Stx2 kutsub esile diferentsiaalse geeniekspressiooni ja häirib ööpäevase rütmi geene proksimaalses torukeses Ⅱ

3. Arutelu

3.1. Proksimaalne torukujuline patoloogia STEC-patsientidel ja loommudelitel

Oliguuria on märkäge tubulaarnekroos(ATN). ATN-i tõttu ummistavad libisenud epiteelirakud tuubulite valendikku, et vähendada vedeliku voolu, mis ilmneb oliguuriana. STEC-patsientidel on oliguuria ja anuuria sageli leiud, mis viitavad ATN-ile. Proksimaalsete tuubulite funktsiooni vähenemist STEC-i nakkushaiguse varasemates staadiumides on näidatud 2MG ja NAG suurenemisena uriinis [3,33]. B2MG on 12 kDa väike valk, mis filtreeritakse vabalt läbi glomerulite ja imendub terves olekus täielikult proksimaalsetesse tuubulitesse. Kuid kui proksimaalsed tuubulid on kahjustatud, suureneb 2MG kogus uriinis, toimides seega proksimaalse tubulaarse funktsiooni biomarkerina. NAG on suur 130 kDa suurune lüsosomaalne ensüüm ja peamine glükosidaas proksimaalses tuubulis. Suure suuruse tõttu ei saa glomerulus NAG-i filtreerida, samas kui kahjustatud proksimaalsed tuubulid eritavad NAG-i uriiniga. Seega on NAG-i suurenemine uriinis teine ​​​​biomarker proksimaalse tubulaarse kahjustuse jaoks. Glomerulaarne histopatoloogia, nagu fibriiniga ummistunud kapillaarid, on STEC patsientide sagedane avastus; ülaltoodud uriiniandmed viitavad siiski proksimaalsele torukujulisele kahjustusele varasema haiguse korral. Samuti sisaldab STEC-patsientide uriin torukujulisest epiteelist koosnevaid kipsi, mis on tingitud kahjustatud proksimaalsete torukujuliste rakkude hõrenemisest [1]. Loommudelites leitakse proksimaalsete torukujuliste rakkude hõrenemist sageli nii STEC-nakkuse kui ka Stx-i süstimismudelites [25–27,34]. Käesolevas uuringus avastasime Stx2-süstitud hiire neerudes proksimaalsete tubulaarsete rakkude hõrenemise, mis viitab Stx2-indutseeritud proksimaalsele tubulaarsele muutusele (joonis 1). Samuti tuvastasime Stx2 retseptori Gb3 nii hiirel kui kainimese neeru proksimaalsed tuubulidluminaalse külgekspressiooniga, mis näitab Stx2 otsest interaktsiooni proksimaalsete tuubulitega (joonised 2 ja 3). PDK4 fosforüülib püruvaatdehüdrogenaasi, et inhibeerida selle aktiivsust, mille tulemuseks on glükoosi kasutamise vähenemine ja rasvade metabolismi suurenemine vastuseks pikaajalisele paastumisele ja nälgimisele. See kaitseb eraldunud epiteelirakke irdumisest põhjustatud rakusurma (anoikide) eest [35]. PDK4 tipp oli algselt 4 tunni pärast, seejärel teine ​​​​piik 8 tunni pärast (joonis 5A). Seda vähendati 12 tunni pärast, kuid sealt tõusis see järk-järgult kuni 72 tunnini log2-kordse muutusega ja lõppes 3-ga (12-kordne muutus) (joonis 5A). Epiteelirakkude eraldumine toimus Stx{16}}süstitud hiire proksimaalsetes torukujulistes rakkudes (sloughing), mille morfoloogia oli suhteliselt terve (joonis 1), see võib peegeldada PDK4 ülesreguleerimist.

CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKTIPULBER NEERUTELE

Kuna NHERF1 (SLC9A3R1) aitab kaasa rakkude normaalsele kinnitumisele rakuvälise maatriksiga [36], aktiini tsütoskeleti korraldusele ja raku morfoloogia säilitamisele, võib selle geeni vähenenud ekspressioonil olla tagajärjed, näiteks rakkude lagunemine (joonis 5K).

