Cistanche glükosiidide östrogeenitaolise mehhanismi uurimine metaboloomika abil

Sissejuhatus

Östrogeenid mängivad olulist rolli paljudes arengu-, füsioloogilistes ja sellega seotud protsessides, sealhulgas emaka arengus.1–3 Östrogeeni pikaajalisel kasutamisel võib aga olla palju kõrvalmõjusid, nagu näiteks rinnavähi, endomeetriumi vähi ja teiste günekoloogiliste kasvajate riski suurenemine.4,5 Seetõttu on teadlased võtnud endale kohustuse otsida östrogeeniasendajaid, mis võiksid neid kõrvaltoimeid vältida, tuntud kui selektiivsed östrogeeniretseptori modulaatorid, millest fütoöstrogeenid moodustavad olulise kategooria.6 Fütoöstrogeeniühendid esinevad looduslikult östrogeense toimega taimedes ja võivad seostuda östrogeeniretseptoritega, et avaldada oma aktiivsust. Seetõttu võivad fütoöstrogeenid stimuleerida emaka kasvu, kombineerides neid emakas olevate rohkete östrogeeniretseptoritega, mis tähendab, et uterotroofset analüüsi saab kasutada fütoöstrogeenide esialgseks skriinimiseks ja hindamiseks.

Cistanchedeserticola (CD), mida Hiinas tuntakse Rou Cong-Rong nime all, on väidetavalt tõhus paljunemis-, arengu- ja viljakusfunktsioonide jaoks ning seda on kasutatud toonikuna enam kui 1800 aastat.8,9 Hiljuti on farmakoloogilised uuringud näidanud, et toonikul on laiad meditsiinilised funktsioonid, nthormoonide reguleerimine, aperient, immunomoduleeriv, antioksüdatiivne, anti-apoptootiline, neuroprotektiivne, antinotsitseptiivne, põletikuvastane, väsimusevastane ja östrogeenne toime.10 CD-st ekstraheeritud tsistanšglükosiidid (GC) on ühed peamistest aktiivsetest komponentidest ja neil on erinev bioloogiline toime.11 Kuigi CD aktiivseid koostisosi on varem selgitatud,12 ei ole GC-de östrogeenset mehhanismi kunagi uuritud.

LOODUSLIK TUBULOOS OSTEOPOROOSI VÄLTIMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Selles jätkuvas uuringus püüdsime kinnitada GC-de võimalikku kasutamist fütoöstrogeenidena ja viia läbi metaboolne analüüs, et uurida GC-de östrogeenset mehhanismi. Esiteks kasutati GC-de östrogeense aktiivsuse kinnitamiseks uterotroofilist analüüsi ja histoloogilist analüüsi. Kõige tähtsam on see, et UPLC-MS / MS-põhise metaboolse analüüsi abil keskendusime metaboolsetele muutustele roti seerumis ja uriinis. Mittesihitud metaboloomika puuduste tõttu, nagu korratavus ja keeruline maatriksi mõju, kasutati metaboliitide ja indeksite (sealhulgas energia metabolismi, oksüdatiivse stressi, lipiidide metabolismi ja amino metabolismi) spetsiifiliseks jälgimiseks MRM-režiimil põhinevat pseudomeetodit. Seoses östrogeensete mõjude, kasvu ja arenguga valiti tuvastamiseks biomarkeriteks. Meie tulemused heidavad valgust GC-de östrogeenilaadsele mehhanismile, mis aitab kaasa GC-de arendamisele ja kasutamisele.

