Uuring acteosiidi (aktiivse koostisosa tsistanche derticola) mõju kohta NAFLD -le, kutsudes esile autofagiat

Kokkuvõte:

 

Eesmärk:Aktiivse koostisosa acteosiidi (ACT) autofaagia indutseeriva funktsiooni uurimiseks tsistanche Derticolas ja selle mõju alkoholivaba rasvmaksahaigusele (NAFLD).

MeetodidEhinakosiidi võtmiseks ja uurimisobjektidena ühendati 1 0 0 μmol/l ACT ja ehhinakosiid (ECH) autofaagia-lüsosoomi inhibiitori bleomütsiini A1-ga sekkumisravi jaoks. Autofagia markeri valgu mikrotuubulitega seotud valguga 1 kerge ahel 3 (LC {5}} II) kasutati valgu immunoblotanalüüsi. HEPG2 rakud sekkusid erinevate ACT kontsentratsioonidega in vitro ja rakkude elujõulisus tuvastati tetrasooliumsoola meetodil. HepG2 rakkude in vitro sekkumisel erinevate ACT -kontsentratsioonidega koos Balofloksatsiini A1 -ga ja LC {9}} II valgu ekspressioonitaseme tuvastamine proteiin -immunomaterjali abil. NAFLD -mudelit, mis oli konstrueeritud in vitro koos ravimite sekkumisega, kasutati lipiidide tilkade värvimiseks, kasutades õlipunast O värvimismeetodit ja tuvastama rakusiseseid triglütseriidide taset. Jälgige LC3 valgu ja lipiidide tilkade lokaliseerimist immunofluorestsentsitehnoloogia kaudu. Tulemuste seaduse korral võib HEPG2 rakkudes autofagia märkimisväärselt esile kutsuda ja LC 3- II valgu ekspressioonitase on märkimisväärselt suurenenud kontrollrühmaga (töödeldud ainuüksi ACT -ga) (1,36 ± 0. 11, 0. 28 ± {28} {32 {32 {32 {32 {32 {32. vastavalt) statistilise olulisusega (P0.05). 50 μmol/l ACT indutseeris HEPG2 rakkudes märkimisväärselt autofagia ja LC 3- II valgu ekspressioonitase oli märkimisväärselt suurenenud (vastavalt 1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18). HEPG2 rakkude TG tase ACT sekkumisrühmas (19,11 ± 1,68) oli oluliselt madalam kui NAFLD in vitro rakumudeli rühmas (34,15 ± 1,90) ja erinevused olid statistiliselt olulised (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Märksõnad:Mittealkohoolne rasvmaksahaigus;Tsistanche derticola;Akteosiid; Autofagia

 

TCM-i ravimtaimede tsistanche mittealkohoolse rasvmaksahaiguse raviks (NAFLD)

Lisateabe saamiseks klõpsake pildil

 

Viimastel aastakümnetelmaksahaigus(Nafld) on muutunud kõige tavalisemakskrooniline maksahaigus, umbes 25% täiskasvanud elanikkonna globaalse levimusega ja seda peetakse tihedalt seotud metaboolse sündroomiga [1]. Ehkki NAFLD-ga patsientide maksaga seotud komplikatsioonide tõenäosus on alla 10%, on NAFLD maksaga seotud haiguste, näiteks tsirroos ja primaarse maksavähi riskifaktor, mis põhjustab patsientidele tohutut majanduslikku koormust [2-5]. Vaatamata kasvavale tähelepanule NAFLD -le, pole Nafld kui oluline krooniline haigus piisavalt tähelepanu pööratud. Seetõttu on NAFLD patogeneesi ja tõhusate ravistrateegiate otsingu täiendav põhjalik mõistmine muutunud kiireloomulisteks probleemideks [6-7].