Stx2 mõju proksimaalsetele tuubulitele näib STEC-i nakkushaiguse puhul nii oluline tegur; geeniekspressiooni muutused, mis keskendusid in vivo proksimaalsetele torukujulistele rakkudele, ei olnud aga varem saadaval. Keepers et al. [37] näitas Stx2+LPS-iga süstitud hiirte neerudes erinevalt ekspresseeritud geene (DEG-d), nii et enamik varasemaid ja suures osas muudetud geene olid tingitud LPS-i mõjust ja geenid, mida muudeti väga hilja, pärinevad Stx2-efektist. . Nende andmed näitasid väärtuslikku teavet neerude diferentsiaalsete geeniekspressioonide kohta, kuid ei eraldanud selle muutuse eest vastutavaid rakutüüpe. Käesolevas uuringus püüdsime otsida DEG-sid, mis on seotud proksimaalsete torukujuliste rakkudega, võrreldes hiire mikrokiibi andmeid.neeru ja inimese primaarne proksimaalne tubulaarnerakud, mida töödeldi Stx2-ga.

3.2. Stx{2}}indutseeritud patoloogiaga seotud proksimaalsed torukujulised tegurid seoses teadaolevate Stx2 aktiivsustega Gb3 ekspresseerivates rakkudes

3.2.1. Aktiivsus (I), Gb3-ga seonduva Stxs-i poolt indutseeritud signaaliülekanne

Stx-de B-subühikud kutsuvad esile mitte-retseptori src türosiinkinaasi Jah fosforüülimise [4]. Fosforüülitud Jah aktiveerib oma kinaasi aktiivsuse kaudu allavoolu signaalimolekule ja viib tsütoskeleti ümberkujunemiseni [5]. On teada, et Jah-seotud valgu (YAP) fosforüülimine Y357-s indutseerib YAP tuuma translokatsiooni, kus see toimib transkriptsioonilise kaasaktivaatorina sihtgeenide, näiteks CTGF-i indutseerimiseks [38]. Matritsellulaarsed valgud CYR61 (CCN1) ja CTGF (CCN2) sekreteeritakse ekstratsellulaarsesse maatriksisse (ECM) ja aitavad kaasa raku-ECM adhesiooni säilitamisele, sidudes retseptori integriine ja raku pinnale kinnitatud heparaansulfaatproteoglükaane (HSPG) [39, 40]. CCN1 ja 2 transkriptsiooni võtmemolekul on YAP ja seda hoitakse passiivsena (fosforüülitud seriinijäägis 127) normaalses olekus Hippo signaaliraja all. Kui tuvastatakse madal raku-raku adhesioon, ei fosforüülita YAP (S127) enam, võimaldades sellel tuuma siseneda ning CCN1 ja 2 transkriptsioon suureneb [41–43]. CCN1 ja 2 toimivad haavu parandavate molekulidena, et parandada rakkudest kadunud kude [38,44]. Meie andmekogumis olid CCN1 ja 2 väikesed piigid varasemal ajahetkel (6 tundi). See võib peegeldada Stx2 seondumisest põhjustatud Yes aktiveerimist. Hilisemate tundide jooksul võis libisemine käivitada täiendava YAP-i aktiveerimise, lülitades välja Hippo signaaliraja, et kutsuda esile CCN1 ja 2 suurem ekspressioon 12 tunni pärast või hiljem (joonis 5C).

3.2.2. Aktiivsus (II), ER-stressi/UPR esilekutsumine

Stx-id jõuavad ER-i, kus lõhustatud A1 fragmendid ja B-subühikud jäljendavad voltimata valke [9, 10, 45, 46]. Glükoosiga reguleeritud valk 78 kDa (Grp78, siduv immunoglobuliini valk (Bip)) kinnitab kolme UPR võtmevalku, inositooli vajavat ensüümi -1 (Ire-1), proteiinkinaasi R-laadset endoplasmaatilist retikulumkinaasi (PERK). ) ja transkriptsioonifaktori 6 (ATF6) aktiveerimine ER-i membraanis normaalses olekus. Kuid Grp78 suurema afiinsuse tõttu voltimata valkude suhtes vabastab see need ankurdatud valgud. ATF6 aktiveeritakse pärast vabanemist ja suurendab CHOP (DDIT3) ja X-boxi siduva valgu 1 (XBP-1) mR NA-sid, samas kui Ire-1 splaissib XBP-1 mRNA, et toota XBP{{ 22}} valku, mis aitab kaasa CHOP (DDIT3) transkriptsioonile. PERK aktiveerimine viib ATF4 aktiveerimiseni, mis suurendab ka CHOP (DDIT3) mRNA-d. Seetõttu on CHOP (DDIT3) mRNA suurenemine UPR-i tunnus [47, 48]. Väidetavalt kutsuvad Stx-id esile UPR-i ja CHOP (DDIT3) on meie andmekogumis ülesreguleeritud (joonis 5D – G).