Eksperimentaalne

Reaktiivid

L-leutsiin, L-künureniin, L-trüptofaan, 5-HTP, koolhape, N-fenüülatsetüülglütsiin, 5-HT, glutatioon (GSH) ja 2,4-dinitrofenüülhüdrasiin (99 $.{{ 8}}%, HPLC) osteti ettevõttelt Dalian Melone Biology Technology Co. (Dalian, Hiina). N-etüülmaleimiid ($ 98%, HPLC), oksüdeeritud L-glutatioon (GSSG, $ 98%, HPLC) ja 1,1,3,3-tetraetoksüpropaan (TEP) osteti firmalt Sigma (Madrid, Hispaania). L-fenüülalaniin (Ring-D5, 98%, DLM-1258-5) osteti Cambridge'i isotooplaboritest (MA, USA). MS-klassi metanool ja atsetonitriil osteti ettevõttest ACS (Houston, USA). Dietüülstilbestrool (puhtusaste, $ 99.0%), sipelghape, jää-äädikhape ning hematoksüliin ja eosiin (H&E) osteti firmalt Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). Naringeniin (puhtusaste, $ 98% (HPLC)) osteti ettevõttelt Shanghai Jingchun Aladdin Reagent Co. (Shanghai, Hiina). GC-d valmistati meie laboris ja nende puhtuseks määrati ultraviolettspektrofotomeetria abil 60%, kasutades määramise markerina akteosiidi.

GC-de valmistamine

Briey,cistanche pulber(100 g) leotati 75% etanoolis (1000 ml) 1 tund, seejärel ekstraheeriti uuesti 2,5 tundi kolm korda. Supernatant kontsentreeriti vaakumis, et saadacistanche ekstrakt(23,3 g). Ekstrakt lahjendati veega kontsentratsioonini 0,5 g ml- 1 (lahustuvus määrati toorravimiga). Pärast 8-tunnist adsorptsiooni AB-8 makropoorse vaiguga elueeriti kolonni järjestikku vee ja 85% etanooliga. 85% etanooli eluent kontsentreeriti, et saada etanooliekstrakt (8,4 g). Etanooliekstrakt (0.02 g) kaaluti täpselt ja lahustati 50% metanoolis (10 ml). Lahuse 1 ml alikvoot lahjendati mahumõõturis metanooliga 100 ml-ni. Lõpuks mõõdeti lahjendatud lahust ultraviolettkiirguse spektrofotomeetria abil 330 nm juures. Ultraviolettkiirguse neeldumine oli 0,341 ja akteosiidi lineaarne suhe UV-ga oli y ¼ 24,905X + 0,0426 (R2 ¼ 0,9982). Kui sisaldas 5,04 g GC-sid, oli puhastusaste 60% (GC määramisel kasutati markerina akteosiidi). GC-de sõrmejälgede hindamine on näidatud ESI joonisel S1.

Loomkatsed ja proovide kogumine

Emased seksuaalse ebaküpsuse (45–60 g) ja suguküpsuse (320–380 g) SD-rotid saadi Harbini meditsiiniülikooli loomakeskusest, laboriloomade litsentsi SCXK- (armee): 2013-001. Loomi hoiti SPF laboritingimustes ja neile anti ad libitum standardset laboratoorset dieeti muudetud kraaniveega. Kõik loomadega seotud protseduurid kiideti heaks Heilongjiangi provintsi loomade heaolu ja hooldamise suunistega ning need viidi läbi vastavalt riikliku terviseinstituudi juhistele loomade hooldamise põhimõtete kohta (2004). Kõik selles katses kasutatud rotid aklimatiseerusid ülaltoodud keskkonnaga nädalaks.

Seksuaalselt ebaküpsed SD-rotid jagati juhuslikult kolme 1 0 rottide rühma: tühirühm, dietüülstilbestrooli rühm ja GC rühm. Vahepeal valiti kontrollrühmaks 10 suguküpset SD rotti. Dietüülstilbestrooli rühmale manustati koos dietüülstilbestrooliga (0,35 mg kg- 1, 1 ml/100 g), GC rühmale manustati GC lahusega (30 g kg- 1, 1 ml/100 g) ) ning tühirühm ja kontrollrühm said sama mahuga destilleeritud vett kaks korda päevas (hommikul ja õhtul) 3 päeva jooksul. Kolmandal päeval paigutati rotid pärast manustamist metaboolsetesse puuridesse ja uriiniproove koguti pidevalt 24 tunni jooksul. Rotid anesteseeriti pentobarbitaaliga ja võeti vereproovid, mis koguti kõhuaordist ja tsentrifuugiti seerumi saamiseks kiirusel 3000 x g (15 min, 4 °C). Kõik proovid säilitati aadressil - 20. C. Lisaks eraldati emakas, kaaluti ja uuriti 10% formaliiniga.

