Abstraktne

Äge neerukahjustus (AKI)on kriitiline seisund, mida iseloomustab kiire langusneerufunktsioonmitmete tegurite, nagu nefrotoksilisuse, sepsise ja isheemia tõttu.Neeruvigastuson pikaajaline ja keeruline protsess, mille esialgsed kahjustused võivad arenedakrooniline neeruhaigusja isegilõppstaadiumis neerupuudulikkus. AKI avaldub neeru parenhüümi kahjustuse, tubulaarse nekroosi ja glomerulaarfiltratsiooni kiiruse vähenemise kaudu, mis põhjustab uriinierituse vähenemist, elektrolüütide tasakaaluhäireid, metaboolsete jäätmete kogunemist ja vere uurea lämmastiku (BUN), seerumi kreatiniini (Scr) ja kusihappe taseme tõusu. AKI esineb sageli osana sellistest kliinilistest sündroomidest nagu südamepuudulikkus või maksapuudulikkus, mõjutades 10–15% haiglaravil viibivatest patsientidest ja kuni 50% intensiivraviosakondadest. AKI kiire algus ja halb prognoos on muutnud selle ülemaailmseks rahvatervise väljakutseks. Praegused lääne meditsiinilised ravimeetodid tuginevad peamiselt toetavale ja asendusravile, mis on kulukas ja annab sageli ebaoptimaalseid tulemusi. Traditsiooniline Hiina ja Mongoolia meditsiin, mis on juurdunud tuhandete aastate pikkusest terviklikust praktikast, pakub mitme eesmärgi, mitme raja ja mitme toimega lähenemisviisi, millel on kõrge tõhusus ja ohutus. Traditsiooniline meditsiin on viimastel aastatel muutunud AKI ravi kuumaks uurimisteemaks. Seega on Cistanche'i sisaldava Mongoolia ravimi mehhanismi uurimine AKI ravis märkimisväärse väärtusega.

Cistanche-põhine Mongoolia liitravim on klassikaline retsept, mis koosnebCistanche, granaatõun, kaneel, pikk pipar (Piper longum), Alpinia officinarum, Amomum villosumjaBorneol. According to traditional Mongolian medical theory, the kidney resides in the "Badagan" position among the five viscera, and kidney diseases are often Badagan-type, triggered by cold. Cistanche-containing formulas, being warm in nature, are believed to expel kidney cold and exert protective effects on renal function, in line with the Mongolian principle of "treating cold with heat." Previous studies have shown that such formulas, when used in combination with other Mongolian medicines, provide kidney protection in AKI models. Based on this, the present study aims to use network pharmacology and experimental validation to explore the bioactive components, therapeutic targets, and key pathways ofTsistanche sisaldav Mongoolia ravim AKI parandamisel, pannes teoreetilise aluse selle kliinilisele rakendamisele ja edasiarendamisele.

 

 

 

cistanche toidulisandidÄgeda neerukahjustusega (AKI) patsiendid

Herb cistanche toidulisandi kohta lisateabe saamiseks klõpsake pilti

 

 

1. Materjalid ja meetodid

1.1 Võrgufarmakoloogia analüüs

1.1.1 Aktiivsete ühendite ja sihtmärkide tuvastamine

Traditsioonilise hiina meditsiini süsteemide farmakoloogia andmebaas (TCMSP)[http://tcmsp-e.com] bioaktiivsete ühendite ja nende sihtmärkide leidmiseks. Sõelumiskriteeriumid olid järgmised:suukaudne biosaadavus (OB) 30% või suuremjaravimisarnasus (DL) Suurem või võrdne 0,18. Cistanche ja kaneeli puhul, millel puuduvad nendele lävedele vastavad komponendid, täiendasime ühendite/sihtmärkide andmeid, kasutades kirjanduse ülevaadet jaSwissTargetPrediction[https://www.swisstargetprediction.ch/]. Kuna borneooli põhikomponent on ammooniumkloriid, jäeti see edasisest analüüsist välja. Kõik kogutud valgu sihtmärgid standarditi vastavaltHomo sapiens geeninimedkasutadesUniProtandmebaas [https://www.uniprot.org].