GDF15 kuulub transformeeriva kasvufaktori beeta (TGF) perekonda. Hiljuti on näidatud, et GDF15 vahendab diabeediravimite metformiinist põhjustatud kehakaalu langust [49]. Metformiini suukaudselt manustatud hiirtel suurenes soolestiku ja neerude GDF15 mRNA, mille tulemuseks oli seerumi GDF15 taseme tõus. Tsirkuleeriv GDF15 toimib ajutüvega piiratud retseptori kaudu, et pärssida toidutarbimist ja vähendada kehakaalu [50]. Metformiini manustatud hiirtel on suurenenud neerude GDF15 vähemalt osaliselt CHOP (DDIT3) regulatsiooni all. Meie Stx2-süstitud hiirte neerude andmekogus suurenes CHOP (DDIT3) algul 4 tunni pärast väga väikese tipuga ja seejärel hakkas tõusma trend 48 tunni suunas, kus see säilitas log{16 }}kordne muutus umbes 1,3 (joonis 5E). STRING klastri analüüsi kohaselt saab GDF15 aktiivset sisendit transkriptsioonifaktoritelt CHOP (DDIT3) ja ATF3 (joonis 5E) [51,52]. Stx2-süstitud hiire kaal hakkas 24 tunni pärast soolalahuse kontrollist vähenema või sellest kõrvale kalduma (joonis S3B). GDF15 mRNA suurenemine neerus 12 tunni pärast võis mõjutada ajutüve toidutarbimist vähendama, mis omakorda ilmnes kaalukaotusena (joonised 5E ja S3B). Kuna GDF15 ekspressioonitase oli 24 tunni pärast jätkuvalt kõrge, langesid hiired jätkuvalt kaalu (joonised 5E ja S3B).

ER-stressi korral vabaneb PERK Grp78-st (Bip) ja oligomeriseerub, et fosforüülida ja inhibeerida eIF2, mis viib globaalse translatsiooni repressioonini, välja arvatud mõned UPR-le reageerivad valgud, nagu ATF4, CHOP ja Grp78. GADD34 (valgufosfataasi 1 reguleeriv alaühik 15A (PPP1R15A)) on üks suurenenud valkudest fosforüülitud eIF2 (eIF2 (P))-ga seotud inhibeerimise all ja meie andmekogumis ülesreguleeritud (joonis 5D, G). GADD34 on valgu fosfataas-1, mis defosforüülib eIF2 (P), et reguleerida negatiivselt UPR-indutseeritud valgusünteesi inhibeerimist [53]. GADD34 (PPP1R15A) avaldis muutub log2-kordseks muutuseks suuremaks kui 1 pärast 12-tunnist Stx2-st meie andmestikus ja jätkab suurenemist kuni 24 tunnini, kui see platooneb (log2-kordne muutus võrdub 2,1-ga) ja säilitab selle lõpuni (joonis 5D,G). See viitab sellele, et Stx{32}}indutseeritud UPR andis 12 tunni pärast negatiivset tagasisidet. CHOP-i (DDIT3, GADD153) suurenenud transkriptsioon ja translatsioon on ER-stressi tunnus ja diferentsiaalne ekspressioonimuster sarnaneb GADD34-ga, välja arvatud juhul, kui log2, mis on suurem kui 1, ilmneb 24 tunni pärast ja seejärel järk-järgult platood (log2 võrdub 1, 3) (joonis 5D, G). Samuti on meie andmekogumis ülesreguleeritud CEBPB, CHOP-i domineeriv dimeriseeriv partner (joonis 5D, G). Need tulemused viitavad sellele, et kuigi Stx2-indutseeritud ER-stress algab aja jooksul väga varakult, suurendab see mõju kuni 24 tunnini ja säilitab selle ER-stressi taseme lõpuni, samal ajal kui ka negatiivse tagasiside haru tasakaalustab end samal ajal.

3.2.3. Aktiivsus (III), ribosoomi inaktiveeriva valgu (RIP) aktiivsus

Lõhutades adeniini rRNA-st, inhibeerivad Stx-id de novo valgusünteesi. Depurineeritud rRNA mõjutab ribosomaalse morfoloogia muutumist, mis aktiveerib signaaliülekande [11], mida nimetatakse ribotoksiliseks stressireaktsiooniks (RSR), mis viib iseloomuliku geeniaktivatsioonini (vt järgmist lõiku).