Histoloogiline analüüs

Emakast lõigati 5 mm paksused koed. Seejärel sisestati koelõigud parafiini, värviti tavapäraste meetodite abil H&E-ga ja vaadeldi optilise mikroskoobiga (BZ-9000; Keyence, Osaka, Jaapan). Emaka epiteelirakkude kõrgust mõõdeti mikroskoobi all mikromeetriga.

LOODUSLIK TUBULOOS RINNAKASVU EDENDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ainevahetus

Aktiivsöega eemaldatud seerumi valmistamine

Spetsiaalne tühiseerum valmistati roti seerumist, mis oli endogeensetest materjalidest eemaldatud, kasutades aktiivsöepulbrit. Aktiivsöe pulber (6 g) lisati roti seerumile (100 ml), loksutati 2 tundi toatemperatuuril ja tsentrifuugiti 4 °C juures. C ja 13 500 p/min 20 minutit. Supernatanti muudeti, kasutades Millipore Express PES membraane (Merck Millipore, Ltd.), mis oli kinnitatud 20 ml süstla külge järgmises järjestuses: 5 mm, 1,2 mm ja 0,45 mm. LC-MS/MS kinnitas, et "eemaldatud" seerum ei sisalda biomarkereid.

Standardlahuste valmistamine

L-trüptofaan (Try), L-künureniin (Kyn), GSSG, N-fenüülatsetüülglütsiin (N-Phe), 5- HTP, L-leutsiin (Leu), 5-HT ja koolhape ( CA) põhilahused (1 mg ml- 1) ​​valmistati 100% metanooliga. GSH valmistati 0,5 mg ml{12}} 10 mM NEM PBS puhvris ja säilitati temperatuuril - 40. C pruunides pudelites. Kalibraatorite genereerimiseks kasutati kombineeritud L-trüptofaani, L-künureniini, GSSG-d, N-fenüülatsetüülglütsiini, 5-HTP-d, L-leutsiini, 5-HT, koolhapet ja GSH-NEM-i, mis lahjendati seeriaviisiliselt destilleeritud lahusega. vesi. L-fenüülalaniin-d5 (d5-Phe) IS põhilahus valmistati 100% metanoolis ja d5-Phe töölahus (10 ng ml- 1) 100% metanoolis ja hoitakse - 40. C.

Analüüsi ajal oli GSH lagunemise vältimiseks vajalik derivatiseerimise etapp, mis parandas GSH tuvastamise ja kvantifitseerimise stabiilsust. GSH määrati pärast reaktsiooni NEM.15,16 Vastavalt eelmisele aruandele valiti GSH jaoks 50 mM NEM.

Proovi ettevalmistamine

Seerumiproovide jaoks lisati proovile (200 ml) 10 mM NEM-i (200 ml), seejärel metanooli (1000 ml, mis sisaldas IS Phe-d5 10 ng ml - 1) ja inkubeeriti 20 minutit temperatuuril { {9}}. C. Pärast tsentrifuugimist temperatuuril 4 °C ja 12 000 p/min 10 minutit kanti supernatandid (1000 ml) 2 ml tsentritorudesse ja aurustati kuivaks. Kuivatatud jääk taastati destilleeritud vees (100 ml) pärast tsentrifuugimist 15 minutit temperatuuril 4 °C. C ja 13 500 pööret minutis ning analüüsiks süstiti supernatandi 10 ml alikvooti.

