Uuring Cistanche Deserticola (Pseudalkalibacillus Sp. A8) endofüütse bakteri soola- ja leelisetaluvuse kohta

 

Abstraktne

Eesmärk:Endofüütsete bakterite isoleerimiseksCistanche deserticolaja uurida võimalikke mehhanisme, mis on aluseks soola-leelise taluvuselePseudalkalibacillussp. A8.
Meetodid:Endofüütsed bakterid eraldati lahjendusplaadistamise meetodil. Tüve A8 klassifikatsioon määrati morfoloogiliste tunnuste ja 16S rRNA geenijärjestuse järgi. Seejärel viidi läbi kogu genoomi järjestamine ja metaboolsed analüüsid.
Tulemused:Värskest isoleeriti viiskümmend endofüütilist bakteritüveCistanche deserticolaproovid, mis hõlmavad 4 sugukonda, 8 klassi ja 35 perekonda. Nende hulgas on tüvi A8 esimenePseudalkalibacillustaimedest eraldatud liigid, millel on erakordne soola-leelisetaluvus. See oli võimeline kasvama pH vahemikus 6,0 kuni 13,0 ja NaCl kontsentratsioonides kuni 17%. Genoomi annotatsioon näitas 10 geeni, mis on seotud soola-leeliseresistentsusega. Metaboolne analüüs kõrge soolsuse ja kõrge pH tingimustes tuvastas 186 erinevat metaboliiti, mis olid rikastatud seitsme funktsionaalse rajaga, mis on seotud soola ja leelise stressiga kohanemisega.
Järeldus:See uuring pakub väärtuslikke mikroobseid ressursse põllukultuuride soola-leelise taluvuse parandamiseks ja pakub teoreetilist tuge soolase ja leeliselise mulla parandamiseks mikroobsete vahendite abil. Samuti loob see aluse soolaleelist taluvate bakterite molekulaarsete mehhanismide mõistmiseks.

Märksõnad: Cistanche deserticola; endofüütsed bakterid; soola-leelise taluvus; kogu genoomi järjestamine; UPLC-MS/MS

 

 

 

Cistanche deserticol lill

Sissejuhatus

Mulla sooldumine ja leelistumine on suured ülemaailmsed väljakutsed, mis aitavad oluliselt kaasa maa degradeerumisele ja kõrbestumisele. Hinnanguliselt mõjutab soolsus erineval määral ligikaudu 20% maailma haritavast maast ning ainuüksi Hiinal on 9,9 × 10⁷ hektarit soolase-leeliselist maad, mis on maailma suurim. Sellistel muldadel on tavaliselt halb läbilaskvus, madal viljakus ja kõva tekstuur, mis kahjustab tõsiselt põllukultuuride kasvu ja saagikust. Seetõttu jääb kriitiliseks probleemiks tõhusate strateegiate väljatöötamine soolase-leelismuldade kasutamiseks ja parandamiseks.

Hiljutised uuringud näitavad, et mikroobsed inokulandid, eriti soolaleelist taluvad tüved, võivad suurendada põllukultuuride taluvust ja parandada mulla omadusi kulutõhusal ja keskkonnasõbralikul viisil. Endofüütsed bakterid – need, mis elavad taimekudedes ilma haigusi põhjustamata, jagavad oma peremeestaimedega ökoloogilisi ja füsioloogilisi tunnuseid.Cistanche deserticolakõrbes elav parasiitaim, mis on tuntud oma äärmise soola-leelisekindluse poolest, on paljulubav allikas stressitaluvate endofüütide eraldamiseks.

Selle uuringu eesmärk on:

Eraldage endofüütsed bakteridCistanche deserticola;

Sõel soolaleelist taluvate tüvede jaoks;

Uurige valitud tüve pingekindluse mehhanismePseudalkalibacillussp. A8 kogu genoomi ja metaboolsete analüüside kaudu.

Cistanche deserticol lill

Materjalid ja meetodid

1.1 Materjalid

Taimeproov: Cistanche deserticolakoguti 2023. aasta märtsis Xiquani linnast, Jingtaixianist, Baiyinist, Gansu provintsist, Hiinast. Tuvastanud prof Guo Yehong, Gansu Põllumajandusülikool.

