Spike ja Nsp6 on SARS-CoV-2 Omicron BA.1 sumbumise peamised määrajad

SARS-CoV-2 Omicroni variant on immuunvastust vältivam ja vähem virulentne kui teised seni tunnustatud peamised viirusevariandid1–12. Nende fenotüüpide peamiseks tõukejõuks peetakse Omicron spike (S) valku, millel on ebatavaliselt palju mutatsioone. Siin genereerisime esivanemate SARS-CoV-2 isolaadi selgroos kimäärse rekombinantse SARS-CoV-2, mis kodeerib Omicroni S geeni (BA.1 liin), ja võrdlesime seda viirust looduslikult ringleva Omicroniga. variant. Omicron S-i kandev viirus pääses kindlalt vaktsiinist põhjustatud humoraalsest immuunsusest, peamiselt retseptoriga seonduva motiivi mutatsioonide tõttu; erinevalt looduslikult esinevast Omicronist replitseerub see aga tõhusalt rakuliinides ja primaarsetes sarnastes distaalsetes kopsurakkudes. Sarnaselt põhjustas K18-hACE2 hiirtel viirust kandv Omicron S vähem tõsist haigust kui esivanemate viirus, kuid selle virulentsus ei vähenenud Omicroni tasemeni. Edasine uurimine näitas, et mittestruktuurse valgu 6 (nsp6) muteerimine lisaks S-valgule oli piisav Omicroni nõrgestatud fenotüübi kokkuvõtmiseks. See näitab, et kuigi Omicroni vaktsiini põgenemise põhjuseks on mutatsioonid S-s, määravad Omicroni patogeensuse nii S-valgu sees kui ka väljaspool seda.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

2022. aasta detsembri seisuga on COVID{1}} pandeemia järjestikuseid laineid ajendanud viis peamist SARS-CoV-2 varianti, mida nimetatakse murettekitavateks variantideks (VOC): alfa (B.1.1.7) , Beeta (B.1.351), Gamma (P.1), Delta (B.1.617.2 ja AY liinid) ja Omicron (BA liinid)13. Omicron on viimati tunnustatud LOÜ ja selle dokumenteeris esmakordselt Lõuna-Aafrikas, Botswanas ja Lõuna-Aafrikast pärit reisija poolt Hongkongis 2021. aasta novembris (GISAID ID: EPI_ISL_7605742)14, 15. See levis kiiresti kogu maailmas, tõrjudes nädalatega välja varem domineerinud Delta variandi ja põhjustades 2022. aasta jaanuariks enamiku uutest SARS-CoV{20}} nakkustest (viited 16–18). Seni on tuvastatud vähemalt viis Omicroni liini: BA.1, BA.2, BA.3, BA.4 ja BA.5. BA.1 (edaspidi Omicron) pääseb märkimisväärselt infektsioonist ja vaktsiinist põhjustatud humoraalse immuunsuse eest3,19. Lisaks on see inimestel vähem virulentne kui teised lenduvad orgaanilised ühendid ja in vivo infektsioonimudelid 4, 5, 7, 11, 12, 20. Omicron erineb SARS-CoV-2 prototüübist Wuhan-Hu-1 59 aminohappe poolest; 37 neist muutustest on S-valgus, mis suurendab võimalust, et S on Omicroni patogeense ja antigeense käitumise keskmes.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

S-mutatsioonid mõjutavad Omicroni replikatsiooni rakukultuuris

Omicron S valk sisaldab 3 0 aminohappe asendust, 6 deletsiooni ja ühte 3 aminohappe pikkust insertsiooni, võrreldes Wuhan-Hu-1-ga (laiendatud andmed, joonis 1). 25 neist muutustest on Omicronile ainulaadsed võrreldes teiste lenduvate orgaaniliste ühenditega, kuigi mõnda neist on teatatud reoveest ja SARS-CoV-2 väiksematest variantidest21,22. S-valgu rolli testimiseks Omicroni fenotüübis genereerisime kimäärse rekombinantse viiruse, mis sisaldas Omicroni S-geeni (USA-lh01/2021) ja kõiki teisi esivanemate SARS-CoV-2 (GISAID EPI{) geene. {16}}ISL_2732373)23 (laiendatud andmed, joonis 2a). See kimäärne viirus, nimega Omi-S, valmistati tsirkulaarse polümeraasi pikendusreaktsiooni (CPER)24 modifitseeritud vormi abil (laiendatud andmed joonis 2b), mis andis väga kontsentreeritud viirusevarud, mis sisaldasid 0,5 × 106–5 × 106 naastu moodustavaid aineid. ühikut (PFU) ml kohta transfekteeritud rakkudest kahe päeva jooksul pärast transfektsiooni (laiendatud andmed joonised 2c, d), mis välistab vajaduse viiruse edasise amplifikatsiooni järele.