Värsked uuringud on näidanud, et raku autofagial on oluline roll maksa füsioloogias ja patoloogias [8]. Autofagia düsfunktsioon või düsregulatsioon on seotud mitmesuguste maksahaigustega, näiteksAlkoholiga seotud maksahaigus[9], NAFLD [10], mittealkohoolne steatohepatiit [11] ja hepatotsellulaarne kartsinoom [12]. NAFLD patoloogilised omadused on triglütseriidide (TG) ja muude neutraalsete lipiidide tilkade (LD) liigne ladestumine hepatotsüütides mittealkohoolse stimulatsiooni all. Maksa jaoks on nende LD -de katabolismi reguleerivad kaks peamist rada lipolüüs ja autofagia.
Lipolüüsi rada reguleerivad tsütoplasmaatilised neutraalsed lipaasid, näiteks hormoonitundlik lipaas ja rasv-TG lipaas. Vastavas lipoautofagia rajas saab LDS-i valikuliselt võtta autofaagiaga seotud valkude värbamisega selektiivselt, moodustades autofagosoomid, ja seejärel tarnitakse autofagosoomide poolt kapseldatud LD-sid lüsosoomidele ja dekompeeritakse happeliste lipaasi abil lüsosoomides. Seetõttu on lipoautofagia aktiveerimine hepatotsüütides muutunud tõhusaks strateegiaks NAFLD ennetamise ja ravi jaoks.
Cistanche Derticola on hinnaline hiina taimne ravim, mida on laialdaselt kasutatud kliinilises praktikas traditsioonilistes Hiina meditsiini valemites. Samal ajal on seda juba pikka aega kasutatud tervisliku toidulisandina. Cistanche Derticola sisaldab mitmesuguseid bioaktiivseid koostisosi, millest kõige olulisem on Cistanche Derticola fenüületanoolglükosides. Fenüületanoidsete glükosiidide esindajatena on teatatud, et ehhinakosiidi (ECH) ja verbascosiidi (ACT) esindajad on palju olulisi bioloogilisi aktiivsusi, näiteks antioksüdant, neuroprotektiivne, immunomodulatoorne ja maksakaitse [13]. Maksakaitse osas on uuringud leidnud, et ECH suudab maksa kaitsta, vähendades põletikulisi vahendajaid, pärssides kasvufaktorit ja vähendades maksafibroosiga seotud geenide ekspressioonitaset. ACT-l on oluline kaitsev toime keemiliste ja ravimite põhjustatud maksakahjustustele, näiteks alkohol, süsiniktetrakloriid ja lipopolüsahhariid. ACT vähendab toksilistest kemikaalidest põhjustatud oksüdatiivset stressi, eemaldab maksas kogunenud reaktiivse hapniku ja vähendab malondialdehüüdi kontsentratsiooni. Samal ajal suurendab see märkimisväärselt maksa superoksiidi dismutaasi aktiivsust ja vähendab glutatiooni sisaldust ning parandab märkimisväärselt maksa histopatoloogilisi kahjustusi ja apoptoosi. Siiski puudub asjakohane kirjanduse aruanne selle kohta, kas tsistanche dertaticola fenüületanoidsed glükosiidid osalevad maksakaitse avaldamisel autofaagia protsessis. Selle põhjal kasutati selles uuringus tavapäraseid rakubioloogia meetodeid ja in vitro rakumudelit, et uurida esialgseks tsistanche deserticola fenüületanoidse glükosiidide autofaagiat indutseeriva toime ja uurida selle võimalikke farmakoloogilisi funktsioone, mille eesmärk on pakkuda teaduslikku alust ravimite edaspidiseks arendamiseks.

 

1 materjalid ja meetodid

1.1 Materjalid

1.1.1 Teadusubjektid kajasid ja ACT kasutati uurimisainetena.

1.1.2 Materjalid HEPG2 rakud osteti ettevõttelt Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (partiiinumber: B21209) ja ACT (partii number: B20715, HPLC puhtus, mis on suurem või võrdne 98%-ga) osteti Shanghai Yuany bioloogilisest ettevõttest, DMEM High GluCose (Batch Keskmine) (Batch Keskmine) SH01: SH01: SH01 SH01: SH01 SH01: SH01 Trüpsiin osteti ettevõttelt Hyclone Company, USA, loote veise seerum (partiiinumber: 04-002-1 a) osteti ettevõttelt BI Company, Iisrael, Penicillin/Streptomycin (partii number: SV30010.01) osteti ettevõttest Hyclone Company, USA, MTT (Batch Number: M8180), mis oli pärit) WAS -ist, M8180) WAS -i. TG (partii number: BC0625) Deteksioonikomplekt osteti ettevõttelt Solebao Company, Peking, Hiina, õlipunane O (partii arv: O 0625-100 g), dimetüülsulfoksiid (partii arv: BCBZ1685) osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich, USA; Autofagia-lüsosoomi inhibiitor BAFILOMYCIN A1 (BAFA1, PALJU NUMBER: TLRL-BAF1) osteti ettevõttelt Invitrogen, USA; Autofagia aktivaator rapamütsiin (partii arv: S17098) osteti ettevõttelt Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Hiina; Mikrotuubulitega seotud valk 1 1 kerge ahel 3 (LC3, partii arv: L7543, liigid: küülik, lahjendussuhe: 1: 1 000) ja -actin (partii arv: zrb1312, liigid: küüliku, lahjendussuhe: 5 000) antikehad, mis on alates sigmast; Marjaradishi peroksüdaasi märgistatud sekundaarsed antikehad (partii arv: 4010-05, liigid: kitsedevastane antikbit, lahjendussuhe: 1: 1 000) osteti ettevõttest Southern Biotech, USA ettevõte, Alexa Fluor Fluorestsents märgistatud sekundaarne antikeha (43328, 546). Sigma-Aldrich Company, USA, ja Bodipy 493/501 (partii number: D3922) osteti ettevõttelt Invitrogen Company, USA.