1.1.2 Liitsihtvõrgu ehitamine

Kogutud andmed korraldati NETWORK ja TYPE failideks ning analüüsiti kasutadesCytoscape 3.9.1Cistanche-põhise Mongoolia meditsiini jaoks ühendi-sihtmärgi interaktsioonivõrgustiku loomiseks.

1.1.3 AKI-ga seotud sihtmärkide sõelumine

AKI-ga seotud sihtmärgid saadi märksõnade "äge neerukahjustus" ja "äge neerupuudulikkus" abil:

GeneCards[https://www.genecards.org/]

OMIM[https://omim.org/]

Terapeutilise sihtmärgi andmebaas (TTD)[https://db.idrblab.net/ttd/]

DrugBank[https://www.drugbank.com/]

PharmGKB[https://www.pharmgkb.org/]

Venni diagrammid loodi veebitööriista [https://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/] abil, et tuvastada andmebaaside vahel kattuvaid sihtmärke.

1.1.4 Põhiühendite ja sihtmärkide tuvastamine, PPI võrgu loomine

KasutadesVõrguanalüsaatorfunktsiooni Cytoscape'is, analüüsisime ühendi-sihtvõrku. Sõlmed koosaste kesksus, vaheline kesksusjaläheduskesksusüle mediaani jakeskmine lühim tee pikkusallpool mediaani, valiti tuumaühendite tuvastamiseks nelja vooru kaudu. Ühendi ja haigusega seotud sihtmärkide vahelised ühised sihtmärgid sisestatiSTRINGandmebaas [https://cn.string-db.org/], mille liigiks on määratud Homo sapiens, et luuavalgu-valgu interaktsioon (PPI)võrku. Võrk eksporditi TSV-vormingus edasiseks analüüsiks Cytoscape'is. Kolm sõeluuringuvooru andsid tulemusepotentsiaalsed sihtmärgid, ja kuus raundi andis tulemusepõhieesmärgid. Thetuum sihtmärk – potentsiaalne sihtvõrkkonstrueeriti ka Cytoscape'is.

1.1.5 GO ja KEGG rikastamise analüüs

Rikastamise analüüs viidi läbi aastalRStudio 4.3.1kasutadesBioconductor ja ClusterProfilerpaketid. Geeniontoloogia (GO) annotatsioonid hõlmasid bioloogilist protsessi (BP), rakukomponenti (CC) ja molekulaarset funktsiooni (MF).KEGG raja rikastamineviidi läbi ka. Visualiseerimine viidi lõpule kauduBioinformatics.com.cn[https://www.bioinformatics.com.cn/].

1.1.6 Põhiühendi–sihtmärgi–haiguse–tee võrgustiku loomine

Tuvastatud põhiühendid, potentsiaalsed sihtmärgid, seotud haigused ja signaalirajad integreeriti, et konstrueerida aühend-sihtmärk-haigus-raja võrgustikkasutades Cytoscape 3.9.1.

1.1.7 Molekulaarne dokkimine

Põhiühendstruktuurid laaditi alla aadressiltPubChem[https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/] SDF-vormingus ja teisendati MOL2-ks, kasutadesAvage Babel 2.4.1. Peamised valgustruktuurid saadi leheltEsialgne eelarveprojekt[https://www.rcsb.org/], mis on valitud Homo sapiens päritolu, kõrge eraldusvõime ja eelistatavalt üksikute ahelate alusel. Molekulaarne dokkimine viidi läbi kasutadesAutoDockTools 1.5.7, 50 käitusega, kasutades geneetilise algoritmi meetodit. Valiti parim seondumiskonformatsioon, millel on kõrgeim seondumisafiinsus ja enamik vesiniksidemeid. Tulemused visualiseeriti aastalPyMOL 2.5.7.