Joonis 1|S mõju Omicroni in vitro kasvukineetikale. viiruste skeem. S, teravik; N, nukleokapsiid. b–e, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 rakud (b,d) ja Vero E6 rakud (c,e) nakatati MOI-ga 0.01 ja N-positiivsete rakkude protsent (n=6 kordust) (b, c) ja nakkuslike osakeste vabanemine (n=3 kordust) (d, e) määrati voolutsütomeetria ja naastude analüüsiga, vastavalt. f, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 rakud nakatati viiruste segudega vahekorras 1:1, et saada lõplik MOI 0.005 iga viiruse jaoks . Rakud fikseeriti näidatud aegadel ja allutati voolutsütomeetriale. Vasakpoolne esinduslik punktdiagramm; paremal, nakatumata, Omi-S/mCherryga nakatunud, Omicron/mNeoGreen (Omicron/mNG) ja topeltnakatunud rakkude protsent. Kompenseerimiseks kasutati üksikult nakatunud rakke. Vearibad, keskmine ± sd (n {{20}} kordust). g, naastude suurused. Vasakpoolsed esinduslikud kujutised ACE2/TMPRSS2/ Caco-2 rakkude naastudest. Paremal, naastude läbimõõt on kujutatud 20 naastu viiruse kohta keskmisena ± sd. h, inimese iAT2 epiteelirakud nakatati MOI-ga 2, 5 48 või 96 tundi. Rakkude apikaalset külge pesti 1x fosfaatpuhverdatud soolalahusega (PBS) ja nakkavate viirusosakeste tasemeid mõõdeti naastude analüüsiga. Vearibad, keskmine ± sd (n=4 kordust). Katseid korrati kaks korda, kusjuures iga katsekordus sisaldas 3 (b – g) või 4 (h) kordust. P väärtused arvutati kahepoolse, paaritu t-testiga Welchi korrektsiooniga. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 ja ****P < 0,0001; NS, mitte oluline. Voolutsütomeetria väravastrateegia on näidatud täiendaval joonisel 1.

Esmalt võrdlesime Omi-S-i nakatumise tõhusust esivanemate D614G-d sisaldava viirusega (GISAID EPI_ISL_2732373; genereeritud CPER-iga; edaspidi metsiktüüp (WT)) ja Omicroni isolaadiga. (USA-lh01/2021) rakukultuuris (joonis 1a). Selleks nakatasime ACE2- ja TMPRSS2-, mis väljendavad Caco-2 (edaspidi ACE2/TMPRSS2/Caco-2) ja Vero E6 rakke Omi-S, WT ja Omikron infektsiooni kordsusega (MOI) 0,01 ja jälgis viiruse levikut voolutsütomeetria ja naastude moodustumise testiga. WT viirus ja Omi-S levisid kiiresti ACE2/TMPRSS2/Caco-2 rakkudes, saades 24 tundi pärast nakatumist (HPI) vastavalt 89% ja 80% nakatunud rakkudest (joonis 1b). Seevastu Omicron replitseeris aeglasemalt, mille tulemuseks oli 48% nakatunud rakkudest 24 hpi juures. Sarnast mustrit täheldati ka Vero E6 rakkudes, kus 48 hpi juures olid vastavalt 60% ja 41% rakkudest positiivsed WT ja Omi-S suhtes, Omicroni puhul aga 10% (joonis 1c). Naastude analüüs näitas, et kuigi nii Omi-S kui ka Omicron tekitasid WT-ga võrreldes madalamal tasemel nakkusohtlikke viirusosakesi, oli Omi-S viiruse tiiter oluliselt kõrgem kui Omicronil. ACE2/TMPRSS2/Caco-2 rakkudes tootis Omi-S 51- korda (P=0,0006) ja 55- korda (P {{49} }.0312) rohkem nakkavaid osakesi kui Omicron sagedusel vastavalt 12 hpi ja 24 hpi (joonis 1d). Samamoodi olid Vero E6 rakkudes Omi-S-i nakkusliku viiruse tiitrid 17--kordsed (P=0,0080) ja 11--kordsed (P=0,0078) kõrgemad kui Omicronil vastavalt 24 hpi ja 48 hpi (joonis 1e). Erinevus viiruste vahel muutus hilisematel ajahetkedel vähem ilmseks, kuna Omi-S põhjustas Omicroniga võrreldes suuremat tsütotoksilisust (laiendatud andmed, joonis 3a). Omi-S-i suurenenud replikatsioonitõhusus võrreldes Omicroniga säilis, kui testiti erinevate MOI-de juures (laiendatud andmed, joonis 3b). Lisaks kinnitasime Omi-S-i sobivuse eelist Omicroni ees otsese võistluskatsega. Selleks genereerisime esmalt rekombinantse Omicroni (mikron), mis meie rakukultuuri testides jäljendas loodusliku Omicroni replikatsioonikineetikat (laiendatud andmed joonis 4). Järgmisena lõime mCherryt sisaldavad Omi-S ja mNeonGreeni sisaldavad Omicron ning inokuleerisime ACE2/TMPRSS2/Caco-2 rakud nende viirustega, mis olid segatud vahekorras 1:1. Nakatunud rakkude voolutsütomeetriline analüüs erinevatel nakatumise aegadel näitas, et Omi-S/mCherry oli replikatsiooni osas selgelt parem kui Omicron/mNeonGreen (joonis 1f). Lõpuks kajastus Omi-S suurem nakatumise efektiivsus ka naastude suuruses; kuigi WT viirus tekitas suurimaid naastud (umbes 4,1 mm), oli Omi-S naastude suurus (umbes 2,2 mm) kaks korda suurem (P < 0,0001) kui Omicroni naastudel (umbes 1,1 mm) (joonis 1g). Need tulemused näitavad, et kuigi S-valgu mutatsioonid mõjutavad Omicroni nakatumise efektiivsust, ei selgita need täielikult Omicroni fenotüüpi.