Uriiniproovide jaoks pandi 100 ml proovi 2 ml katsutisse ja igale uriiniproovile lisati 1 maht PBS-i (m/v), mis sisaldas 50 mM NEM-i. Seejärel lisati metanool (1000 ml, mis sisaldas IS 10 ng ml - 1) ja proovi inkubeeriti temperatuuril - 20. C 20 minutit ja seejärel tsentrifuugiti 12 000 p/min juures 10 minutit 4 °C juures. C. Supernatant (1000 ml) aurustati nõrga lämmastikujoa all toatemperatuuril kuivaks, seejärel lahustati jääk 60 ml liikuvas faasis ja segati 1 minut enne tsentrifuugimist kiirusel 13 500 p/min ja 4 . C 15 minutit. Analüüsiks süstiti 10 ml alikvooti supernatanti.

Metoodika kinnitamine

Analüüsi valideerimine viidi läbi vastavalt dokumendile "Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation" (Food and Drug Administration, september 2013). Kalibraatorid genereeriti, kasutades asendusmaatriksit Trp, Kyn, GSH, GSSG, 5-HT, 5-HTP, N-Phe ja CA jaoks standardsetest töölahustest "eemaldatud" seerumis. Iga kontsentratsiooni kalibraator dubleeriti. Standardkõver arvutati standardkõvera kalibraatori kontsentratsioonide ja analüüdi ja IS-i piigi pindala suhte 1/X kaalutud vähimruutude lineaarse regressiooniga.

Täpsus- ja täpsusanalüüs

Ühendatud QC proovide ja töötlemata roti seerumi/uriini QC proovide analüüsi täpsust hinnati ühe päevasisese ja kolme päevadevahelise analüüsiga. Kolme erineva kontsentratsiooniga QC proovid saadi L-trüptofaani, L-künureniini, GSSG, N-fenüülatsetüülglütsiini, 5-HTP, L-leutsiini, 5-HT, koolhappe ja GSH-NEM lisamisega. standardlahused "eemaldatud" seerumile/PBS-ile, mida seejärel töödeldi samal viisil kui in vivo proove. Proovige, Kyn, GSSG, N-Phe, 5-HTP, 5-HT, Leu ja CA standardlahused (1 mg ml- 1) valmistati 10 0% metanooli, välja arvatud GSH, mis valmistati 0,5 mg ml - 1 10 mM NEM PBS puhvris. Kaheksa erineva kontsentratsiooni standardkõverad genereeriti samamoodi nagu QC proovid ja analüüsiti 1/X kaalutud vähimruutude lineaarse regressiooniga. Meetodi valideerimise uuringu jaoks viidi samaaegselt läbi teine ​​kvaliteedikontrolli meetod, kasutades igast kontroll- või mudelrühma proovist kombineeritud seerumit/uriin (50 ml), et saada QC proov, mida seejärel töödeldi in vivo proovidena. Iga 50 loomaproovi kohta viidi läbi QC proovide seeria ja standardkõverad.

Maatriksiefektid

Maatriksi variatsiooni, mis on määratletud kui analüüsi täpsuse varieeruvus maatriksi eri partiide puhul, hinnati kuue erineva graafikuga roti seerumi/uriini analüüsiks ja terava taastumise hindamiseks.17 Kogu maatriksi mõju hindamine endogeense ühendi testis on keeruline. . Üks võimalus testida, kas testil on (üldine) maatriksiefekt, on hinnata suurenenud taastumist. Suurenenud saagise test hõlmab analüüdi lisamist ekstraheerimiseelsetesse proovidesse, mis erineb maatrikstegurite (MF) testist, mis hõlmab analüüdi lisamist ekstraheerimisjärgsetesse proovidesse.18 MF arvutati analüüdi piigi pindalana bioloogilise maatriksi olemasolu võrreldes bioloogilise maatriksi puudumisega. Kasutati IS-normaliseeritud MF: MF ¼ piigi pindala/IS suhe maatriksi juuresolekul vs piigi pindala/IS suhe maatriksi puudumisel.

