Uuring Cistanche Deserticola ja selle riisiveini aurutamistoodete neuroendokriinse immuunfunktsiooni kohta glükokortikoidide indutseeritud rotimudelis – Ⅱ

3.2.4. Immunohistokeemia

Neuronaalset apoptoosi kontrollivad paljud apoptootilised ja antiapoptootilised geenid, peamiselt apoptoosi soodustav geen Bax ja Bcl-2 geeniperekonna antiapoptootilised geenid. Bcl-2 paikneb reaktiivsetes hapnikku tootvates organellides, nagu mitokondrites, endoplasmaatilises retikulumis ja tuumamembraanides. Bcl-2 mõjutab hapniku vabasid radikaale vähe, kuid võibvältida oksüdatiivseid kahjustusi rakkudes. Bax transpordib tsütoplasmast mitokondriaalsele membraanile, muudab mitokondriaalse membraani struktuuri ning soodustab tsütokroom c vabanemist ja apoptoosi esilekutsumist.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Neerupealiste tsütoplasmas esines Baxi ja Bcl{0}} valgu ekspressioon. Värvimine näitas kõiki kollaseid osakesi. Võrreldes BC rühma omaga suurenes Baxi valgu keskmine optiline tihedus MC rühmas oluliselt (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

Joonis 5(b) näitab, et võrreldes BC rühma omaga vähenes Bcl-2 valgu keskmine optiline tihedus MC rühmas oluliselt (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

Kaspaas{0}} valk paikneb normaalsetes kudedes algsel kujul peamiselt tsütoplasmas ja sellel on madal ekspressioon. Positiivsed signaalid on kahvatukollased või pruunikaskollased. Võrreldes BC rühma omaga suurenes kaspaasi -3 ekspressioon MC rühmas oluliselt (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

Normaalsetes kudedes Fas geeni ekspressioon vähenes ja positiivne signaal in situ hübridisatsiooniks oli pruunikaskollane. Nagu on näidatud joonisel fig 5 (d), suurenes BC rühma Fas valgu keskmine optiline tihedus MC rühmas (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

FasL valk paikneb peamiselt rakumembraanis või tsütoplasmas ning selle positiivsed signaalid on pruunid. Võrreldes BC rühma omaga suurenes FasL geeni keskmine optiline tihedus MC rühmas oluliselt (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Tulemused näitasid, et CD ja WCD suudavadindutseerida põletikulistes rakkudes apoptoosija vähendada neerupealiste kahjustusi, soodustades FasL valgu ekspressiooni ja seondumist Fas valguga, aktiveerides kaspaas-3 valku ja käivitades kaspaasi kaskaadi. WCD-HD grupi mõju oli parim.

3.3. Immuunfunktsiooni määramine

3.3.1. Immuunorganite indeks

Võrreldes BC rühma omadega langesid MC rühma harknääre koefitsient ja põrna indeks oluliselt (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3.2. T-lümfotsüütide alarühmade tuvastamine perifeerses veres

CD{0}} rakkude protsent vasakpoolses ülemises kvadrandis ja CD8+ rakkude protsent paremas alumises kvadrandis BC ja igas ravimirühmas oli suurem kui MC rühmas. Võrreldes BC rühma omaga vähenes CD4+ThCD8+ suhe oluliselt MC rühmas (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α ja IFN-C taseme määramine seerumis

Jooniselt 8 on näha, et võrreldes BC rühmaga tõusis IL-6, TNF- ja IFN-c tase oluliselt (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Lymuse koe mikroskoobi vaatluskatse tulemused

Joonisel 9 on näidatud, et BC rühmas esines suur hulk lümfotsüüte. Lümfotsüüdid ja retikulotsüüdid paigutati keskele lõdvalt hajutatud ümmarguste või ovaalsete tümotsüütidega. Puudus nekroosi, põletikuliste rakkude infiltratsiooni ja ebanormaalseid muutusi.

MC-rühmas oli suur hulk lümfoidnekroosi kudet, mille keskel oli lümfotsüütide ja retikulotsüütide korrastatus. Ümmargused või ovaalsed tümotsüüdid kadusid, ilmnes massiivne rakkude degeneratsioon või nekroos ning esines põletikuliste rakkude infiltratsioon koos ebanormaalsete patoloogiliste muutustega.

CD rühmades olid lümfotsüütide morfoloogilised omadused normaliseerunud ning tsentraalsete lümfotsüütide ja retikulotsüütide asetus peaaegu normaalne. Ümmargused või ovaalsed tümotsüüdid olid taastunud, kuid alles jäi väike arv degeneratiivseid või nekrootilisi lümfotsüüte ja infiltreeruvaid põletikurakke.

