Tüvirakud regeneratiivseks meditsiiniks ja vananemisvastaseks raviks, 1. osa

Palun võtke ühendustoscar.xiao@wecistanche.comrohkem informatsiooni

Abstraktne:Sigade jäätmete töötlemise parandamise meetodite uurimiseks hüdrolüüsiti sea nahk erinevate kaubanduslikult saadavate proteaaside (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex ja Papain) abil mitmes optimaalses olukorras. Pärast ensümaatilist hüdrolüüsi fraktsioneeriti kollageeni hüdrolüsaadid (CH) molekulmassi järgi (3 kDa) membraani ultrafiltrimise teel. CHS-i analüüsiti nii füüsikaliste omaduste (pH, valkude taastumine, vabade aminorühmade sisaldus, molekulmassi jaotus ja aminokoostis) kui ka funktsionaalsete omaduste (antioksüdantne toime ja vananemisvastane toime) suhtes. CH-de hulgas oli Alcalase (CH-Alcalase) poolt hüdrolüüsitud CH-de hüdrolüüsiaste teiste CH-dega võrreldes kõrgeim. Nii "CH-Alcalase" kui ka "CH-Alcalase".<3 kda"="" fractions="" showed="" a="" considerably="" high="" antioxidant="" activity="" and="" collagenase="" inhibition="" activity.="" therefore,="" resulting="" bioactive="" have="" the="" potential="" for="" development="" as="" antioxidants="" and="" anti-aging="" ingredients="" in="" the="" food,="" cosmetics,="" and="" pharmaceuticals,="" from="" animal="">

Märksõnad:hüdrolüüs; kaubanduslikud proteaasid; kollageeni hüdrolüsaat; antioksüdant; Vananemisvastane

Lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Oodatava eluea pikenedes pööratakse palju tähelepanu naha vananemisvastastele protseduuridele. Kollageeni, mida kasutatakse nahahooldustoodetes vananemisvastase kosmeetilise koostisosana, kasutatakse kosmeetikaturul laialdaselt. Kollageen on suure molekulmassiga loomset päritolu kiuline valk, mida leidub rohkesti inimeste ja loomade sidekoes, nahas, kõõlustes, kõhredes, sidemetes, hammastes, küüntes ja juustes. Kariloomad on endiselt peamine tööstusliku kollageeni allikas[1]. Toidu- ja lihatööstus viskab maailmas igal aastal jäätmetena ära suures koguses loomakasvatuse kõrvalsaadusi. Siiski võib neid kasutada oluliste valguressurssidena uute toidumaterjalide jaoks või muuta lisandväärtusega toodeteks hüdrolüüsi teel, mida kasutatakse laialdaselt valkude funktsionaalsete ja toiteomaduste parandamiseks ja täiustamiseks [2, 3]. Kollageeni peetakse üha enam ka bioaktiivsete peptiidide allikaks, mis on osutunud paljulubavaks kasulike ühenditena kasutamiseks toitumis- või farmaatsiarakendustes.cistanche eelised,Seetõttu võib kollageeni hüdrolüüs mängida olulist rolli selle biosaadavuse ja mitmesugustes kaubanduslikes protsessides kasutamiseks sobivuse parandamisel.

Bioaktiivsete peptiidide füsioloogiline aktiivsus, mis tavaliselt sisaldavad 2-20 aminohappejääki (<6000 da),="" are="" based="" on="" the="" composition="" and="" sequence="" of="" their="" amino="" acids="" [2,4].="" due="" to="" their="" structural="" properties="" such="" as="" molecular="" weight,="" bioactive="" peptides="" may="" possess="" specific="" characteristics="" that="" affect="" numerous="" physiological="" processes="" related="" to="" antimicrobial,="" antioxidant,="" emulsifying,="" antihypertensive,="" antidiabetic,="" and="" immunomodulatory="" functions="" in="" organisms[1,5,6].="" generally,="" low="" molecular="" weight="" hydrolysates="" display="" lower="" viscosity,="" better="" dispersion,="" higher="" hydrophobicity,="" and="" smaller="" particle="" size="" [7].="">cistanche kolesteroolHüdrolüüsi aste mõjutab otseselt hüdrolüsaatide molekulmassi ja aminohappelist koostist [8]. Seetõttu võib hüdrolüüsiprotsess olla vajalik uute bioaktiivsete peptiidide tootmiseks.