UPLC-MS/MS analüüs

LC-MS jaoks kasutati Waters X BridgeTM BEH C18 analüütilise kolonniga XP (2,5 mm, 30 × 100 mm; Waters, Torrance, CA) varustatud MS seadmeid. /MS analüüs. Q lineaarset gradiendi liikuvat faasi, mis koosnes 0,1% sipelghappeveest (lahusti A) ja metanoolist (lahusti B), kasutati vastavalt järgmisele gradiendiprogrammile: 0–3.0 min (0–1% B); 3.0–10.0 min (1–3% B); 10.0–14.0 min (3–50% B); 14.{40}}–18,0 min (50–95% B); 18,0–22,0 min (95–0% B), peatusaeg on 25 min. Süstimismaht oli 10 ml ja kiirus 0,6 ml min{42}}. Lõpliku meetodi puhul kasutati järgmisi parameetreid: skannimise tüüp, MRM; ioonrežiim, elektropihustusionisatsioon (ESI) positiivsete ja negatiivsete ioonide režiimides; ioonpihustuspinge, ± 4500 V; kardinagaas, 20; temperatuur 450 °C; iooniallikagaas 1, 40; iooniallika gaas 2, 40. Kõik UPLC-MS andmed saadi tarkvara AB Analyst (versioon 1.6.2) abil ja sisestandardi d5-Phe (DP, 63 V; CE) m/z 171,1–125,2 , 8 V; CXP, 21 V, 24 V) ja üksikasjalikud MS tingimused on näidatud tabelis S1.

Statistiline analüüs

Kõik väärtused väljendati keskmisena ± SD. Rühmadevaheliste erinevuste olulisust võrreldi ühesuunalise ANOVA testiga, millele järgnes Dunnetti test, kasutades programmi Statistical Package for Social Sciences (SPSS 20.0, Chicago, IL, USA). Selles testis määrati olulisuse lävi p < 0,05.

Tulemused ja arutlus

GC-de mõju emakale

GC-de mõju hindamiseks emakale kasutati emaka kaalu ja histoloogilist analüüsi. Emaka kaal suurenes oluliselt dietüülstilbestrooli, GC ja kontrollrühmades võrreldes tühja rühmaga (P < {0}},01). Tühirühmas oli endomeetriumi epiteel madala sambakujuline, väikeste näärmetega, kuubikujulise näärmeepiteeliga ja ilma interstitsiaalsete põletikurakkudeta. Dietüülstilbestrooli rühmas olid näärmeepiteel ja endomeetrium kõrge sammaskujulised ja näitasid hüperplaasiat koos paljude interstitsiaalsete põletikuliste rakkudega. GC rühmas olid näärmeepiteel ja endomeetrium väga sammaskujulised ning neil oli hüperplaasia koos paljude interstitsiaalsete põletikuliste rakkude ja sisekesta paksenemisega. Kontrollrühmas oli endomeetrium kõrge sammaskujuline ja näärmeepiteel madala sambakujuline, interstitsiaalseid põletikurakke oli vähe. Võrreldes tühja rühmaga oli emaka epiteelirakkude kõrgus teistes rühmades oluliselt suurenenud (P < 0,01) (joonis 1).

Tuvastatud biomarkeri valideerimise meetod UPLC-MS/MS abil

Lineaarsus ja kalibreerimisvahemik

Iga mõõtmise jaoks koostati uuritud maatriksis lineaarne kalibreerimiskõver kaaluteguriga 1/X. Seerumi analüüside kalibreerimiskõveraid analüüsiti erinevatel päevadel. Analüüside kalibreerimisvahemikud jaotati seitsme kalibreerimispunkti vahel, nagu on näidatud tabelis 1.

Täpsus ja täpsus. Meetod osutus kõigi uuritud proovide täpsuse ja täpsuse osas nii päevadevaheliseks kui ka päevasiseseks sobivaks. Nende parameetrite väärtused olid GSH, GSSG, Leu, Trp, Kyn, 5-HTP, koolhappe, 5-HT ja N-fenüülatsetüülglütsiini jaoks kolme kordusega määratud kontsentratsioonidel alla 5%. iga analüüsitud kontsentratsiooni kohta. Päevadevahelistele ja päevadevahelistele täpsuse ja täpsuse väärtustele vastavad andmed on näidatud ESI tabelis S2.