3.2.4. Aktiivsus (IV), Ribotoksilise stressireaktsiooni (RSR) aktiivsus

ZAK (MAPKKK) on RSR-is tuntud kinaas ja see aktiveerib allavoolu JUN N terminaalse kinaasi (JNK) ja p38 MAPK radu [12,15]. Stx1 indutseerib JUN ja FOS mRNA ekspressiooni inimese sooleepiteelirakkudes ja see sündmus nõudis RIP aktiivsuspositiivset Stx1, mis arvatakse olevat RSR kontrolli all [15]. Teine RSR-i allavoolu molekul, p38 MAPK, indutseerib teadaolevalt varajase reaktsiooni geene, nagu JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 ja ATF3 [54], mis kõik olid meie andmekogumis erinevalt ekspresseeritud. Samuti on teada, et JNK ja p38 MAPK rajad aktiveeritakse UPR-i all Ire{13}} allavoolu sündmustena (joonised 4B, D ja 5B, E, F) [47]. Seetõttu võivad Stx-id aktiveerida need kaks rada läbi RSR-i ja/või UPR-i. Samuti on näidatud, et ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaasi (ERK) 1/2 rada asub RSR-ist allavoolu [55] ja DUSP1 (MKP1) geen on teadaolevalt indutseeritud ERK1/2 raja kaudu [56]. Stx1 ja anisomütsiin (teine ​​valgusünteesi inhibiitor) on võimelised indutseerima DUSP1 ekspressiooni Caco-2 rakkudes [57]. Meie andmekogumis indutseeriti DUSP1 ekspressioon ja see võib viidata ERK1 / 2 aktiveerimisele (joonis 4B, D).

3.2.5. Aktiivsus (V), konkreetne geenide transkriptsioon, mis viib tsütokiinini

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 vastavalt 24 ja 48 tunni pärast (joonis 5F). See viitab sellele, et indutseeritakse mõlema NF-κB raja, IκB (klassikaline) ja RelB (alternatiivne) mütsigeenid. Kuna CHOP (DDIT3) diferentsiaalne ekspressioon ületab 24 tunni pärast log2 suuremat kui 1, läbib hiire neer UPR, seega aktiveeritud PERK fosforüülib eukarüootse translatsiooni initsiatsioonifaktori 2 subühiku alfa (eIF2), et pärssida NFKBIA translatsiooni [60]. Sel põhjusel ei pruugi NFKBIA mRNA suurenemine suurt osa NF-κB rajast pärssida, seega on põletikuliste tegurite transkriptsioon lubatud (joonis 5L).

Sobbe et al. [61] näitas, et nii klassikalised (RelA-p50) kui ka alternatiivsed (RelB-p52) NF-κB rajad olid aktiivsed Stx-ga süstitud hiirtel, tuvastades RelA-sihtmärk-tsütokiinide CCL20, CXCL1 ja CXCL10 ülesreguleerimise, mida ekspresseeriti ka meie rakkudes erinevalt. andmestik (joonis 5L).

3.2.6. Aktiivsus (VI), Stxs-indutseeritud apoptoos

Lõhustatud kaspaas 3 on leitud Stxs-iga seotud rakusurmas [13, 15, 62]. On näidatud, et kaspaas-3 aktivatsioon või apoptoosi indutseerimine Stx-de poolt toimub RSR-i ja UPR-i kontekstis. Stxs-indutseeritud RSR-is on kaasatud nii p38 MAPK kui ka JNK rada [15], samuti teatatakse ERK aktiveerimisest [55]. Teisest küljest on teada, et UPR indutseerib NF-κB, JNK ja p38 MAPK radu. On näidatud, et UPR-i all olev CHOP (DDIT3) osaleb apoptoosis [63] ja seda on näidatud ka Stxs-iga seotud apoptoosis [13]. Samuti on teatatud JNK osalusest UPR-indutseeritud apoptoosis [64]. Meie andmekogumis on RSR-i ja UPR-iga seotud mitmed DEG-d, nagu CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN ja JUNB (joonis 5B, F).

3.3. Tsirkadiaanne düsregulatsioon Stx2 poolt

STEC-HUS patsientidel suureneb seerumi endoteliini-1 (ET-1, EDN1) tase [65]. Samuti indutseerib Stx2 eksperimentaalselt EDN1 ekspressiooni, aktiveerides MAPK-sid hõlmavaid signaaliülekandekaskaade [66], samas kui UPR indutseerib teadaolevalt EDN1 transkriptsiooni [67]. Meie andmekogumis oli Stx2-ravi poolt indutseeritud EDN1 ekspressioon nii hiire neerudes kui ka inimese proksimaalsetes torurakkudes (joonis 5G). Kuna EDN1 geeniekspressioon oli hiire neeru ja inimese proksimaalsete tubulaarsete epiteelirakkude ühine nimetaja, näitab see, et EDN1 ekspressioon esineb vähemalt osaliselt lisaks endoteelirakkudele ka proksimaalsetes tubulaarsetes epiteelirakkudes in vivo. Samuti indutseerib sekreteeritud ET-1 EGR1 ekspressiooni MAPK aktiveerimise kaudu [68]. Meie andmed kinnitavad EGR1 ülesreguleerimist ajastuses, kui EDN1 on ülesreguleeritud (joonis 5H). EGR1 indutseerib ööpäevarütmi võtmeteguri PER1 ekspressiooni [69], kohandades seega teiste ööpäevaste tegurite amplituudi (joonis 5H).