Cistanche on vananemisvastane toime

Valkude hüdrolüüsi, mis viib peptiidsidemete lõhustamiseni, võib läbi viia ensümaatiliste või keemiliste protsesside kaudu [9]. Keemilised protsessid, sealhulgas leeliseline või happeline hüdrolüüs lahustiga ekstraheerimisega, on kahjulikud mitte ainult keskkonnale, vaid ka inimestele, kes tarbivad saadud tooteid [4,10]. Keemilised protsessid, mida on raske kontrollida, annavad modifitseeritud aminohappeid sisaldavaid tooteid [9]. Seevastu ensümaatilist hüdrolüüsi võib läbi viia kergetes tingimustes, vältides seega ekstreemseid keskkondi, mida keemiline töötlemine nõuab. Lisaks ei tekita protsessid kõrvalreaktsioone ega vähenda valguallika toiteväärtust [8]. Valkude hüdrolüüsimiseks kasutatakse tavaliselt mitmeid proteaase, sealhulgas Alcalase, pepsiini, Protamex, trüpsiini ja Neutrase, mille tulemuseks on erinevat tüüpi valgu hüdrolüsaadid ja peptiide, millel on mitmesugused biofunktsionaalsed toimingud. Ühes uuringus teatati antioksüdantse toimega kollageeni hüdrolüsaatide tootmisest sea naha želatiinist, kasutades pepsiini ja pankreatiini ensümaatilist hüdrolüüsi [11].cistanche deserticola kõrvaltoimedLõhe kõrvalsaadused hüdrolüüsiti erinevate proteaaside abil peptiliste hüdrolüsaatide saamiseks, kus lõplikel peptiididel olid suurepärased antioksüdantsed ja põletikuvastased omadused [12].

Uurimistöö eesmärk oli:(a) tuvastada kõige aktiivsemad kollageeni hüdrolüsaadid, mis on toodetud ensümaatilise hüdrolüüsi teel, kasutades erinevaid kaubanduslikult saadavaid proteaase (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Protamex, Bromelain ja Papain);(b) kinnitada fraktsioneerimisefekti ensümaatilisel hüdrolüüsil saadud kollageeni hüdrolüsaadid ja (c) määrata nende in vitro antioksüdantne ja vananemisvastane toime.

2. Tulemused ja arutelu

2.1. Ensümaatilise hüdrolüüsi mõju kollageeni hüdrolüsaatidele

2.1.1.pH

Valkude funktsionaalseid omadusi võib suurendada teatud proteaaside hüdrolüüsi kaudu. Selles uuringus kasutati sea nahast kollageeni hüdrolüüsimiseks kuut erinevat proteaasi (Alcalase, Flavorzyme, Neutrase, Bromelain, Protamex ja Papain), et saada madala molekulmassiga aktiivseid kollageeni hüdrolüsaate.cistanche dosage redditPH muutus kollageeni hüdrolüsaatides (CH) on näidatud joonisel 1. Kollageeni suspensiooni (5% seanaha segu) pH oli algselt 6.39-6,55 (0h juures). CH-Alcalase ja CH-Flavorzyme saavutasid optimaalse pH (pH 8.0) 12-tunnise inkubeerimisega. CH-Protamex, CH-bromelain ja CH-papain saavutasid optimaalse pH (pH7.0) 6-tunnise inkubeerimisega, samas kui CH-Flavorzyme jätkas pH 6,39-lt pH 5,69-le 24-tunnise inkubeerimise jooksul (joonis). 1). Valgu hüdrolüsaadi pH on oluline tegur, mis reguleerib ensümaatilisi hüdrolüüsireaktsioone[13]. Seetõttu võib kollageeni hüdrolüsaatide teke erineva pH tingimustes olla tingitud pH-st sõltuvatest muutustest ensüümi konformatsioonis, mis võib mõjutada nende bioaktivatsiooni ja füüsikalis-keemilisi omadusi.

