisväärselt. Fruktosiidi sisaldus vähenes järk-järgult [24]. Sellele uuringule tuginedes kasutati selles artiklis töötlemata Cistanche deserticola suspensioonirakkude ja PEG{7}}indutseeritud Cistanche deserticola suspensioonirakkude cDNA-d mallidena reaalajas fluorestsentsi kvantitatiivse PCR tuvastamiseks, et uurida CtSus geeni Cistanche deserticola suspensioonirakkudes. põua stressitingimused. Muutused väljendustasemetes. Tulemused on näidatud joonisel 4B. PEG6000 poolt indutseeritud Cistanche deserticola suspensioonirakkudes suurenes CtSus ekspressioon märkimisväärselt 6. päeval pärast induktsiooni, saavutas kõrgeima väärtuse 9. päeval ja langes seejärel kontrolliga samale tasemele. Samal tasemel rühmad. Ülaltoodud tulemused näitavad, et põuastress võib märkimisväärselt suurendada CtSus geeni ekspressiooni Cistanche deserticola suspensiooni rakuliinis, mis on kooskõlas ehhinatsasiidi akumulatsioonimustriga põua stressi all. CtSus geeni ekspressiooni tipp ilmneb siiski varem kui ehhinatsasiidi sisalduse tipp, sest CtSus katalüüsiga sünteesitud aktiivne glükosüüldoonor on oluline eelkäija, mis on vajalik mitmeastmelise glükosüülimisreaktsiooni jaoks järgnevas ehhiaatsiasiidi biosünteesirajas. , spekuleeritakse, et pärast põuastressi allutamist mobiliseerivad organismid eelistatult primaarse metabolismiga seotud geene, et saavutada aktiivsete doonorite kogunemine ja seejärel saavutada metaboolsete saaduste oluline sekundaarne metabolismi akumulatsioon.

5 CtSus valgu kolmemõõtmelise struktuuri uuring ja peamiste aktiivsete saitide analüüs

Tuginedes CtSus funktsioonile glükosüüldoonori UDP-glükoosi tootmise katalüüsimisel, uuriti täiendavalt CtSus katalüütilise aktiivsuse struktuurset alust. Valgu sekundaarse struktuuri ennustamiseks kasutati veebipõhist tööriista SOPMA. Tulemused näitasid, et CtSus sekundaarstruktuur sisaldas 55,28% -heelikseid, 25,47% juhuslikke mähiseid, 12,80% pikendatud ahelaid ja 6,46% -pöördeid (joonis 5A), mis näitab, et -heeliksid on CtSus valgu kõige olulisemad sekundaarsed struktuuriüksused. järgnevad juhuslikud mähised, mis moodustavad samuti suure osa valgust. Laiendatud ahelad ja -pöörded jaotuvad kogu valgu ulatuses. Olemasolevate uuringute kohaselt eksisteerib sahharoosi süntaas tavaliselt tetrameeri kujul, mida peetakse selle aktiivseks vormiks. Seetõttu kasutas see artikkel AlphaFold2 CtSus valgu struktuuri ennustamiseks ja saadi selle valgu tetrameeride kolmemõõtmeline struktuur. PDB (Protein Data Bank) andmebaasi võrdlus näitas, et Arabidopsis thaliana sahharoosi süntaasi AtSus1 (PDBID 3S28) ja CtSus järjestuste sarnasus võib ulatuda 77, 93% -ni. Prognoositavat CtSus struktuuri võrreldi AtSus1 kolmemõõtmelise struktuuriga ja ruutkeskmise kõrvalekalde (RMSD) väärtus pärast valgu superpositsiooni oli 1, 11 Å, mis näitab, et nende kahe ruumilised struktuurid on väga järjepidevad (joonis 5B).

Joonis 5 CtSus'i struktuuriuuring. V: CtSus'i prognoositud sekundaarstruktuur SOPMA.Blue'i abil: helix; Lilla: juhuslik mähis; Punane: pikendatud kiud; Roheline: leht. B: AtSus1 (sinine värv) ja CtSus (roheline värv) kolmemõõtmeline struktuuri joondamine. Mõlemad olid näidatud tetrameerina. C: võtmejäägid AtSus1 (sinine värv) ja CtSus (roheline värv koos märgistatud jääkidega) substraadi sidumistaskus; D: UDP ja fruktoosi sidumiskonformatsioonide joondamine AtSus1-s (sinise värviga) ja CtSus-is (rohelise värviga); E: Discovery Studio Clienti analüüsitud 2D diagrammil näidatud UDP ja CtSusi vahelised vastasmõjud