Meedia:TSB vedel sööde; tahkestatud 20 g/l agariga.

Reaktiivid ja instrumendid:Analüütilise puhtusega NaClO, KH2PO4, K2HPO4, TAE puhver; Agilent QTOF 1290–6542 massispektromeeter, R-1001V pöördaurusti, Neofuge 15R tsentrifuug, SureCycler 8800 gradient-PCR.

1.2 Endofüütsete bakterite eraldamine

VärskeCistanchekude pind steriliseeriti ja homogeniseeriti. Seerialahjendused kanti R2A, TSB, ISP-2 ja 2216E söötmetele. Kolooniad eraldati ja puhastati kolme subkultuuri kaudu, seejärel säilitati 20% glütseroolis temperatuuril -80 °C.

1.3 16S rRNA geeni identifitseerimine

Genoomne DNA ekstraheeriti ja amplifitseeriti universaalsete praimerite 27F/1492R abil. PCR-tooted sekveneeriti ja analüüsiti EzBioCloudi andmebaasi abil.

 

Cistanche alus

Wecistanche'i tugiteenus – koostöö kohta lisateabe saamiseks
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
 

 

1.4 Fenotüübiline ja füsioloogiline iseloomustus

SEM:Pärast kullaga katmist täheldatud rakkude morfoloogiat.

NaCl tolerants:Kasvu hinnati 0–20% NaCl juures.

pH taluvus:Kasv mõõdetuna pH 4–13 juures.

Temperatuurivahemik:Kasvu testitud 4–50 kraadi juures.

1.5 Kogu genoomi järjestamine

Tüvi A8 sekveneeriti PacBio tehnoloogia abil. Genoomi kokkupanek ja annotatsioon viidi läbi kuue suurema andmebaasi (NR, Swiss-Prot, Pfam, EggNOG, GO, KEGG) põhjal. Sõeluti soola-leelise taluvusega seotud geene.

1.6 UPLC-MS/MS analüüs

Proove kultiveeriti kolmel tingimusel:

A: pH 7,2, NaCl 0,5%

B: pH 7,2, NaCl 14%

C: pH 13,0, NaCl 0,5%

Supernatandid kuivatati, lahustati metanoolis ja analüüsiti UPLC-MS/MS abil (ZORBAX Eclipse Plus C18, positiivsete ioonide režiim).

Tulemused ja analüüs

2.1 Endofüütide isoleerimine

Viiskümmend tüve isoleeritiCistanche deserticola, mis kuulub 4 sugukonda ja 35 perekonda.

2.2 Tüve A8 tuvastamine

16S rRNA järjestus näitas 99,30% sarnasustPseudalkalibacillus salsuginis. Fülogeneetiline analüüs kinnitas seda liikmenaPseudalkalibacillus. Morfoloogiliselt olid kolooniad siledad, kollakaspruunid, vardakujulised (1–6 µm), SEM-i all kerge udususega.

Kasvuvahemik:20–45 kraadi (optimaalne: 30 kraadi)

pH vahemik:6–13 (optimaalne: 9,0)

Soola valik:0–17% NaCl (optimaalne: 0–5%)

2.3 Genoomi analüüs

Genoomi pikkus: 6,022,064 bp

GC sisu: 40.99%

Valke kodeerivad geenid: 5,825 (82.5%)

tRNA/rRNA:76 tRNA-d, 24 rRNA-d

ANI väärtused:Kõik<95%, indicating a potential novel species.

COG-i annotatsioon:4683 geeni (80,39%)

Aminohapete transport/ainevahetus (556), süsivesikute metabolism (501), transkriptsioon (464), lipiidide metabolism (440), koensüümide metabolism (298), kaitsemehhanismid (100)

Tuvastatud soola-leelise taluvuse geenid:

Glütsiini/betaiini transportija

Naatriumi sümportija

Antiporterid

F0F1 ATP süntaas

2.4 Metaboolne analüüs

Metaboliidi identifitseerimine:Kokku tuvastati 986 metaboliiti

OPLS-DA analüüs:Selge eraldatus rühmade vahel; R²X > 0,5, R²Y=1, Q² > 0,85,P< 0,005