2.1.2. Naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforees (SDS-PAGE)

Näidatud on 24 tundi erinevate proteaasidega töödeldud CH-de naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesi (SDS-PAGE) profiilid (joonis 2). Kollageeni suspensiooni peptiidprofiil (0 h) näitas nähtavat riba madala kuni kõrge molekulmassiga vahemikus. Tulemused näitasid kiiret hüdrolüüsi CH-Alcalase, CH-Neutrase, CH-Bronneline ja CH-Protamex puhul, kuna pärast 3-tunnist inkubeerimist ei olnud ribasid. CH-Alcalase, CH-Neutrase ja CH-Protamexi kõrge molekulmassiga vahemikud vähenesid ajast sõltuval inkubatsioonil. CH-Bromeliin aga inkubatsiooniajaga ei muutunud, kuna selle õlu on pärast 1-tunnist inkubeerimist täielikult hüdrolüüsitud. Huvitaval kombel kadusid CH-d täielikult, kui proov reageeris Alcalase või Neutrase'iga 6 tundi, mis näitab, et kollageen toimis mõne muu testitud ensüümi jaoks sobiva substraadina.cistanche ekstrakti eelised,Kuid CH-Flavorzyme'i ja CH-Papaiini ribad ilmusid madala kuni kõrge molekulmassiga vahemikku 24 tunni pärast. Valke saab osaliselt hüdrolüüsida peptiidideks või aminohapeteks ensümaatilise hüdrolüüsi teel, olenevalt proteaasi tüübist, inkubatsiooniajast ning proteaasi ja substraadi suhtest (valgu kogus)[14]. Ensümaatilise hüdrolüüsi protsessi määrab peamiselt see, kas kaasatud proteaasi tüüp on endopeptidaas või eksopeptidaas [15,16]. Kuna Alcalase, Neutrase ja Protamex on endopeptidaasid, võib eeldada, et nende hüdrolüüsiprotsessid lõhuvad juhuslikult peptiidsidemed mitteterminaalsetest aminohapetest, hõlbustades seeläbi valkude edasist hüdrolüüsi. Teisest küljest on Flavorzyme nii endo- kui ka eksopeptidaas, mis lõhub peptiidahelate mitte- või N-otsa. Selles uuringus sisaldas kollageenivalk sidumissaite, mis olid tundlikumad eksopeptidaasi kui Flavorzyme'i endopeptidaasi aktiivsuse suhtes. Seega, eksopeptidaasi aktiivsuse tõttu hõlmas kollageenvalkude hüdrolüüs Flavorzyme'i poolt aminohapete N-otsast peptiidsidemete järkjärgulist katkemist, mis aeglustas valgu hüdrolüüsi.