Tsirkadiaanregulatsioonis reguleerib CLOCK-BAML1 (ARNTL) heterodimeer PER1 ja CRY1 üles. Vastutasuks seostub PER1-CRY1 heterodimeer CLOCK-BAML1-ga (ARNTL), et pärssida enda edasist transkriptsiooni, luues seega ööpäevarütmis negatiivse ahela. Seega toimuvad positiivsete regulaatorgeenide (CLOCK ja BAML1 (ARNTL)) ja negatiivsete regulaatorgeenide (PER1 ja CRY1) ekspressioonipiigid vahelduva tunni jooksul, nii et kui CLOCK ja BAML1 (ARNTL) ekspressioon suureneb, vähenevad PER1 ja CRY1, ja muster lülitub järgmiste tundide jooksul. Kui lisasime graafikule CLOCK ja BAML1 (ARNTL) log2-kordse muutuse väärtused (joonis 5J), näitasid PER1 ja BAML1 (ARNTL) varasematel ajahetkedel vastupidist rütmimustrit teravate/kitsaste tippudega, 24 h pärast hakkasid piigid aga tuhmiks muutuma ja pidevalt tõusma ilma rütmita. See tähendab, et Stx2 mõjutas neerude ööpäevast rütmi, sealhulgas proksimaalsetes tuubulites. Kuigi on vaja täiendavat kinnitavat katset, viitavad meie andmed koos avaldatud kirjandusega, mis kirjeldavad PER1 toimet neerude ööpäevasele regulatsioonile stiimulitel [70, 71], et Stx2 võib olla seotud ööpäevarütmi häiretega ja mõju proksimaalsetele tubulaarsetele funktsioonidele, vähendades neerukella geene. reguleeritud tegurid, nagu SGLT1 (SLC5A1) (joonis 5K). Tõepoolest, me täheldasime Stx{30}}süstitud hiirtel, kes paljunevad, glükosuuriat teises uuringus Stx1-süstitud hiirtega [21], mis viitab SGLT1 (SLC5A1) düsfunktsioonile proksimaalsetes tuubulites (tabel 3). Meie teadmiste kohaselt on see esimene aruanne, mis näitab Stx2 seotust neerude ööpäevase rütmi häiretega.

4. Järeldused

Me määrasime olulised geenid proksimaalsete tuubulitega seotud ekspressioonide kohta, mida Stx2 muutis. Eeldatakse, et nende geenide erinev ekspressioon tuleneb Stx2 aktiivsusest, nagu UPR induktsioon, rRNA depurinatsiooniga seotud RSR ja plasmamembraani retseptori Gb3 seondumisest põhjustatud signaaliülekanne. Kõige tugevamalt ekspresseeritud geen GDF15 võib mõjutada Stx2 põhjustatud kehakaalu langust ajutüvega piiratud retseptorite kaudu, vähendades toidutarbimist. Ekstratsellulaarset maatriksit ja raku adhesiooni võivad mõjutada PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61 ja CTGF, mis põhjustavad Stx{15}}spetsiifilist histopatoloogiat ja lõtvumist. Veelgi enam, Stx2 poolt põhjustatud neerude ööpäevase rütmi häired võivad põhjustada proksimaalseid tubulaarseid funktsionaalseid defekte, nagu glükoosi reabsorptsioon.

5. Materjalid ja meetodid

5.1. Loomad Hiired

(C57BL/6, isane, 19–22 g, spetsiifilise patogeenivaba) osteti ettevõttelt Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Jaapan). Toitu ja vett anti ad libitum. Hiiri hoiti standardse 12-tunnise: 12-tunnise hele-pimeduse tsükliga, kus valgus süttib kell 7.00 ja kustub kell 19.00. Loomade toatemperatuuri hoiti umbes 24 °C. Kõik protseduurid kiitis heaks ülikooli loomade hooldamise komitee.

5.2. Inimese neerukude

Selles uuringus kasutati ilma isikuidentifikaatoriteta surnukeha kudet ja see loetakse ülikooli inimuuringute juhiste kohaselt erandiks.