 

1.2 meetodid

1.2.1 Rakukultuur

HepG2 rakke kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud kotkast kõrge glükoosikeskkonnas, mis sisaldas 10% veise loote seerumit, 100 U/ml penitsilliini ja 100 ug/ml streptomütsiini 37 kraadi, 5% süsinikdioksiidi inkubaatoriga. Kui rakkude ühinemine jõudis 85%-ni, viidi läbi subkultuur, plaadistamine, sekkumine ja muud toimingud.

 

1.2.2 Valgu immunoblotanalüüsi tuvastamine

1.2.2.1 ACT ja ECH ravi

LC 3- ⅱ Valgu ekspressioonitase HepG2 rakkudes BAFA1 kui prootonpumba inhibiitorina võib põhjustada LC 3- ⅱ valgu agregatsioon suurtes kogustes rakkudes, amplifitseerides sellega autofaagia induktsioonivõime. Seetõttu saab BAFA1 kombineeritud kasutamist kasutada autofaagia jälgimissüsteemina autofaagia indutseerimisvõime hindamiseks. Logaritmilise kasvufaasi HepG2 rakud viidi üleöö kultuuri jaoks 3,5 cm rakukultuuri roogadesse. 12 tundi sekkumiseks kasutati 100 μmol/l ACT, ECH ja BAFA1. Rakke pesti eeljahutatud fosfaatpuhvri lahusega (PBS) ja lüüsiti kohe RIPA valgu lüüsipuhvris 10 minutit. Supernatant tsentrifuugiti ja kogu valgu kontsentratsioon määrati, kasutades bitsiinkoniinhappe valgu kontsentratsioonianalüüsi komplekti. Pärast kvantifitseerimist naatriumdodetsüülsulfaatpuhvriga kuumutati proovi valkude denaliseerimiseks 10 minutit 95 kraadi juures. Seejärel võeti 30 μl proovi mikropipetiga ja elektroforeesiti polüakrüülamiidi geelil.
Pärast elektroforeesi kanti valk geelist nitrotselluloosmembraanile, blokeeriti öö läbi 1 0% piimaga, inkubeeriti 1 tund toatemperatuuril spetsiifilise primaarse antikehaga, pestakse fosfaatpuhvriga 0,5% tritoniga ja inkubeeriti konkreetse teise sekundaarse antikehaga mahuti temperatuuriga 1 H. Värvide arendamiseks kasutati ECL -meetodit. Need seati tühjaks kontrollrühmaks, Rapamycin Group, ECH Group, ACT Group, Rapamycin+BAFA1 rühm, ECH+BAFA1 rühm ja ACT+BAFA1 rühm.

 

1.2.2

Logaritmiliste kasvufaasi HepG2 rakud viidi üleöö kultuuri jaoks 3,5 cm rakukultuuri roogadesse ning 25, 50 ja 100 μmol/L ACT koos BAFA1 -ga kasutati sekkumisravis 12 tundi ja LC -i ekspressioonitase 3-} valku tuvastati valgu immunobüüdi abil. Kontrollrühm (CON -rühm, tühja kontroll), nälgarühm (STA rühm, näljahooldus HepG2 rakud), 25, 50 ja 100 μmol/L ACT rühm ning BAFA1 koos 25, 50 ja 100 μmol/L ACT -rühmaga.

1.2.3 MTT meetod HEPG2 rakkude ellujäämise määra tuvastamiseks, mida töödeldi ACT erinevate kontsentratsioonidega 24 ja 48 tundi
Logaritmilise kasvufaasis olevad HepG2 rakud inokuleeriti mõõduka inokuleerimise tihedusega 96- kaevuplaadil ja kultiveeriti inkubaatoris 12 tundi. 2 0, 40, 60, 80 ja 100 μmol/L ACT lisati 24 ja 48 tundi. Pimedas keskkonnas lisati 0,5 mg/ml MTT lahust ja inkubeeriti inkubaatorisse. 4 tunni pärast visati supernatant ära, igale süvendile lisati 100 μl dimetüülsulfoksiidi ja rakke raputati konstantse temperatuuri raputajaga 37 kraadi juures 10 minutit. Optilise tiheduse (OD) väärtus lainepikkusel 490 nm tuvastati ensüümi markeriga ja arvutati rakkude ellujäämise määr.