Mitmed tõendid näitasid, et Omi-S-i lisatud S-valk käitus samamoodi nagu looduslikus Omicronis. Näiteks nagu eelnevalt kirjeldatud20,25, oli Omicron S nõrgalt lõhustunud võrreldes WT S-ga; kui 71% S-st WT virionides oli lõhustatud kujul, siis ainult 45% ja 47% lõhustati vastavalt Omi-S ja Omicron (laiendatud andmed joonis 5a). Sama S-i lõhustumise muster ilmnes viirusega nakatunud rakkudes (WT, 63% lõhustatud; Omi-S, 33% lõhustatud; Omicron, 42% lõhustatud) (laiendatud andmed joonis 5b). Need katsed näitasid ka, et Omicron S oli ebaefektiivselt inkorporeeritud viirusosakestesse võrreldes WT S-ga (S ja nukleokapsiidi (N) suhe: 3,40 WT viiruse puhul, 1,91 Omi-S ja 2,04 Omicroni puhul) (laiendatud andmed, joonis 5a). Sarnaselt tekitasid nii Omi-S kui ka Omicron WT viirusega võrreldes väiksemat süntsüütiat – tähelepanekust on varem teatatud Omicroni 20, 26 puhul (laiendatud andmed, joonis 5c). Lõpuks, kooskõlas avaldatud kirjandusega25, eelistasid Omi-S ja Omicron katepsiini vahendatud sisenemist, mida peegeldab nende suurem tundlikkus katepsiini inhibiitori E64d suhtes (laiendatud andmed joonis 6). Järgmisena võrdlesime WT, Omi-S ja Omicroni replikatsioonikineetikat kopsuepiteelirakkudes, mis moodustavad COVID-iga patsientidel peamise viiruse replikatsioonikoha (viited 27, 28). Sellest lähtuvalt kasutasime inimese indutseeritud pluripotentse tüvi (iPS) rakkudest pärinevaid kopsu alveolaarseid 2. tüüpi epiteelirakke (iAT2). AT2 rakud esindavad olulist rakupopulatsiooni distaalses kopsus ja on üks SARS-CoV{40}} nakkuse peamisi sihtmärke28,29. Nakatasime õhu-vedeliku liidese (ALI) kultuurina kasvatatud iAT2 rakke MOI-ga 2,5 ja jälgisime viiruse järglaste sekretsiooni rakkude apikaalsel küljel 48 hpi ja 96 hj juures. Kooskõlas rakuliinidelt saadud tulemustega produtseeris WT-viirus kõige rohkem nakkavaid viirusosakesi (joonis 1h). Omi-S-i ja Omicroni seas andis esimene 48 hj juures ligikaudu viis korda (P=0.0008) kõrgema nakkusliku viiruse tiitri. WT ja Omi-S viiruse tiitrid vähenesid infektsiooni tsütopaatilise toime (CPE) tõttu 96 dpi juures võrreldes 48 hj-ga. Siiski ei täheldatud Omicroni puhul CPE-d, mis viis nakkuslike virioonide püsiva tootmiseni. Üldiselt kinnitavad need tulemused järeldust, et mutatsioonid S-s ei võta täielikult arvesse Omicroni nõrgestatud replikatsioonivõimet rakukultuuris.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Cistanche Enhance Immunity toodete vaatamiseks klõpsake siin

【Küsi lisa】 E-post:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

S minimaalne roll Omicroni patogeensuses hiirtel

Et uurida, kas Omi-S on in vivo sobivusega võrreldes Omicroniga, uurisime Omi-S infektsiooni tulemust võrreldes WT SARS-CoV-2 ja Omicroniga K18-hACE2 hiirtel. Kooskõlas avaldatud kirjandusega4,5 ei põhjustanud hiirte (vanuses 12–20 nädalat) intranasaalne nakatamine Omicroniga (104 PFU hiire kohta) olulist kaalukaotust, samas kui WT viirusega nakatamine põhjustas kõigi hiirte kehakaalu kiire languse. kaotavad üle 20% oma esialgsest kehakaalust 8 päeva pärast nakatumist (dpi) (joonis 2a). Märkimisväärne on see, et 80% Omi-S-ga nakatunud hiirtest kaotasid samuti üle 20% oma kehakaalust 9 dpi võrra (joonis 2a ja laiendatud andmed, joonis 7a). Kliiniliste skooride hindamine (kaalukaotuse kumulatiivne mõõt, ebanormaalne hingamine, ebanormaalne välimus, vähenenud reageerimisvõime ja muutunud käitumine) näitas samuti sarnast mustrit; arvestades, et Omicroniga nakatunud hiirtel esines kliinilise haiguse tunnuseid vähe või üldse mitte, WT ja Omi-S-ga nakatunud hiirte tervis halvenes kiiresti ning WT viirus põhjustas raskema haiguse (P=0.0102) (joonis fig. 2b ja laiendatud andmed, joonis 7b). Kuna SARS-CoV-2 põhjustab K18-hACE2 hiirtel4 surmava infektsiooni, võrdlesime hiirte ellujäämist pärast viirusnakkust. Nõustudes kehakaalu languse ja kliinilise skoori tulemustega, põhjustasid WT ja Omi-S suremuse vastavalt 100% (6/6) ja 80% (8/10). Seevastu kõik Omicroniga nakatunud hiired jäid ellu (joonis 2c). Need leiud, mis on kooskõlas hiljutise väljaandega30, näitavad, et S-valk ei ole K18-hACE2 hiirtel Omicroni patogeensuse ainumääraja.

Järgmisena võrdlesime Omi-S levikut Omicroni ja WT SARS-CoV-2-ga K18-hACE2 hiirte kopsudes ja ninaturbinaatides. Hiirtele (12–20 nädala vanused) manustati intranasaalselt 104 PFU-d (seitse hiirt viiruse kohta) ja viiruse tiitreid hiirte kopsudes mõõdeti 2 ja 4 dpi juures. Kooskõlas in vitro leidudega oli nakkusliku viiruse tiiter WT-ga nakatunud hiirte kopsudes kõrgem kui kahe teise viirusega nakatunud hiirtel (joonis 2d). Siiski tekitasid Omi-S-ga nakatunud hiired 2 dpi juures 30- korda (P=0.0286) rohkem nakkavamaid viirusosakesi kui Omicroniga nakatunud hiirtel. Tiiter vähenes WT- ja Omi-S-ga nakatunud hiirte puhul 4 dpi juures, kuid Omicroniga nakatunud hiirte puhul näitas see suurenevat tendentsi, osutades kerge, kuid püsiva Omicroni infektsiooni võimalusele K18-hACE2 hiirtel. Kõik kolm hiirte kopsudest taastunud varianti säilitasid sama naastu suuruse fenotüübi kui algsel inokulaadil, mis näitab, et hiirte replikatsioonil ei olnud nende viiruste genotüüpidele tuvastatavat mõju (andmeid pole näidatud).