Maatriksiefektid

Nagu on näidatud ESI tabelis S3, olid suurenenud saagised 92,5–118,1%, kui lisati 1000 ng ml- 1 GSH-d, 2000 ng ml- 1 GSSG-d, 1000 ng ml- 1 Leud-d , 6000 ng ml- 1 Trp-d, 50 ng ml- 1 Kyni, 2 ng ml- 1 5-HTP-d, 400 ng ml- 1 koolhapet , 8 ng ml- 1 5-HT-d ja 2500 ng ml- 1 N-fenüülatsetüülglütsiini kolme erinevasse roti seerumi graafikusse ning lisades 100 ng ml- 1 GSH, 200 ng ml- 1 GSSG-d, 1000 ng ml- 1 Leud-d, 6000 ng ml- 1 Trp-d, 50 ng ml- 1 Kyn-i, 2 ng ml{ {37}} 5-HTP-d, 400 ng ml- 1 koolhapet, 8 ng ml- 1 5-HT-d, 2500 ng ml- 1 N -fenüülatsetüülglütsiini kolmeks erinevaks erineva algtasemega roti uriini graafikuks. Nende partiide mõõdetud Trp ja Kyn kontsentratsioonide CV-d olid #10% (n ¼ 5). Need tulemused näitasid, et erinevad maatriksid ei mõjutanud analüüsi oluliselt.

LOODUSLIK TUBULOOS EMAKAVÄHI VÄLTIMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Metaboliitide profiilide koostamise analüüs pseudo-sihitud meetodil

Pseudosuhtmärgiga meetodit kasutati seerumi ja uriini metaboliidi MRM prolingi uurimiseks neljas rühmas (tühi, dietüülstilbestrool, kontroll ja GC).

Esiteks loodi PCA mudel, et näidata nelja rühma metaboolset eristust. Mitmemõõtmelise analüüsi põhjal ilmnesid GC rühmade (sealhulgas dietüülstilbestrooli ja kontrollrühmad) ja tühja rühma vahel ilmsed metaboolsed erinevused. QC proovid koondusid tihedalt PCA skoordiagrammi, mis näitas, et süsteemi stabiilsus oli selle metaboolse uuringu jaoks kohandatav (joonis 2).

Seejärel määrati selles uuringus oluliselt erinevate metaboliitide jaoks kriitiliseks P-väärtuseks 0,05. Vastavalt sellele, nagu on näidatud tabelis 2, identifitseeriti esialgselt tühja rühmaga võrreldes erinevad metaboliidid järgmiselt: 17 seerumiproovides ja

12 uriiniproovides GC rühmas, 15 seerumiproovides ja 9 uriiniproovides dietüülstilbestrooli rühmas, 12 seerumiproovides ja 11 uriiniproovides kontrollrühmas ning 11 seerumiproovides ja 7 uriiniproovides, mis olid samaaegselt GC, dietüülstilbestrooli ja kontrollrühmades. Et paremini mõista metaboolseid erinevusi erinevate rühmade vahel, koostati kõigi diferentsiaalsete metaboliitide jaoks rühmitav soojuskaart, mis näitab suhtelist suurenemist (punane) või vähenemist (roheline) (joonis 3).