Diferentsiaalsed metaboliidid:

186 kokku:

B-rühm: 96 (13 ülesreguleeritud, 83 alla reguleeritud)

Rühm C: 132 (41 ülesreguleeritud, 91 alla reguleeritud)

49 ülesreguleeritud nii B- kui ka C-s

196 ainulaadselt ekspresseeritud metaboliiti B & C-s

kokku 246 ülesreguleeritud või ainulaadset metaboliiti

Raja rikastamine (KEGG):

Seskviterpenoidide ja triterpenoidide biosüntees

Puriini metabolism

Lüsiini biosüntees ja lagunemine

Pantotenaadi ja CoA biosüntees

Arginiini ja proliini metabolism

Steroidide biosüntees

Need tulemused viitavad sellele, et tüvi A8 kohandub soola-leelise stressiga nii geneetilise kui ka metaboolse regulatsiooni kaudu.

---

Järeldus

See uuring edukalt eraldas ja tuvastasPseudalkalibacillussp. A8 alatesCistanche deserticola, potentsiaalne uus liik, millel on tugev soola-leelisekindlus. Terve genoomi ja metaboolsete analüüside kaudu on tuvastatud mitmed geenid ja metaboolsed rajad, mis aitavad kaasa selle stressiga kohanemisele. Need leiud annavad teoreetilise aluse mikroobsete ainete väljatöötamiseks põllukultuuride taluvuse parandamiseks ja soolase-leelismuldade taastamiseks.

 

Viited

Wang Y., Wang Y., Zhang Q. jt.Soola-leeliselise pinnase omadused, mida parandavad sünergilised mõjudPriestia aryabhattaiJL-5,Staphylococcus pseudoxylosusXW-4,Leymus chinensisja mulla mikrobiota. International Journal of Molecular Sciences, 2023, 24(9): 7737.

Chen Wentao, Guo Lizhuo, Shan Bin jt.Mullamuudatuste mõju kaera kasvule ja mulla füüsikalistele omadustele soolase-leeliselise maa puhul. Gansu Põllumajandusülikooli ajakiri, 2024, 59(5): 136–144. (hiina keeles)

Lu Yuxin, Yan Hong, Bai Yani jt.Isolatsiooni ja soola-leelise taluvuse mehhanismRhizobiumTüvi BFL-3. Journal of Agricultural Biotechnology, 2023, 31(7): 1501–1512. (hiina keeles)

Yu Jiang, Wang Xinzhen, Wang Chun jt.Soolaleelist taluva aine kasutamineTüvi taimede kasvu soodustamisel ja selle soola-leelise taluvuse geenide kaevandamisel. Mikrobioloogia Hiina, 2024, 51(3): 864–879. (hiina keeles)

Wani Z.A., Ashraf N., Mohiuddin T., et al. Taimede ja endofüütide sümbioos: ökoloogiline vaatenurk. Rakendusmikrobioloogia ja biotehnoloogia, 2015, 99(7): 2955–2965.

Venieraki A., Dimou M., Katinakis P.Ravimtaimedes elavad endofüütsed seened suudavad toota samu või sarnaseid farmakoloogiliselt aktiivseid sekundaarseid metaboliite nagu nende peremeesorganismid. Kreeka taimekaitse ajakiri, 2017, 10: 51–66.

Hiina farmakopöa komisjon.Hiina Rahvavabariigi farmakopöa, I köide. Peking: China Medical Science Press, 2020: 79–80.(hiina keeles)

Fu Kejian, Cui Yonghe, Huang Zhihua jt.Tubaka musta varre patogeeni vastase biotõrjebakterite sõelumine, identifitseerimine ja antagonistlik mehhanism. Lõuna-Põllumajanduse ajakiri, 2023, 54(8): 2245–2256. (hiina keeles)

Hu Chunhui, Xu Qing, Sun Xuan jt.Mitmete tüüpiliste bioloogiliste proovide valmistamismeetodid skaneeriva elektronmikroskoopia jaoks. Hubei põllumajandusteadused, 2016, 55(20): 5389–5392+5402. (hiina keeles)