Viiruse patogeensuse hindamiseks K18-hACE2 hiirte kopsudes ja nasaalsetes turbinaatides teostasime nende kudede histopatoloogilise analüüsi 2 dpi juures. Nagu varem teatatud4,31, tuvastati WT viirusega nakatunud hiirte kopsualveoolides SARS-CoV-2 N valgu ulatuslik peaaegu hajutatud immunoreaktiivsus (joonis 2e). Seevastu Omi-S ja Omicroni infektsioon tekitasid alveolaarse värvumise lokaliseeritud koldeid, kus Omicronil oli Omi-S-iga võrreldes vähem fookusi. Kõige märgatavam fenotüüp ilmnes bronhiolaarses epiteelis, kus Omi-S põhjustas väljendunud, rutiinse perimeetrilise infektsiooni, kusjuures umbes 10–15% bronhioolidest olid viiruse N-valgu suhtes positiivsed 2 dpi juures, samas kui ainult 3–5% bronhioolidest olid N. -positiivne Omicroni jaoks (joonis 2f). WT viirus nakatas umbes 1% bronhioolidest ja sisaldas kõigil juhtudel ainult ühte eraldatud epiteelirakku bronhiooli kohta. Lisaks seostati bronhiolaarset infektsiooni epiteeli nekroosiga Omi-S-ga nakatunud hiirtel, mis määrati hematoksüliini ja eosiini (H&E) sektsioonide järjestikuse analüüsi abil, samas kui Omicroniga või WT-ga nakatunud hiirtel ei täheldatud histoloogilisi tõendeid hingamisteede vigastuste kohta (laiendatud andmed). 8a,b). WT- ja Omi-S-viirustega nakatatud hiirte ninaturbinaadid sisaldasid ohtralt SARS-CoV{27}}positiivseid rakke, mida seostati ilmsete tsütopaatiliste toimetega, samas kui Omicron tootis haruldasi, juhuslikult positiivseid rakke, ilma nähtavate epiteeli tunnusteta. vigastus (laiendatud andmed joonis 8c). Üldiselt viitavad need leiud sellele, et Omicroni replikatsioon hiirte hingamisteedes on Omi-S-ga võrreldes oluliselt nõrgenenud, toetades meie järeldust, et mutatsioonid S-s vastutavad Omicroni nõrgestatud patogeensuse eest vaid osaliselt.

S ja nsp6 mutatsioonid määravad Omikroni sumbumise

Lisaks S-valgule on Omicronil WT viirusega võrreldes aminohapete muutused mittestruktuursetes proteiinides 3 (nsp3), nsp4, nsp5, nsp6, nsp14, ümbrises (E), membraanis (M) ja N valkudes. (Laiendatud andmed joonis 9a). Omicroni nõrgenemisega seotud mitte-spike-valkude tuvastamiseks lõime suure paneeli fluorestseeruvalt märgistatud kimäärseid viiruseid, millest igaüks sisaldab Omicron S-i koos ühe Omicroni mittespike-valguga, ülejäänud valgud pärinevad WT viirusest (Extended Data). joonis 9b). Kui me kombineerisime Omicron S-i Omicron nsp6-ga (Omi-S/nsp6), täheldasime viiruse replikatsiooni tugevat vähenemist, kusjuures infektsiooni kineetika jäljendab Omicroni rakukultuuris (joonis 3a-d); teiste kimäärsete viiruste puhul sellist langust ei täheldatud. Omi-S / nsp6 halba replikatsioonitõhusust kinnitas ka meie järeldus, et nii Omi-S / nsp6 kui ka Omicron võttis CPER-i abil taastumiseks peaaegu viis kuni kuus päeva, samas kui kõik muud variandid taastati kahe päevaga (andmeid pole näidatud). Lõpuks, nagu Omicron, konkureeris Omi-S selgelt Omi-S/nsp6 otseses konkurentsianalüüsis (joonis 3e).

Joonis 2|S roll Omicroni patogeensuses. a–c, isased ja emased K18-hACE2 hiired (vanuses 12–20 nädalat) inokuleeriti intranasaalselt 1 × 104 PFU WT-ga (n=6 hiired), Omi-S (n=10 hiirt) või Omicron (n {{1{{40}}}} hiirt) viirus. Selles katses kasutati kahte sõltumatult loodud viirusevaru. Kehakaalu (a), kliinilist skoori (b) ja elulemust (c) jälgiti iga päev 14 päeva jooksul. Hiired, kes kaotasid 20% oma esialgsest kehakaalust, tapeti. d,e, K18-hACE2 hiirtele inokuleeriti ninasiseselt 1 × 104 PFU WT (n=14 hiirt), Omi-S (n=14 hiirt) ja Omicron (n {{ 20}} hiirt). Nakatunud hiirte kopsuproovid koguti 2 või 4 dpi juures, et määrata viiruse tiiter (n=4 hiirt) (d) või N-valgu immunohistokeemia (IHC) tuvastamiseks (n=3 hiirt). (e). Ees on esitatud tüüpilised IHC kujutised, millel on 2 dpi juures SARS-CoV-2 N (pruun värvus) alveoolides (nooled) ja bronhioolid (nooleotsad) hiirte kopsudes. Skaalavardad, 100 µm. f, N-positiivsete bronhioolide protsent nakatunud hiirte kopsudes (n=3 hiirt) 2 dpi juures. Iga punkt tähistab nakatunud hiirt. Statistiline olulisus määrati, kasutades kahepoolset paaritu t-testi Welchi korrektsiooni (a, b, d, f) ja logaritmilise astme (Mantel-Cox) testiga (c). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 ja ****P < 0,0001; NS, mitte oluline.