2.1.3. Valkude taastamine ja tasuta aminorühma sisu

Näidatud on erinevate kaubanduslike proteaaside kaudu saadud CH-de valgu taastumine (joonis 3A). Kontrolli (kollageeni suspensiooni) valgusisaldus oli 1,19 mg/ml. Valgu taastumine on ensümaatilise hüdrolüüsi efektiivsuse parameeter. CH madal valgusisaldus näitab suurenenud valkude lagunemist. Lisaks korreleerub valkude taastumine hästi valgu lahustuvusega. Suuremat hüdrolüütilist aktiivsust võib põhjustada katmata hüdrofoobsete külgahelate suurenemine, mis põhjustab valkude ja/või peptiidide vahelise hüdrofoobse interaktsiooni suurenemist. Need hüdrofoobsed külgahelad võivad põhjustada valgu lahustuvuse vähenemist, mille tulemuseks on hüdrolüsaatide valkude suurem taastumine. Meie uuringus oli valgu taastumise sisaldus hästi korrelatsioonis SDS-PAGE mustrite muutustega. Madalaim ja kõrgeim valgusisalduse tase registreeriti vastavalt Alcalase ja Flavorzyme hüdrolüüsi puhul. Inkubatsiooniajaga seotud hüdrolüüsi efektiivsuse jaoks vähenesid CH-Alcalase, CH-Bromelain ja CH-Protamex ühe tunni jooksul pärast inkubeerimist kontrolliga võrreldes drastiliselt. Valgu hüdrolüüsist tulenev valgusisalduse vähenemine näitas pöördvõrdelist seost aminorühma sisaldusega. Lisaks oli enamikul CH-del, välja arvatud CH-neutraasil, madal valgusisaldus vahemikus 3 kuni 12 tundi. Pärast 24. inkubeerimist suurenes nende valgusisaldus uuesti CH-Alkalaasi, CH-Flavorzyme, CH-Neutrase, CH-Bromeline, CH-Protamex ja CH-Papain puhul järgmiselt:0.83 mg/mL, 1,29 mg/ ml, 0,75 mg/ml, 0,97 mg/ml, 0,77 mg/ml ja 1,11 mg/ml vastavalt. Mõned aruanded näitavad, et optimaalne hüdrolüüsiaeg sõltub mitmest tegurist, näiteks valitud liigist, toorainest, kasutatud ensüümist, tooraine/ensüümi kiirusest, ensüümi kontsentratsioonist ja hüdrolüüsi astmest jne. [16 ]. Mõned aruanded näitavad, et pikendatud ensümaatiline hüdrolüüs (üle 24 tunni) võib viia proteaasi aktiivsuse vähenemiseni; seega tuleks ensümaatiline hüdrolüüs läbi viia 24 tunni jooksul pärast ensümaatilist hüdrolüüsi [17,18].

The free amino group content of CH, which is an indicator of enzymatic hydrolysis efficiency, was estimated(Figure 3B). The expected outcome of protein breakdown is that protein may be hydrolyzed into shorter peptide products. The free amino group content of the control was initially 0.14 mg/mL. The free amino group content of all CHs dramatically increased with increasing incubation time. After 24 h incubation, the free amino group content by descending order was: CH-Alcalase (1.00 mg/mL)>CH-Protamex(0.70 mg/mL)> CH-Neutrase(0.68 mg/mL)>CH-Bromeline (0.67 mg/mL)>CH-Flavorzyme (0.53 mg/mL)>CH-papaiin(0,40 mg/mL). Ensümaatiliselt hüdrolüüsitud proovide üldvalgu või vabade aminorühmade sisalduse tavalised erinevused võivad olla seotud ensüümi spetsiifilisusega. See sõltub ensüümi omadustest ensümaatilise hüdrolüüsi protsessis [16,17]. Näiteks leeliselised proteaasid (nagu Alcalase) omavad kõrgemat hüdrolüütilist aktiivsust kui happelised või neutraalsed proteaasid.

2.2. Ultrafiltratsiooni mõju kollageeni hüdrolüsaadi omadustele

Ultrafiltreerimisprotsess võib olla kasulik, tööstuslikult soodne meetod soovitud molekuli suuruse ja kõrge bioaktiivsusega väikeste peptiidifraktsioonide tootmiseks, olenevalt lähtehüdrolüsaadi koostisest ja uuritavast aktiivsusest [19]. Näidatud on lahustuvus, vabade aminorühmade sisaldus ja CH-de saagis pärast lüofiliseerimist (tabel 1). Kontrolli lahustuvus ja vabade aminorühmade sisaldus olid vastavalt 11,95 protsenti ja 0,79 protsenti. Pärast ensümaatilist hüdrolüüsi ja ultrafiltratsiooni 3 kDa molekulmassi piirväärtusega täheldati CH-alkalaasil suurimat lahustuvust (21,17 protsenti) ja vabade aminorühmade sisaldust (14,17 protsenti).<3 kda.="" however,=""><3kda was="" the="" lowest="" field="" (12.42%)observed.="" therefore,="" although="" ultrafiltration="" is="" useful="" in="" separating="" chs="" with="" low="" molecular="" weight,="" it="" may="" cause="" a="" reduction="" in="">