5.3. Rakukultuur

Inimese neeru proksimaalsete tubulaarsete epiteelirakkude (RPTEC) primaarne kultuur osteti ettevõttest Clonetics (Walkersville, MD, USA) ja seda hoiti temperatuuril 37 °C, 5% CO2 atmosfääris. Rakke kultiveeriti neeruepiteelirakkude kasvusöötmes, millele oli lisatud inimese epidermise kasvufaktorit, hüdrokortisooni, epinefriini, insuliini, trijodotüroniini, transferriini, GA-1000 ja FBS-i.

5.4. LPS-vaba Stx2 puhastamine LPS eemaldamine Stx2-st viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [72]. Lühidalt, Stx2 fraktsiooni saamiseks kasutati anti-Stx2 11E10 antikehaga konjugeeritud kolonni ja fraktsioon lasti seejärel läbi Detoxi-geeli (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA). LPS-i eemaldamiseks. Stx2 fraktsioon filtriti 0,2 µm filtriga ja LPS taset testiti Limulus amebocyte lysate testiga (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, USA). Määrati, et Stx2 fraktsioon sisaldab vähem kui 0,03 endotoksiini ühikut (EU)/ml. Stx2 variandi tüüp oli Stx2a.

5.5. Stx2 manustamine hiirtele 2LD50 annus (5 ng Stx2/20 g kehamassi kohta), mis tapab hiired nelja päeva jooksul (joonis S3A), süstiti hiirtele intraperitoneaalselt 0,1 ml mahus LPS-i vabas soolalahuses. (Otsuka farmaatsia, Jaapan). Toksiini süstimine tehti kella 7 ja 9 vahel, mille käigus pikema aja jooksul hiired said Stx2 kell 7 ja sellele järgnes 24, 48 ja 72 h proovide võtmine kell 7 hommikul.

5.6. Uriini kogumine ja uriini glükoosisisalduse mõõtmine Pärast 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60 ja 84 tundi Stx2 süstimist võeti uriin ja 10 µL tilguti Fuji kuivkeemilisele slaidile GLU- P III (FUJIFILM, Kanagawa, Jaapan) ja uriini glükoosisisaldust mõõdeti seadmega Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) juhitavas rajatises. Stx2-eelsest süstimisest saadud uriini kasutati 0-tunnise proovina. Uriini kogumine viidi läbi kahe hiirega

5.7. Kudede töötlemine Pärast 2-, 4-, 6-, 8-, 12-, 24-, 48- ja 72-tunnist Stx2 süstimist surmati CO2-ga kolm hiirt ajapunktis ja neerud koguti. Pool ühest neerust fikseeriti 4% paraformaldehüüdi/fosfaatpuhverdatud soolalahusega 7 päeva jooksul temperatuuril 4 °C ja töödeldi parafiini sektsiooni jaoks. Veel pool neerust kasutati RNA ekstraheerimiseks mikrokiibi analüüsiks. Kolme ravita hiirt kasutati normaalse (naiivse või 0 h) kontrollina. Kolmele hiirele süstiti PBS-i (vehiikul) ja surmati 72 tunni pärast ning neid kasutati vehiikli kontrollina, et näidata, et geeniekspressioonides on normaalse kontrolliga võrreldes tühiseid muutusi.

5.8. Perioodilise happe-Schiffi (PAS) värvimise parafiini sektsioonid hüdreeriti ja värviti 0,5% perioodilise happe lahusega, millele järgnes loputamine destilleeritud veega. Sektsioonid viidi üle Schiffi reaktiivile. Pärast lõikude põhjalikku pesemist 0,6% naatriumvesiniksulfiti lahusega värviti need hematoksüliiniga.

5.9. Stx2 töötlemine inimese RPTEC-is RPTEC rakke töödeldi 10 ng/ml Stx2-ga 6, 13 ja 19 tundi temperatuuril 37 °C, 5% CO2. Kontrollina kasutati RPTEC-d ilma Stx2-ravita. Ajapunktis tehti kaks bioloogilist koopiat. Pärast PBS-ga pesemist kasutati rakke RNA ekstraheerimiseks.