K18-hACE2 hiirte kopsudes, samas kui Omi-S põhjustas ulatusliku bronhiolaarse infektsiooni ja vigastuse, näitasid nii Omicron kui ka Omi-S/nsp6 nakatumise vähenemist ilma epiteelikahjustusteta (joonis 3f). Kooskõlas nende leidudega tekitasid Omi-S/nsp6-nakatunud hiirte kopsud viiruse tiitreid, mis olid samaväärsed rOmicroni ja Omicroni isolaadiga (joonis 3g). Lõpuks jäi ellu 71% Omi-S/nsp6-ga nakatunud hiirtest (joonis 3h) – vastupidiselt Omi-S-ga nakatunud hiirte ellujäämismääradele (joonis 2c) vaid 20%. Üldiselt näitavad need tulemused, et S ja nsp6 mutatsioonid on piisavad Omicroni nõrgestatud virulentsuse määratlemiseks. Need tähelepanekud toetavad ja laiendavad veelgi eelmise uuringu tulemusi, mis näitavad, et mutatsioonid 5'-UTR-nsp12 piirkonnas, kus nsp6 asub, aitavad kaasa Omicroni nõrgenemisele K18-hACE2 hiirtel30.

Joonis 3|S ja nsp6 mutatsioonid põhjustavad Omicroni patogeensust.a–d, näidatud mNeonGreen reporterviiruste replikatsioonikineetika ACE2/TMPRSS2/Caco-2 rakkudes (MOI=0.01), mis määratakse voolu järgi tsütomeetria (n=3 kordust) (a, c) ja naastude analüüs (n=3 kordust) (b, d). Katseid korrati kaks korda. e, ACE2/TMPRSS2/Caco-2 rakud nakatati viirusesegudega vahekorras 1:1, et saada lõplik MOI 0.005 iga viiruse jaoks . Rakud fikseeriti näidatud aegadel ja analüüsiti voolutsütomeetria abil. Kuvatakse nakatamata, üksikult nakatunud ja kahekordselt nakatunud rakkude protsent. Kompenseerimiseks kasutati üksikult nakatunud rakke. Üksikud andmepunktid joonistatakse koos keskmise ± sd (n=3 kordust). Katset korrati kaks korda. f–h, K18-hACE2 hiiri inokuleeriti intranasaalselt 1 × 104 PFU viirustega. Nakatunud hiirte kopsuproovid koguti 2 dpi juures N-valgu IHC tuvastamiseks (n=3 hiirt) (f) või viiruse tiitrite määramiseks (n=4 hiirt) (g). Joonisel f on N-positiivsete bronhioolide H&E värvimise tüüpilised kujutised näidatud sisenditena. Bronhiolaarepiteeli nekroos on näidatud nooltega. Omicroni või Omi-S/nsp6-ga nakatunud hiirte bronhioolides nekroosi tunnuseid ei täheldatud. Skaalariba, 100 µm. Parempoolne graafik f-s näitab N-positiivsete bronhioolide protsenti nakatunud hiirte kopsudes. Iga punkt tähistab nakatunud hiirt. h, nakatunud hiirte ellujäämist jälgiti iga päev 14 päeva jooksul. Hiired, kes kaotasid 20% oma esialgsest kehakaalust, tapeti. Statistiline olulisus määrati kahepoolse, paaritu t-testi abil Welchi korrektsiooni (a–g) ja logaritmilise astme (Mantel-Cox) testiga (h). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 ja ****P < 0,0001; NS, mitte oluline.

S-valgu RBM juhib Omicroni vaktsiini põgenemist

Suur hulk kirjandust on andnud tõendeid Omicroni ulatusliku põgenemise kohta vaktsiinist põhjustatud humoraalse immuunsuse eest14,19. Omicroni immuunpõgenemisfenotüübiga seotud S-piirkondade määratlemiseks võrdlesime esmalt vaktsineeritud isikute seerumite in vitro neutraliseerimisaktiivsust WT SARS-CoV-2 (USA-WA1/20) vastu. 20), Omi-S ja Omicron. Seerumid, mis koguti kahe kuu jooksul pärast mRNA-1273 (Moderna mRNA vaktsiin; n=12) või BNT162b2 (Pfizer-BioNTech mRNA vaktsiin; n=12) vaktsiini teist annust, lisati (laiendatud andmed) Tabel 1). Tegime mitmetsüklilise neutraliseerimistesti, kasutades seadet, milles viirus ja neutraliseerivad seerumid olid kogu aeg olemas, imiteerides seropositiivse indiviidi olukorda. Kõik seerumid on halvasti neutraliseeritud Omicroniga, 111-kordne (vahemik: 44-kordne kuni 812-kordne; P < 0,0001) madalam poolmaksimaalne neutraliseeriv lahjendus (ND50) Omicroni jaoks võrreldes WA1-ga (joonis 4a,b). Tegelikult ei neutraliseerinud ligikaudu 80% proovidest Omicroni kõrgeima testitud kontsentratsiooni juures täielikult (laiendatud andmed, joonis 10). Eelkõige näitas Omi-S identseid ND50 väärtusi Omicroniga (11 5- korda madalam kui WA1 omal; P < 0,0001) (joonis 4a, b), mis viitab sellele, et Omicron S valk WT-sse lülitatuna viirus, käitub samamoodi nagu Omicron.