 

1.2.4 NAFLD rakumudeli in vitro ehitamine

Palmitiinhappe (PA) teatud kaal kaaluti ja lahustati täielikult isopropanoolis, et valmistada ette 100 mmol/L PA lahus, mis seejärel jagati ja hoiti hilisemaks kasutamiseks -20 kraadi külmkapis. PA aktsialahus lahjendati täieliku söötme abil 100 μmol/L-ni ja lisati 1% rasvhappevaba veise seerumi albumiini. Rakke inkubeeriti induktsioonilahuse ettevalmistamiseks 37 kraadi juures. Logaritmilise kasvufaasi HepG2 rakud kanti üleöö kultuuri jaoks sobiva tihedusega 3,5 cm pikkusesse rakukultuuri tassi ja seejärel kasutati sekkumiseks ettevalmistatud induktsioonilahust.

 

1.2.5 ACT sekkumine NAFLD in vitro raku mudel TG tuvastamine ja õlipunane o värvimine

 

1.2.5.1 TG tuvastamine

Logaritmilise kasvufaasi HepG2 rakud kanti tühja kontrollrühma, mudelirühma ja ACT sekkumisrühma järgi kultuuri jaoks 3,5 cm rakukultuuri tassi. Mudelirühm indutseeriti 100 μmol/L PA induktsioonilahusega ja ACT sekkumisrühm indutseeriti 100 μmol/L PA induktsioonilahusega ja samal ajal lisati 50 μmol/L ACT. Sekkumisaeg oli 24 tundi. Eemaldage õrnalt vana sööde, peske rakupind aeglaselt eeljahutusega PBS-ga üks kord, lisage 100 μl/roog eeljahutatud RIPA lüüsilahust, mis on täielikult jääga 15 minutit, tsentrifuugid 4-kraadisel ja 12 000 r/min 10 minutit, koguge supernatant, võtke 10 μl protekti, mis tuvastab 10 μl En-i tase Enzymaatilise detektsiooni jaoks Enzytic of Enzyt of tg TG-i jaoks TG-i. TG komplekti juhised ja parandage lõpuks TG tase Mg valgu kohta.

1.2.5.2 Õlipunane o värvimine

Logaritmilise kasvufaasi HepG2 rakud kanti üleöö kultuuri jaoks steriilse kattekihiga kaetud 3,5 cm pikkusesse kultuuriroogi. 100 μmol/L PA indutseeris rakud lipiidide tilkade moodustamiseks. Samal ajal lisati 24 tundi sekkumiseks 50 μmol/l.
The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed with 4% formaldehyde at room temperature for 10 min, washed the cell surface with PBS, added the prepared Oil Red O staining working solution, stained at room temperature in the dark for 15 min, aspirated the Oil Red O staining solution, washed the excess staining solution with double distilled water, rinsed with 60% isopropanol, washed with double distilled water, and sealed, and pildistatud mikroskoobi all.

 

1.2.6 Autofagosoomide ja lipiidide tilkade immunofluorestsentsi vaatlus pärast ACT -ravi

Logaritmilise kasvufaasi HepG2 rakud kanti üleöö kultuuri jaoks steriilse kattekihiga kaetud 3,5 cm pikkusesse kultuuriroogi. 1 0 0 μmol/l PA kasutati rakkudes lipiidide tilkade moodustumise esilekutsumiseks. Samal ajal lisati ACT sekkumisravi jaoks 24 tundi. Rakkude slaidid koguti, pesti 3 korda eeljahutusega PBS-ga, fikseeriti 10 minutit toatemperatuuril 4% formaldehüüdiga, permeabiliseeriti 15 minutit toatemperatuuril permeabiliseerimispuhvriga, mis sisaldas 0,1% saponiini, blokeeriti toatemperatuuril 1 tunni jooksul kitsede seerumiga, mis on inkubeeritud primaarselt 3-le antyga, mis on primaarsed 3-tunnisega {{14-ga {14 {{14 {{14-aastased {14-aastased {14-aastased {4-kordsed. Spetsiifiline fluorestsentsmärgistatud sekundaarne antikeha, inkubeeritud toatemperatuuril ja 1 tund valgusest eemal. Pärast antikehade inkubeerimist pesti slaidid 3 korda PBS-iga, kontrasteeriti 10 minutit toatemperatuuril lipiidide tilkade spetsiifilise sondiga 493/503 toatemperatuuril, pesti PBS-iga ja suleti PBS-ga ja suleti antiviisilise tihendiga keskmise söötmega, õhu käes kuivatatud, lavakonfoop-mikroskoop ja relvastatud. Määrati tühi kontrollrühm, rapamütsiini ravigrupp ja ACT sekkumisrühm.

 

1.3 Statistiline analüüs

Andmete analüüsimiseks kasutati SPSS25. 0 statistilist tarkvara. Kvantitatiivseid andmeid väljendati x ± s. Kasutati dispersiooni ja LSD-T testi ühesuunalist analüüsi. P<0.05 was considered statistically significant.