WCD-rühmades ja PC-rühmas paranesid lümfotsüütide morfoloogilised omadused paremini. Keskel paiknevad lümfotsüüdid ja retikulotsüüdid olid hästi joondatud, ümmargused või ovaalsed tümotsüüdid olid peaaegu normaalsed, kuid alles jäi väike arv infiltreeruvaid ja degeneratiivseid lümfotsüüte.

3.4. CaM valgu geeni ekspressioon

CaM mRNA ekspressiooni uurimiseks peeti RQ väärtust (CaM mRNA-aktiini mRNA). BC rühma RQ oli 1. CaM mRNA ekspressioon hüpotalamuses MC rühmas suurenes oluliselt (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Arutelu

Hiina farmakopöas [2] on kirjas, et CD-d ja WCD-d saab kliinikus kasutada peamiste tükkide dekokteerimise tüüpidena. Pärast riisiveiniga aurutamist,vananemisvastane ja toniseeriv neeru-yangi toimetäiustati. UPLC-QqQ-MS abil tuvastasime riisiveini aurutamise käigus keemilise materjali baasi kvantitatiivsed muutused. Iridoidglükosiidid olid ebastabiilsed ja nende glükosiidide sisaldus vähenes, muutudes isegi tuvastamatuks. Muutus ka fenüületanoolglükosiidide sisaldus, mis võib esile kutsuda muutusi farmakodünaamikas ja kliinilises toimes.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Klassikalist neeru-yangi puudulikkuse mudelit korrati kortikosterooni subkutaanse süstimisega [19]. Kortikosterooni üleannustamine võib pärssida CRH sekretsiooni hüpotalamuses. Vahepeal inhibeeriti ka ACTH saladust. Neerupealise koore hormooni tase langes ja seega vähenes HPA telje funktsioon. HPA telje hüpofunktsioon on neeru-yangi puudulikkuse tavaline tunnus [20]. Siis ilmnevad rottidel "kurnatuse" nähtused ja sümptomid on kooskõlas neeru-yangi puudulikkuse sümptomitega kliinikus.

MC rühmas langes CRH, ACTH, T ja CORT tase roti seerumis oluliselt (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Bcl{0}} perekonnaliikmete osakaalu muutmine on üks põhimehhanisme, mille abil FasThFasL vahendab surmaretseptori rada ja perekond Bcl{1}} reguleerib mitokondriaalset rada [21]. Apoptoosi inhibeeriv faktor Bcl-2 ja apoptoosi indutseerivad tegurid, nagu Bax, kuuluvad kõik Bcl-2 perekonda [22]. Rakkude apoptoosi võib määrata apoptoosi inhibeerivate tegurite ja apoptoosi indutseerivate tegurite suhtelise suhtega [23]. Mitokondritel on paljude apoptoosivormide kesksete kontrollpunktide funktsioon [24]. Käesolev uuring näitas, et CD-MD ja WCD-d võivad tuletada Baxi ekspressiooni ja suurendada Bcl{13}}parandada neeru-yangi puudulikkust. Fas on peamine surmaretseptor, mis kutsub esile apoptoosi ligeerimise teel Fas ligandiga (FasL) [25]. Fas ja FasL ekspressioon MC rühmas suurenes, samas kui see ekspressioon suurenes oluliselt WCD-MD rühmas (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

Immuunfunktsiooni puudulikkus on neeru-yangi puudulikkuse üks olulisi ilminguid [28]. Selles uuringus leidsime, et WCD-MD rühma põrna ja harknääre indeks taastus oluliselt (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

HPA telg on kõige olulisem regulatsioonisüsteem, kuna see reguleerib glükokortikoidide sekretsiooni ja endokriinsüsteemi, et säilitada neerupealiste koore sekretoorset funktsiooni [32]. CaM mRNA üleekspressioon hüpotalamuse koes oli seotud neeru yangi puudulikkusega. CD ja WCD võivad blokeerida kaltsiumikanaleid, pärssida CaM mRNA ekspressiooni hüpotalamuses ja vähendada kaltsiumi sissevoolu, vähendades seega Ca2+·CaM kompleksi aktiivsust.

Neeru-yangi puudulikkuse teke on kroonilise haiguse arenguprotsess. Neer ei ole enam puhtalt anatoomiline mõiste ja see on üldine termin neuroendokriinse immuunsuse ja urogenitaalsüsteemide kohta. Neuroendokriin-immuunvõrk (NEI) on oluline integreeritud reguleerimissüsteem [33]. CD ja WCD võivad reguleerida HPAT telje funktsiooni ja parandada neeru-yangi puudulikkuse taastumist. See tulemus annab eksperimentaalse aluse neeru-yangi puudulikkuse kliiniliseks ennetamiseks ja raviks.