Joonis 4|S-i roll Omicroni immuunresistentsuses. ND50 väärtused WA1, Omi-S ja Omicron jaoks nende isikute seerumis, kes said kaks Moderna (doonorid 1–12) või Pfizeri (doonorid 13–24) vaktsiini (täpsem teave seerumite kohta on esitatud jaotises Laiendatud Andmete tabel 1; üksikud kõverad on näidatud laiendatud andmetel joonisel 10). b, ND50 väärtuste trajektoorid WA1, Omi-S ja Omicroni suhtes (andmed punktist a on joonistatud). Näidatud on kordne muutus ND50 väärtustes (n=24 seerumiproovi). c–f, kimäärsete (vasakul; c,d) ja mutantsete (vasakul; e,f) viiruste skeem. WA1 mutantide aminohapete nummerdamine e-s põhineb WA1S järjestusel, samas kui Omicroni mutantide nummerdamine f-s põhineb Omicron S järjestusel. Testiti kuut 24 seerumist (3 Modernalt ja 3 Pfizerilt). Iga seerumiproov on tähistatud konkreetse värvi punktiga. Andmed on kujutatud vanemviiruse muudatusena. Statistiline olulisus määrati kahepoolse, paaritu t-testi abil Welchi korrektsiooniga. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 ja ****P < 0,0001; NS, mitte oluline.

SARS-CoV-2 S valk sisaldab kahte domeeni: S1 domeeni, mis interakteerub ACE2 retseptoriga, ja S2 domeeni, mis vastutab membraani sulandumise eest32. S1 domeenis asuvad N-terminaalne domeen (NTD) ja retseptorit siduv domeen (RBD), mis sisaldab retseptorit siduvat motiivi (RBM), mis loob otsese kontakti ACE2 retseptoriga33. Omicron S NTD-s on 11 aminohappemuutust, sealhulgas 6 deletsiooni ja üks 3-aminohappe pikkune insertsioon, samas kui RBD sisaldab 15 mutatsiooni, millest 10 on koondunud RBM-i (laiendatud). Andmed joonis 1). Nii NTD kui ka RBD peremeesorganismis on neutraliseerivad epitoobid34–37, kuid RBD on immunodominantne ja esindab SARS-CoV-2 immuunseerumites esineva neutraliseeriva aktiivsuse peamist sihtmärki37,38. Et teha kindlaks, kas Omicroni neutraliseerimisresistentsuse fenotüüp on põhjustatud mutatsioonidest S-valgu konkreetses domeenis, genereerisime kaks kimäärsete viiruste rühma. Esimesse rühma kuulusid Omicroni NTD, RBD või RBM-i kandvad WA1 viirused (joonis 4c) ja teise rühma Omi-S viirus, mis kandis WA1 NTD, RBD või RBM-i (joonis 4d). Neutralisatsioonitest näitas, et RBM-i mutatsioonid olid Omicroni resistentsuse peamiseks põhjuseks vaktsiinist põhjustatud humoraalse immuunsuse suhtes: WA1 RBM-i asendamine Omicroni omaga vähendas ND50 54- korda (P < 0,0001), ja vastupidi, Omi-S RBM-i asendamine WA1 omaga suurendas ND50 56- korda (P=0.0003) (joonis 4c, d). Asjaolu, et ükski RBM-i vahetusviirustest ei saavutanud ligikaudu 11--kordset erinevust, mida täheldati WA1 ja Omi-S vahel, viitab sellele, et S-i teistes osades esinevad mutatsioonid soodustavad ka vaktsiiniresistentsust.

Et uurida, kas spetsiifilised mutatsioonid Omicron RBM-i juhitavas vaktsiinis põgenevad, koostasime kaks täiendavat rekombinantsete viiruste paneeli, millest üks oli WA1S-ga, mis kannab Omicron RBM-i mutatsioone, kas üksikult või kombinatsioonis (joonis 4e), ja teises Omicron S-iga, millel see sama puudus. mutatsioonide komplekt (joonis 4f). Kaks WA1 mutanti – mutant 3 (asendusega E484A) ja mutant 4 (milles on viis asendust Q493R, G496S, Q498R, N501Y ja Y505H) – näitasid mõõdukat, kuid statistiliselt olulist langust 1.4-} korda ( P=0.0002) ja 1.8-kordne (P=0.0003) ND50 väärtustes, võrreldes WA1-ga (joonis 4e). Kui need mutatsioonid Omicron S-st eemaldati, täheldati vastupidist; Omicroni mutandil 3 (puudub asendus E484A) ja mutandil 4 (puudub Q493R, G496S, Q498R, N501Y ja Y505H) oli 19-kordne (P=0.0082) ja 3.{38 }} korda (P=0,0025) kõrgemad ND50 väärtused võrreldes Omicroniga (joonis 4f). Kuna ükski mutant ei tabanud Omicroni üldist fenotüüpi, eeldame, et vaktsiini põgenemine on S-valgu pikkuses jaotunud mutatsioonide kumulatiivne mõju. On võimalik, et mutatsioonid muudavad Omicron S konformatsiooni sellisel viisil, et enamik immunodominantseid neutraliseerivaid epitoope on häiritud ja muutuvad neutraliseerimiseks kättesaamatuks.

cistanche tubulosa - parandab immuunsüsteemi

Arutelu

See uuring annab peamise ülevaate viirusvalkudest, mis aitavad kaasa SARS-CoV-2 patogeensusele. Näitame, et S, Omicroni enim muteerunud valk, omab Omicroni sumbumises mittetäielikku rolli. Rakupõhistes infektsioonianalüüsides on Omi-S viirusel esivanemate viiruse ja Omicroni vahel keskmine replikatsioonitõhusus. Samamoodi erineb Omi-S K18-hACE2 hiirtel mittesurmava Omicroniga ja põhjustab 80% suremust; esivanemate viirus põhjustab nende hiirte 100% suremuse. Nimelt, kui kombineerisime S mutatsioonid nsp6 mutatsioonidega, ilmnes viirusel nõrgestatud fenotüüp, mis sarnanes suuresti Omicroni omaga, mis näitab, et need kaks valku on Omicroni patogeensuse peamised määrajad. Tulevased uuringud dešifreerivad mehhanismi(d), mille abil nsp6 mutatsioonid mõjutavad viiruse replikatsiooni.