5.10. Vabalt ujuv immunofluorestsentsvärvimine Vaba ujuva lõigu töötlemiseks perfuseeriti ja fikseeriti tavaline hiir, nagu on kirjeldatud artiklis Obata et al. [69]. Seejärel lõigati hiire neerud lahti ja sukeldati õrnalt loksutades 4% PFA/PBS-i 3 tunniks temperatuuril 4 °C. Kudesid pesti PBS-ga ja külmkaitseti 30% sahharoosi/PBS-iga temperatuuril 4 ◦C üleöö või kuni põhja vajumiseni. Paksud külmutatud lõigud (50 µm) lõigati külmutatud seadistustega libiseva mikrotoomiga. Sektsioonid blokeeriti 1:50 kitse rotivastase IgM antikehaga PBS-is (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, USA) 1 tund ja inkubeeriti blokeerimisel anti-Gb3/CD77 antikehaga 1:100. lahus või isotüübi kontroll (roti IgM) sobivas kontsentratsioonis primaarse antikehana üleöö temperatuuril 4 ◦C. Pärast pesemist inkubeeriti sektsioone sekundaarse antikehaga (rotivastane IgM Alexa Fluor 488, 1:2000 lahjendus PBS-is) 2 tundi temperatuuril 4 °C. Sektsioonid värviti teiste sondide AQP1 (lahjendus 1:1000, Sigma-Aldrich Jaapan, Tokyo, Jaapan) ja CD31 (550274, 1:50 lahjendus, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) jaoks sekundaarsete küüliku IgG Alexa-vastaste antikehadega. Vastavalt Fluor 546 (1:2000 lahjendus PBS-is) ja hiirevastane IgG Alexa Fluor 647 (1:2000 lahjendus PBS-is). Pärast PBS-iga pesemist värviti 40 µl 6-diamidino-2-fenüülindooliga (DAPI, D21490, Thermo Fisher) 15 minutit temperatuuril 4 °C. Iga kord, kui lahust vahetati, kasteti lõigud vedelikesse 96-kaevuplaadi süvendis (U-kujuline) koos väikese õhetusega. Pesemisetapp viidi läbi suuremates süvendites, nagu 12- või 6-kaevuplaatidel. Katteks kasutati veepõhist kinnitusvahendit. Inimese kudede ettevalmistamiseks fikseeriti surmajärgne neer 20% formaliinis 2 nädala jooksul ja töödeldi vabalt hõljuvaks ettevalmistuseks, nagu tehti hiire koe puhul, välja arvatud inimese CD31-vastane antikeha (CBL468, 1:20 lahjendus, Merck KGaA, Darmstadt , Saksamaa) kasutati.

5.11. Mikrokiibi analüüs

Pool neerust sukeldatakse 2 ml RNALaterisse (Ambion, Austin, TX, USA) temperatuuril 4 °C ja kogu RNA ekstraheeriti komplektiga Rneasy Midi (Qiagen, Santa Clarita, CA, USA). Kasutati hiire genoomi 430A 2.0 massiive (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA). CEL-failid saadi ja normaliseeriti tugeva mitme kiibi keskmistamise (RMA) abil, RNA koopiate arvu arvutamine ja voltimismuudatused 0 h suhtes viidi läbi R-s (v.3.6.0) koos selle paketiga. affy [73] ja RankProd 2.0 [74]. Andmed kuvatakse log2-kordade muutuste väärtustes. Andmekogum deponeeritakse Gene Expression Omnibusile (GEO) (juurdepääsunumber GSE172465). RPTEC rakkudest ekstraheeriti kogu RNA RNAgents Total RNA Isolation Systemiga (Promega, Tokyo, Jaapan). Mikrokiibi katseteks kasutati inimese terve genoomi oligonukleotiidi mikrokiibi (44K oligonukleotiidi DNA mikrokiibi, Agilent Technologies, Tokyo, Jaapan). Kogu RNA proove kasutati Cy5- ja Cy3- märgistatud cDNA sondide valmistamiseks. Fluorofooriga märgistatud proovid hübridiseeriti igal slaidil ja pesti, seejärel skaneeriti DNA mikrokiibi skanneriga (mudel G2505A; Agilent Technologies). Funktsioonide ekstraheerimise ja pildianalüüsi tarkvara (Agilent Technologies) kasutati massiivi iga punkti leidmiseks ja piiritlemiseks ning intensiivsuste integreerimiseks, mis seejärel filtreeriti ja normaliseeriti, kasutades lokaalselt kaalutud hajuvusdiagrammi silumismeetodit. Mikrokiibi analüüsi reprodutseeritavust hinnati igas katses kahe värvivahetuse kordusega. Võrreldi mRNA ekspressiooni erinevusi kontrolli ja Stx{22}}-ga töödeldud RPTEC-i vahel, mis koguti 6, 10 või 19 tunni pärast. GeneSpringi tarkvara TXT-vormingus andmeid kasutati geeninimede määramiseks sondi ID-st ja voltimismuudatuste teisendamiseks logi{26}}voldimuutusteks. Andmekogum deponeeritakse GEO-le (juurdepääsunumber GSE172466).