Valguhüdrolüsaatide keskmine molekulmass on oluline tegur, mis määrab nende bioloogilised omadused [19]. Üldiselt MW-ga keskmine murdosa<3 kda="" represents="" a="" collagen="" hydrolysate;="" an="" average="" fraction="" with="" mw=""> 50 kDa represents gelatin, and an average fraction with MW>300 kDa tähistab kollageeni [20,21]. Kontrolli (eeltöötlusproovi), CH-Alcalase ja CH-Alcalase suhteline molekulmassi jaotus<3 kda="" is="" depicted="" in="" figure="" 4.="" the="" molecular="" weight="" distribution="" was="" over="" 20,100="" da="" for="" the="" control,="" which="" did="" not="" include="" the="" collagen="" hydrolysate=""><3 kda).="" this="" could="" not="" be="" numerically="" provided="" in="" this="" study,="" as="" the="" detection="" limit="" of="" the="" index="" detector="" system="" only="" ranged="" from="" 106="" to="" 20,100="" da.="" however,="" ch-alcalase="" showed="" detectable="" values="" in="" a="" higher="" range="" of="" relative="" molecular="" weight="" distribution,="" which="" ranged="" from="" 20,100="" da="" to="" 4270="" da="" (maximum="" peak:12,600="" da).in="" ch-alcalase=""><3 kda,="" the="" molecular="" weight="" distribution="" mainly="" showed="" three="" peaks:="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 4270="" da(maximum="" peak),="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 424="" da,="" and="" one="" with="" an="" mw="" of="" approximately="" 222="" da="" and="" 102="" da.="" ultrafiltration="" is="" an="" effective="" purification="" method="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight="" peptides="" from="" crude="" hydrolysates.="" results="" indicated="" that="" enzymatic="" hydrolysis="" by="" alcalase="" clearly="" reduced="" the="" high="" mw="" of="" the="" control="" (either="" collagen="" or="" gelatin),="" and="" that="" ultrafiltration="" was="" an="" effective="" purification="" method="" that="" can="" be="" used="" to="" obtain="" low="" molecular="" weight=""><3 kda)="" from="" crude="" collagen="" hydrolysates.="" reportedly,="" low="" molecular="" weight="" peptides="" (2-20="" amino="" acids)="" are="" more="" biologically="" active="" compared="" to="" their="" parent="" polypeptide/="" proteins,="" which="" are="" larger="">

CH-de aminohapete koostis on näidatud (tabel 2). Erinevate proteaaside CHS-il oli erinev aminohappeline koostis ja antioksüdantsed omadused [23]. Kollageeni aminohappeline koostis oli rikas glütsiini (Gly), proliini (Pro) ja glutamiinhappe (Glu) poolest. CH-de aminohapete sisaldus (CH-Alcalase ja CH-Alcalase<3 kda)="" increased="" more="" than="" that="" of="" the="" control,="" following="" enzymatic="" hydrolysis="" with="" or="" without="" ultrafiltration.="" in="" particular,="" the="" content="" of="" gly,="" pro,="" and="" glu="" was="" much="" higher="" in=""><3 kda(gly="" 218="" mg/g,="" pro="" 152="" mg/g,="" and="" glu="" 120="" mg/g)="" than="" ch-alcalase(gly149="" mg/g,="" pro="" 95mg/g,="" and="" glu78="" mg/g).="" an="" increase="" in="" the="" content="" of="" these="" amino="" acids="" is="" strongly="" related="" to="" enhanced="" antioxidant="" capabilities="" 16,20].="" gly="" and="" pro="" contain="" hydrophobic="" amino="" acid="" groups,="" and="" glu="" contains="" negatively="" charged="" amino="" acid="" groups.="" these="" amino="" acids="" have="" been="" reported="" to="" enhance="" antioxidant="" activity="" because="" of="" their="" increased="" solubilities="" in="" lipids="" or="" via="" free="" radical="" reactions="">

See artikkel on välja võetud ajakirjast Molecules 2019, 24, 1104; doi:10.3390/molecules24061104 www.mdpi.com/journal/molecules