Kaheksateist erinevat metaboliiti, mis esinesid samaaegselt GC-s, dietüülstilbestroolis ja kontrollrühmades, kirjeldati kui

järgmine: glükoos, sidrunhape, proliin, betaiin, ornitiin, N-fenüülatsetüülglütsiin, fenüülpüroviinamarihape, inosiin, C16:0LPC, kreatiniin ja ksantosiin seerumis ning benseenatsetüülglütsiin, püroglutamiinhape, atsetüülkarnitiin, atsetüül- ja Täheldati, et N6-atsetüüllüsiini sisaldus uriinis vähenes oluliselt (P < 0.05); samas kui tauriini, ornitiini, a-ketoglutaarhappe ja spermidiini sisaldus uriinis suurenes oluliselt (P < 0.05). Lisaks suurenes oluliselt tauriini (seerumi) sisaldus, samas kui a-ketoglutaarhappe (seerum), C18:0LPC (seerum) ja betaiini (uriin) sisaldus vähenes dietüülstilbestrooli ja GC rühmades oluliselt (P < {{ 19}}.05); L-künureniini (seerumi) tase oli dietüülstilbestrooli rühmas ülesreguleeritud, kuid GC rühmas allareguleeritud (P < 0,05); püroglutamiinhappe (seerumi) ja proliini (uriin) tase vähenes ning sidrunhappe (uriin) ja nikotiinamiidi (uriin) tase suurenes märkimisväärselt kontroll- ja GC rühmas (P < 0,05); ja fenüülalaniin oli GC rühmas alla reguleeritud (P < 0,05).

Selles uuringus uuriti GC-de mõju ebaküpsete rottide emakale. Emakas on kõige tundlikum organ kemikaalide ER-st sõltuva toime analüüsimiseks.Herba Cistancheson teatatud, et see kutsub esile emaka kaalu suurenemise, suurendades hüpotalamuse-hüpofüüsi-munasarja lutropiini vabastavat funktsiooni, 20 mida täheldati ka selles uuringus GC-de puhul. See näitas, et GC-del on östrogeenne toime. Hiljuti on aruanded keskendunud peamiselt domineerivale mehhanismile, mille abil östrogeenset toimet väljendatakse ER-idega seondumise kaudu, 21–23, kuid metaboolset mehhanismi ei ole põhjalikult uuritud. Selles uuringus kasutati GC-de östrogeenitaolise mehhanismi uurimiseks pseudometaboloomika meetodit.

Järjestikuste reaktsioonide seeria metaboolsed vaheühendid muutusid rohkem väljendunud viisil kui ensümaatiline kineetika või individualiseerub.24 Seitseteist metaboliiti seerumis, sealhulgas glükoos, sidrunhape, tauriin, proliin, betaiin, ornitiin, püroglutamiinhape, a-ketoglutaarhape, N- fenüülatsetüülglütsiin, fenüülpüruvaathape, inosiin, C18:0LPC, C16:0LPC,

kreatiniin, fenüülalaniin, L-künureniin ja ksantosiin ning 12 metaboliiti uriinis, sealhulgas benseenatsetüülglütsiin, betaiin, tauriin, sidrunhape, ornitiin, püroglutamiinhape, atsetüülkarnitiin, N6-atsetüüllüsiin, a-nikotiinamiid leiti, et hape, spermidiin ja proliin osalevad GC-de östrogeenitaolises mehhanismis. Erilist huvi pakkusid mitmed muutunud metaboliidid, kuna need esinesid nii seerumis kui ka uriinis. Näiteks sidrunhape, mis moodustub atsetüülkoensüümi A ja oksaloäädikhappe kondenseerumisel ja millel on oluline roll energia metabolismiga seotud sidrunhappe tsüklis,25 oli GC rühma seerumis alareguleeritud, kuid uriinis ülesreguleeritud. . Veelgi enam, glutamiini süsiniku raamiga a-ketoglutaarhape, mis suudab säilitada üldlämmastiku tasakaalu ja soodustab valgusünteesi ning on sidrunhappe tsükli keskne materjal, oli GC rühma seerumis allareguleeritud, kuid ülesreguleeritud. uriinis.26 Sidrunhappetsükkel ei ole mitte ainult kolme peamise toitaine (süsivesikud, lipiidid ja aminohapped) viimane ainevahetusrada, vaid ka seos suhkru, lipiidide ja aminohapete metabolismi vahel ning peamine energia hankimise viis. keha jaoks.27,28 See näitas, et GC-de östrogeenilaadne mehhanism oli seotud energia metabolismiga, mis on sama mis dietüülstilbestroolil. Seetõttu oli GC-dega ravitud ebaküpsetel rottidel selge seos sidrunhappe tsükli ja emaka kaalu suurenemise vahel. Olulise metüüldoonorina mängib betaiin olulist rolli loote kasvus ja arengus, mis näitab, et betaiin on seotud emaka kaalu suurenemisega.29 Huvitav on see, et tauriin oli nii seerumis kui ka uriinis ülesreguleeritud, mis võib soodustada lipiidide seedimist ja imendumist. ning rakkude omastamist ja glükoosi kasutamist, soodustades glükoosi metabolismi. On teatatud, et tauriinipuudus põhjustab noortel loomadel kehakaalu langust, mis viitab sellele, et tauriinil on oluline roll kasvus ja arengus.30 Lisaks järgis betaiini ja tauriini reguleeriv toime GC-de poolt sama suundumust, kasutades dietüülstilbestrooli, kuid suurendatud kontsentratsiooniga. võrreldes dietüülstilbestrooliga.