1.2 Eksperimentaalne valideerimine

1.2.1 Katseloomad

SPF-klassi 4-nädalased isased KM-hiired (22 ± 2 g) osteti ettevõttest SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. (litsentsi nr SCXK (Jing) 2024-0001). Hiiri majutati Sise-Mongoolia teadus- ja tehnoloogiaülikooli Baotou meditsiinikolledži loomalaboris. Tingimused: 12 h valguse/pimeduse tsükkel, 24 ± 2 kraadi, 55 ± 5% niiskus, ad libitum toitmine. Loomkatsed kiitis heaks institutsiooniline eetikakomitee (kinnitus nr BYDY-DL2023-36).

1.2.2 Ravimi valmistamine

Cistanche-põhine Mongoolia ravim (partii nr. 907031) jahvatati läbi 100-meššilise sõela ja suspendeeriti 0,5% CMC-Na lahuses.

1.2.3 Reaktiivid ja instrumendid

Peamised reaktiivid:

CMC-Na (Solarbio, Peking)

Lipopolüsahhariid (Sigma-Aldrich, Shanghai)

RNA ekstraheerimise ja pöördtranskriptsiooni komplektid (Sevier Biotech, Wuhan)

qPCR põhisegu, RIPA lüüsipuhver, BCA komplekt, antikehad: PI3K, Akt, p-Akt, -aktiin (Proteintech, Wuhan)

ECL-i tuvastamise komplekt (Sevier Biotech, Wuhan)

Peamised instrumendid:

Mikroplaadi lugeja (Thermo Fisher)

Tsentrifuug (JIDI-16R)

Reaalajas PCR-süsteem (Thermo Fisher)

Geeli pildistamise süsteem (Tanon, Shanghai)

1.2.4 Rühmitamine, modelleerimine ja haldamine

32 hiirt jagati juhuslikult 4 rühma (n=8):

Kontrolli

Mudel

Väikese annusega Cistanche rühm (450 mg/kg)

Suure annusega Cistanche rühm (900 mg/kg)

Cistanche rühmad said iga päev suukaudset sondi 7 päeva jooksul. 7. päeval, 2 tundi pärast annustamist, süstiti kõigile rühmadele, välja arvatud kontroll, intraperitoneaalseltLPS (10 mg/kg)AKI esilekutsumiseks. Kontrollrühm sai soolalahust.

1.2.5 Neeru morfoloogia, kehakaal ja neeruindeks

24 tundi pärast modelleerimist registreeriti kehakaal ja neerude kaal. Neeruindeks=neerude kogukaal (g) / kehamass (kg).

1.2.6 Biokeemilised testid

Seerumi BUN, Scr ja kusihappe taset mõõdeti kaubanduslike komplektide abil.

1.2.7 Histopatoloogiline analüüs

Neerukuded fikseeriti 4% paraformaldehüüdis, dehüdreeriti, sisestati parafiini, lõigati osadeks ja värviti kasutadesHE värvimine. Kudede kahjustusi hinnati valgusmikroskoobi all.

1.2.8 qRT-PCR TNF- jaoks, IL-6, IL-1

Neerukoest kogu RNA ekstraheeriti, pöördtranskribeeriti ja amplifitseeriti SYBR Green qPCR abil. GAPDH-d kasutati sisekontrollina. Suhteline mRNA ekspressioon arvutati kasutades2^-ΔΔCt meetod.

1.2.9 Western blot PI3K/Akt raja jaoks

Valgud ekstraheeriti neerukoest, kasutades RIPA puhvrit. Valgu kontsentratsiooni mõõdeti BCA testiga. Valgud eraldati SDS-PAGE abil, kanti üle PVDF membraanidele, blokeeriti ja sondeeriti primaarsete ja sekundaarsete antikehadega. Signaalid töötati välja ECL abil ja kvantifitseeriti kasutadesPiltJtarkvara.

1.3 Statistiline analüüs

Andmeid analüüsiti kasutadesGraphPad Prism 9.5. Tulemused väljendati järgmiseltkeskmine ± SD. Võrdse dispersiooniga normaalse jaotusega andmete puhulühesuunaline ANOVAjärgnebLSD-t testkasutati. Mittenormaalsete või ebavõrdsete dispersiooniandmete puhulKruskal-Wallis H testrakendati. AP-väärtus < 0,05peeti statistiliselt oluliseks.