5.12. Mikrokiibi andmete bioinformaatiline analüüs ja visualiseerimine Nii hiire neerude kui ka RPTEC mikrokiibi andmetes vähenesid või suurenesid geenid, mis on mõlemale ühised ja mille ekspressioonimuutus oli rohkem kui 2-kordne (või log2-kordne muutus). on kas väiksem kui –1 või suurem kui 1) mis tahes ajahetkel valis R. Veelgi enam, hiire neerude mikrokiibi andmed. Kuupkõveratele sobivad geenimuutused valiti R-paketi maSigPro abil [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/maSigPro.html (viimati juurdepääs 4. jaanuaril 2022)] [75]. Kuupkõver sobib nende geenide suurenemise või vähenemisega aja jooksul. Kõrgem polünoomiaste, näiteks kuupkõver, võimaldab paremini valida geene, millel on aja jooksul mitu muutust, paremini kui ruutkõver. Sarnase trajektoori järgi käitunud geenid rühmitati ja nende vähenemise/suurenemise mustrid visualiseeriti soojuskaardiga, kasutades R-paketi gplote [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (viimati juurdepääs 4. jaanuaril 2022)] [76]. Geeniontoloogia (GO) määrati ja GO funktsioone tavaliste geenide hulgas rikastati, kasutades Metascape'i [http://metascape.org (viimati kasutatud 4. jaanuaril 2022)] [77]. Tavaliste geenide seoseid/seoseid analüüsiti STRING abil [https://string-db.org/ (viimati kasutatud 4. jaanuaril 2022)] [78]. Levinud geenide vahelist seost otsiti nii käsitsi kui ka STRING tekstikaevandamise funktsiooni abil.

Viited

1. Gianantonio, C.; Vitacco, M.; Mendilaharzu, F.; Rutty, A.; Mendilaharzu, J. Hemolüütiline-ureemiline sündroom.J. Pediatr.1964, 64, 478–491. [CrossRef] 

2. Vitsky, BH; Suzuki, Y.; Strauss, L.; Churg, J. Hemolüütiline-ureemiline sündroom: neerupatoloogiliste muutuste uuring.Olen. J. Pathol.1969, 57, 627–647. 

3. Takeda, T.; Dohi, S.; Igarashi, T.; Yamanaka, T.; Yoshiya, K.; Kobayashi, N. Verotoksiini poolt põhjustatud tubulaarfunktsiooni kahjustus aitab kaasa hemolüütilise ureemilise sündroomi korral täheldatud neerukahjustusele.J. Infect.1993, 27, 339–341. [CrossRef] 

4. Katagiri, YU; Mori, T.; Nakajima, H.; Katagiri, C.; Taguchi, T.; Takeda, T.; Kiyokawa, N.; Fujimoto, J. Src perekonna kinaasi aktiveerimine jah, mis on põhjustatud Shiga toksiini seondumisest globotriaosüültseramiidiga (Gb3/CD77) madala tihedusega, detergentides lahustumatutes mikrodomeenides.J. Biol. Chem.1999, 274, 35278–35282. [CrossRef] 

5. Takenouchi, H.; Kiyokawa, N.; Taguchi, T.; Matsui, J.; Katagiri, YU; Okita, H.; Okuda, K.; Fujimoto, J. Shiga toksiini seondumine globotriaosüültseramiidiga indutseerib rakusiseseid signaale, mis vahendavad tsütoskeleti ümberkujunemist inimese neerukartsinoomist pärinevates rakkudes.J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [CrossRef] [PubMed] 

6. Garred, O.; van Deurs, B.; Sandvig, K. Shiga toksiini furiinist põhjustatud lõhustamine ja aktiveerimine.J. Biol. Chem.1995, 270, 10817–10821. [CrossRef] 

7. Majoul, I.; Ferrari, D.; Söling, HD Valkude disulfiidsidemete redutseerimine oksüdeerivas keskkonnas. Kooleratoksiini A-subühiku disulfiidsild väheneb endoplasmaatilises retikulumis.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [CrossRef] 

8. Spooner, RA; Watson, PD; Marsden, CJ; Smith, DC; Moore, KAH; Cook, JP; Issand, JM; Roberts, LM Valgu disulfiidisomeraas redutseerib ritsiini endoplasmaatilises retikulumis A- ja B-ahelateks.Biochem. J.2004, 383, 285–293. [CrossRef] 

9. Yu, M.; Haslam, DB Shiga toksiin transporditakse endoplasmaatilisest retikulumist pärast interaktsiooni luminaalse chaperone'iga HEDJ/ERdj3.Nakata. Immun.2005, 73, 2524–2532. [CrossRef] 

10. Falguieres, T.; Johannes, L. Shiga toksiini B-subühik seondub chaperone BiP ja nukleolaarse valguga B23.Biol. Kamber2006, 98, 125–134. [CrossRef]