Arabidopsis AtSus1 teatatud valgu-ligandi kristallkompleksi struktuuri koos UDP ja fruktoosiga (PDBID3S29) kasutati mallina [16], et analüüsida CtSus sidumisviisi UDP ja fruktoosiga. Molekulaarse dokkimise tulemused on näidatud joonisel 5C. Võib täheldada, et AtSus1 ja CtSus substraadi sidumistaskud on aminohapete tüübi, ruumilise jaotuse ja konfiguratsiooni poolest väga sarnased ning kattumine on suur, mis tõestab, et sahharoosi süntaasi järjestus on taimedes väga konserveerunud. Kahe ligandi, UDP ja fruktoosi konformatsioonid valgu substraadi sidumistaskus on näidatud joonisel fig 5D. UDP ja CtSus molekulaarse dokkimise kõige soodsam konformatsioon kattub hästi UDP konformatsiooniga AtSus1-UDP kristallikompleksis, mis tõestab molekulaarse dokkimise tulemuste täpsust. Interaktsioon UDP ja peamiste aminohappejääkide vahel valgu substraadi sidumistaskus on näidatud joonisel fig 5E. UDP ja CtSus on omavahel seotud peamiselt vesiniksidemete ja hüdrofoobsete interaktsioonide kaudu. Peamised aminohappejäägid substraadi sidumistaskus hõlmavad Leu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 ja Glu681.

Arutelu

Glükosüülimise modifitseerimine on üks olulisi vahendeid looduslike saaduste või ravimite lähteainete füüsikaliste omaduste ja bioloogilise aktiivsuse parandamiseks. Võrreldes traditsiooniliste keemiliste meetoditega on ensümaatilise glükosüülimise modifikatsiooni eelised pehmed reaktsioonitingimused, tugev selektiivsus ja keskkonnasõbralikkus. Glükosüültransferaasi glükosüülimisreaktsioon nõuab aga suurt hulka UDP-suhkru doonoreid, mis on kallid ja raskesti kättesaadavad, mistõttu glükosüültransferaase ei saa tööstuslikus tootmises laialdaselt kasutada. Sahharoosi süntaas võib katalüüsida pöörduvat reaktsiooni: sahharoos + UDP ⇌ UDP-glükoos + fruktoos ja võib glükosüültransferaasiga sidestusreaktsiooni kaudu moodustada taastuva UDP-glükoosi tsükli. Cistanche tubulosa on rikas mitmesuguste erinevat tüüpi glükosiidühendite poolest, mida esindavad fenüületanoolglükosiidühendid, mis viitab sellele, et aktiivsel glükosüüldoonori sünteesirajal tema kehas, mis hõlmab sahharoosi süntaasi, on tugev metabolism, kuid Cistanche taimedelt pärit asjakohasel sahharoosi süntaasil ei ole. teatatud. Selles uuringus klooniti esimest korda Cistanche tubulosast sahharoosi süntaasi geen CtSus. Selle geeni poolt kodeeritud valk sisaldab taime sahharoosi süntaasi konserveerunud domeeni. Võrreldes teiste taimede sahharoosi süntaaside järjestust, leiti, et aminohappejärjestuse sarnasus selle ja sama järgu taimede sahharoosi süntaaside vahel oli üle 90%, mis viitab taimede sahharoosi süntaaside järjestuse kõrgele säilivusele. Molekulaarevolutsiooni analüüs näitas, et CtSus kuulub kaheiduleheliste taimede sahharoosi süntaasi harusse ja on kõige tihedamalt seotud Orobanchaceae perekonna P. ramosa sahharoosi süntaasi PrSus-ga.

CtSus-i katalüütilise aktiivsuse uurimiseks ühendas see uuring glükosüültransferaasi UGT71BD1, mille aktiivsust uurimisrühm on varem kontrollinud, et konstrueerida kahe plasmiidi koekspressioonisüsteem. Täisrakuliste katalüütiliste katsete abil saavutati tingimused ilma täiendavate UDP-suhkru doonorite lisamiseta. Kumariiniühendi kaneeli ja stilbeeniühendi resveratrooli glükosüülimisreaktsioon. Võrreldes kontrollrühmaga suurendas CtSus-i lisamine oluliselt UGT71BD1-katalüüsitud glükosüülimisreaktsioonide konversioonikiirust. Selle põhjal konstrueeriti selles uuringus CtSus rekombinantne ekspressiooniplasmiid ja saavutati rekombinantse valgu lahustuv ekspressioon E. coli-s. In vitro näitavad ensümaatilised katalüütilised reaktsioonid, et sahharoosi ja UDP juuresolekul võib CtSus katalüüsida UDP-glükoosi teket ning pärast rekombinantses valgus sisalduva trigerfaktori afiinsusmärgise eemaldamist katalüüsib CtSus produkt UDP teket. - saadakse glükoos. Määr on oluliselt paranenud. Terve raku transformatsiooni ja in vitro ensümaatilise katalüütilise reaktsiooni tulemused kinnitasid CtSus aktiivsust sahharoosi süntaasi katalüütilise aktiivse suhkru doonori UDP-glükoosina. CtSus geeni ja glükosiidide biosünteesi vahelise seose edasiseks uurimiseks Cistanche tuberosumis analüüsiti CtSus ekspressiooni Cistanche tuberosumi erinevates osades reaalajas fluorestsents-kvantitatiivse PCR katsetega. Tulemused näitasid, et geen ekspresseeriti Cistanche tuberosumi haustorias. Kõrgeim väljendustase. Cistanche deserticola on parasiitaim ega saa fotosünteesi kaudu kasvuks ja arenguks vajalikke toitaineid. Seetõttu peab see parasiitma peremeestaime juurtel ja toetuma peremeestaimele, et saada toitaineid kasvu säilitamiseks. Taimedes annab sahharoos enamasti energia- ja süsinikuallika doonoreid [12]. Kuid sahharoosi ei saa rakud otse kasutada ja see vajab täiendavat lagunemist. Haustoria on sild, mis ühendab Cistanche deserticola ja peremeestaime ning mängib selle kasvuprotsessis üliolulist rolli. ülioluline