Lisaks muudeti oluliselt paljusid aminohappeid. Meie tulemused näitasid, et GC-d põhjustasid aminohapete metaboolseid kõrvalekaldeid. Aminohapete metabolismi saab kasutada spetsiifiliste valkude, peptiidide ja muude lämmastikku sisaldavate ühendite sünteesiks või dekarboksüülimiseks deamineerimise, transamiinimise teel, kombineerituna ammoniaagi lagundamisega või energia vabastamiseks sidrunhappe tsükli kaudu. ühendid võivad olla seotud oluliste signaalisündmustega, mis vallandavad emaka massi suurenemise.

Lisaks jaotati üksikasjaliku radade analüüsi jaoks diferentsiaalsed metaboliidid mitmeks peamiseks rajaks, sealhulgas tsitraaditsükkel (TCA tsükkel), glutatiooni metabolism,

arginiini ja proliini metabolismi, D-glutamiini ja D-glutamaadi metabolismi, fenüülalaniini, türosiini ja trüptofaani biosünteesi, fenüülalaniini metabolismi ja muid teid, kasutades Pathway Analysis of MetaboAnalyst tarkvara (http://www.metaboanalyst.ca), nagu näidatud. 4. Energia metabolismiga seotud rada, sealhulgas TCA tsükkel ja glutatiooni metabolism (nii seerumis kui ka uriinis), oli üks östrogeense toime peamisi sihtmärke. Östrogeensete kemikaalide kriitilist rolli energia metabolismis kinnitasid varasemate uuringute kohaselt mitokondriaalseks funktsiooniks, TCA tsükliks ja muuks vajalikke geene reguleerivad ER-d.33,34 Võib järeldada, et GC-de östrogeenilaadne mehhanism oli sarnane. dietüülstilbestrooli omaga, kusjuures mõlemad on mingil määral seotud TCA tsükli ja glutatiooni metabolismiga, kuid GC-d toimivad paremini kui dietüülstilbestrool.

Kuigi võimalikke mehhanisme ei suudetud selles uuringus selgitada, valiti välja mõned metaboliidid, mida saaks tulevikus kasutada GC-de teiste östrogeensete mehhanismide uurimiseks emakas. Seetõttu rakendatakse tulevastes uuringutes mehhanismi paremaks uurimiseks muid tehnoloogiaid, näiteks proteoomikat.

Järeldused

Kokkuvõtteks võib öelda, et GC-de östrogeensete mehhanismide uurimiseks loodi UPLC-QTRAP MS-il põhinev seerumi ja uriiniga pseudothitud metaboloomika meetod, mis andis kindlaid ja usaldusväärseid tulemusi. Kasutades väljakujunenud pseudo-sihitud lähenemisviisi, avastati terviklik vaade östrogeenitaolise mehhanismi (GC) seerumi ja uriini metaboloomika muutustele.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%