Meie uuringu üheks võimalikuks piiranguks on K18-hACE2 hiirte kasutamine patogeneesiuuringutes primaatide mudelite asemel, millel on rohkem sarnasusi inimestega39. Siiski tuleb märkida, et K18-hACE2 hiired on väljakujunenud mudel SARS-CoV-24 surmava fenotüübi uurimiseks,31. Kuigi neil hiirtel areneb pärast SARS-CoV{10}} nakatumist kopsupatoloogia, on suremust seostatud kesknärvisüsteemi haaratusega viiruse neuroinvasiooni ja leviku tõttu31,40. Asjaolu, et K18-hACE2 hiirte nakatumine Omi-S-iga, kuid mitte Omicroniga, kutsub esile neuroloogilisi märke (nt küürus kehahoiak ja reageerimisvõime puudumine), viitab sellele, et neuroinvasiooni omadus on Omi-S-is säilinud, tõenäoliselt selle suurema replikatsioonitõhususe tõttu ja selle omaduse määrajad asuvad väljaspool S-valku. Need leiud on kooskõlas eelmise uuringuga, mis näitab, et Omi-S-ga nakatunud hamstrid eraldasid oluliselt rohkem viirust ja kaotasid rohkem kaalu kui Omicroniga nakatunud hamstrid, mis viitab sellele, et S-st väljaspool olevad mutatsioonid aitavad kaasa Omicroni patogeensusele41.

Leidsime, et kuigi esivanemate viirus replitseerub peamiselt kopsualveoolides ja põhjustab K18-hACE2 hiirtel ainult harvaesinevaid bronhioolide infektsioone, on nii Omi-S kui ka Omicron suurenenud kalduvus paljuneda bronhide epiteelis, mis näitab, et S valk vastutab muutunud tropismi eest. Selle lüliti mehhanism on teadmata, kuid on võimalik, et Omicron S on efektiivsem kui WT S katepsiin B või katepsiin L (viited 25, 42, 43) kasutamisel, mis moodustavad viiruse aktiivse sisenemisraja bronhioolidesse ja muudesse hingamisteedesse. rakud41. Seevastu SARS-CoV-2 sisenemist alveolaarsetesse epiteelirakkudesse põhjustab peamiselt TMPRSS2 (viide 28, 44), mida Omicron S ei kasuta25, 45, mis viib nende rakkude halva nakatumiseni4,5 ,25,43. Need leiud võivad seletada Omicroni põhjustatud nõrgestatud kopsupatoloogiat.

cistanche on kasulikud - tugevdab immuunsüsteemi

Omicron nsp6-l on kaks muudetud saiti võrreldes prototüübi SARS-i CoV-2 Wuhan-Hu-1 isolaadiga: kolme aminohappe deletsioon (LSG, positsioonid 105–107) ja I189V asendus (laiendatud andmete joonis. . 9). Kirjeldatud on mitmeid nsp6 funktsioone koroonaviiruse replikatsioonis; peamine neist on topeltmembraansete vesiikulite (DMV) biogenees, mis esindavad viiruse RNA sünteesi saiti 46–50. Eelmine uuring näitas, et SARS-CoV-2 DMV-d tekivad peamiselt kolme viirusvalgu: nsp3, nsp4 ja nsp6 kooskõlastatud toimel; kuigi nsp3 ja nsp4 on piisavad DMV-de moodustamiseks, ühendab nsp6 need DMV-d endoplasmaatilise retikulumiga ja kanaliseerib nende struktuuride vahelist olulist suhtlust46. Täiendavat uurimist vajab see, kas Omicron nsp6 mutatsioonide konstellatsioon mõjutab DMV moodustumist või funktsioone. Nsp6 aktiveerib ka NLR3-sõltuva tsütokiini tootmise ja püroptoosi COVID-19-ga patsientide kopsudes, olles peamine virulentsusfaktor47. Pange tähele, et asümptomaatilise COVID-19-ga seostatud nsp6 variandil oli vähenenud võime indutseerida püroptoosi47, mis ajendas oletama, et Omicron nsp6 mutatsioonid võivad samuti mõjutada püroptoosi. Omicroni mutatsioonide mõju nsp6 funktsioonidele eraldamiseks on vaja üksikasjalikke mehhaanilisi uuringuid.

Praegu pole teada, kas S ja nsp6 mutatsioonid töötavad üksteisega kooskõlas, et juhtida Omicroni sumbumist. Arvestades, et Omicron S näitas suuremat eelsoodumust bronhioolide suhtes, on võimalik, et S vastutab muutunud viiruse tropismi eest, samas kui mitte-spike mutatsioonid, sealhulgas nsp6--s, on pelgalt kohanemine muutunud koekeskkonnaga. Väärib mainimist, et kuigi nsp6 näib olevat Omicroni nõrgenemise taga peamine mitte-spike-valk, ei saa täielikult välistada ka teiste viirusvalkude panust. Kõik in vitro katsed, milles uuriti mitte-spike mutatsioonide rolli, viidi läbi ACE2/TMPRSS2/Caco-2 rakkudes. Teiste immuunkompetentsemate rakutüüpide kasutamine võib paljastada ka teiste mitte-spike mutatsioonide mõju. Lisaks sisaldasid meie kimäärsed viirused Omicron S-d, mis olid seotud korraga ainult ühe mitte-spike-valguga, mis piiras pikamaa epistaatilisi interaktsioone mitme viirusvalgu mutatsioonide vahel.