[25], seetõttu on sahharoosi süntaasi kõrge ekspressioon Cistanche deserticola haustorias mõistlik. CtSus'i kõrge ekspressioon haustorias on kooskõlas ka fenüületanoidglükosiidide suure akumulatsioonimustriga haustorias. Lisaks leiti fluorestsents-kvantitatiivse PCR-analüüsiga CtSus geeniekspressioonitasemete muutuste kohta Cistanche deserticola suspensioonirakkudes põuastressi erinevatel ajahetkedel, et põuastress võib oluliselt suurendada CtSus geenide ekspressiooni suspensiooni rakuliinis, mis on kooskõlas ehhiaatsiaga. Suspensioonirakuliinide akumulatsioonimuster põua stressi all on ühtlane. Ülaltoodud tulemused viitavad sellele, et CtSus osaleb fenüületanoidglükosiidide biosünteesi rajas, mida esindab ehhiaatsia Cistanche tulipisis in vivo. See on üks paljudest biosünteesi radadest. Esimese etapi glükosüülimisreaktsioon annab aktiivse glükosüüldoonori UDP-glükoosi. Lühidalt, see uuring

Uuringus tuvastati Cistanche deserticola uus sahharoosi süntaasi geen, mis võimaldas aktiivsete glükosüüldoonorite in vitro ensümaatilist sünteesi ja andis uusi geneetilisi elemente insenerbakterite ehitamiseks Cistanche deserticola glükosiidide biosünteesiks.

Autori panus: Tian Weisheng vastutas bioinformaatika analüüsi, ekspressioonianalüüsi, ensüümi aktiivsuse analüüsi ja CtSus geeni esimese mustandi kirjutamise eest; Yan Yaru vastutas geenide skriinimise ja kloonimise eest; Cui Xiaoxue ja Huang Wenqian osalesid bioinformaatika analüüsis ja ekspressioonianalüüsis; Wang Yingxia ja Zhao Saijing osalesid vektori ehituses ja ensüümi aktiivsuse analüüsis; Li Jun ja Shi Shepo juhtisid peamiselt ensüümi aktiivsuse analüüsi ja ekspressioonianalüüsi; Tu Pengfei ja Liu Xiao vastutasid paberi idee kujundamise, eksperimentide juhtimise ning paberi kirjutamise ja läbivaatamise eest. Kõik autorid osalesid töö redigeerimises.

Viited

[1] Laul ZH, Lei L, Tu PF. CistancheHoffingi taimede farmakoloogilise aktiivsuse uurimise edusammud. et link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ jt. Kultiveeritud ja metsiku Cistanchetubulosa keemia võrdlus, kasutades 1H-NMR spektroskoopiat [J]. Hiina J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Laul Y, Zeng K, Jiang Y jt. Cistanches Herba, alates ohustatud liigist kuni suure Hiina meditsiini kaubamärgini [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.[4] Liu Y, Wang H, Yang M jt. Cistanche deserticola polüsahhariidid kaitsevad PC12 rakke OGD/RP-indutseeritud vigastuste eest [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X jt. Taimsete nukleotiidide ja suhkrute vastastikuse konversiooni ensüümide evolutsioon [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Taimede nukleotiidide suhkru moodustumine, vastastikune muundamine ja päästmine suhkru ringlussevõtu teel [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. Escherichia coli O86:B7 [J] UDP-GlcNAc/Glc4-epimeraasi biokeemiline iseloomustus. Biochemistry, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr jt. UDP-N-atsetüülglükoosamiin4-epimeraasi tuvastamine, mis osaleb Bacillus anthracis [J] eksosporiumi valgu glükosüülimises. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Sahharoosi süntaasi geenide transkriptoomiline tuvastamine Ornithogalumcaudatum [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M jt. Sahharoosi süntaas: ainulaadne glükosüültransferaas biokatalüütilise glükosüülimise protsessi arendamiseks [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.[11]Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Sahharoosi biosüntees [J]. J Biol Chem, 1955, 214: 149-155.