Tistanche kasulikud omadused meestele - tugevdavad immuunsüsteemi

Meie uuring näitab, et Omicron S RBM-i mutatsioonid on Omicroni neutraliseerivate antikehade eest põgenemise peamised tegurid, kuigi kaasa aitavad ka mutatsioonid S-i teistes piirkondades. RBM-is tuvastame kaks mutatsioonide leviala, mis annavad Omicron S-ile võime neutraliseerida: üks kannab E484A asendust ja teine ​​sisaldab viiest asendusest koosnevat klastrit - Q493R, G496S, Q498R, N501Y ja Y505H. On näidatud, et E484A asendus pääseb taastuvate seerumite neutraliseerimisest51. Veelgi enam, struktuurne modelleerimine viitab sellele, et mõned terapeutilised monoklonaalsed antikehad loovad väga stabiilsed soolasildad E484 jäägiga, kaotades täielikult oma seondumise, kui see jääk muudetakse A-ks või pärast Q493K ja Y505H muutusi52. Samamoodi näitas RBM-i jääkide kaardistamine, mis interakteeruvad otseselt 49 teadaoleva neutraliseeriva antikehaga. , kooskõlas meie neutraliseerimisanalüüsi tulemustega. Eelkõige on see, et kuigi Omicron S antikehade sidumisvõime on kahjustatud54, on selle retseptoriga seondumise võime puutumatu. Tegelikult on Omicron RBD-l suurem afiinsus ACE2 suhtes kui Wuhan-Hu{32}} ja Delta veekogude25 suhtes. See näitab, et Omicron S mutatsioonid on arenenud nii, et need takistavad antikehade sidumist, kuid säilitavad retseptorite seotuse. See avab võimaluse COVID-19 pandeemia tõrjeks laia toimespektriga vaktsiinide väljatöötamiseks sihtida S-i konserveeritud ja struktuuriliselt piiratud piirkondi, mis on seotud ACE2 tuvastamisega.

viited

1. Liu, L. et al. Silmatorkav antikehade vältimine, mis väljendub SARS-CoV -2 Omicroni variandis. Nature 602, 676–681 (2022).

2. Planas, D. et al. SARS-CoV-2 Omicroni märkimisväärne pääsemine antikehade neutraliseerimisele. Nature 602, 671–675 (2022).

3. Schmidt, F. et al. SARS-CoV-2 Omicroni variandi plasma neutraliseerimine. N. Ingl. J. Med. 386, 599–601 (2022).

4. Shuai, H. et al. SARS-CoV -2 B.1.1.529 Omicron nõrgestatud replikatsioon ja patogeensus. Nature 603, 693–699 (2022).

5. Halfmann, PJ et al. SARS-CoV-2 Omicron viirus põhjustab hiirtel ja hamstritel nõrgenenud haigusi. Nature 603, 687–692 (2022).

6. Lewnard, JA et al. SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) variandi ja BA.1/BA.1.1 või BA.2 alamvariandi infektsiooniga seotud kliinilised tulemused Lõuna-Californias. Nat. Med. 28, 1933–1943 (2022).

7. Wolter, N. et al. SARS-CoV-2 omikronilise variandi kliinilise raskusastme varajane hindamine Lõuna-Aafrikas: andmete seose uuring. Lancet 399, 437–446 (2022).

8. Ulloa, AC, Buchan, SA, Daneman, N. & Brown, KA SARS-CoV-2 Omicroni variandi tõsiduse hinnangud Ontarios, Kanadas. J. Am. Med. Assoc. 327, 1286–1288 (2022).

9. Uraki, R. et al. SARS-CoV-2 Omicron BA.4 ja BA.5 isolaatide iseloomustus närilistel. Nature 612, 540–545 (2022).

10. Uraki, R. et al. SARS-CoV-2 Omicron BA.2 iseloomustus ja viirusevastane tundlikkus. Nature 607, 119–127 (2022).

11. Dyer, O. Covid-19: Omicron põhjustab rohkem infektsioone, kuid vähem haiglaravi kui Delta, Lõuna-Aafrika andmed näitavad. Br. Med. J. 375, n3104 (2021).

12. Sigal, A. Omicroniga kergem haigus: kas see on viirus või juba olemasolev immuunsus? Nat. Rev. Immunol. 22, 69–71 (2022).

13. KES. SARS-CoV-2 variantide jälgimine https://www.who.int/en/activities/tracking-SARS CoV-2-variants/ (2022).

14. Cele, S. et al. Omicron pääseb ulatuslikult, kuid mittetäielikult Pfizeri BNT162b2 neutraliseerimisest. Nature 602, 654–656 (2022).

15. Gu, H. et al. SARS-CoV-2 omikronilise variandi tõenäoline ülekandumine karantiinihotellis Hongkongis, Hiinas, november 2021. Tekkis. Nakata. Dis. 28, 460–462 (2022).

16. Iuliano, AD et al. Haiguse raskusastme ja tervishoiuteenuste kasutamise suundumused varajase Omicroni variandi perioodil võrreldes varasemate SARS-CoV-2 kõrge leviku perioodidega – Ameerika Ühendriigid, detsember 2020 – jaanuar 2022. Morb. Surelik. Wkly Rep. 71, 146–152 (2022).

17. CDC. COVID Data Tracker https://covid.cdc.gov/covid-data-tracker/#variant-proportions (2022).

18. Taylor, L. Covid-19: Omicron saavutab iganädalaselt rekordilise ülemaailmse nakkuse. Br. Med. J. 376, 66 (2022).

19. Dejnirattisai, W. et al. SARS-CoV-2 Omicron-B.1.1.529 viib laialdaselt põgenemiseni neutraliseerivate antikehade vastuste eest. Cell 185, 467–484 (2022).

20. Suzuki, R. et al. SARS-CoV-2 Omicroni variandi nõrgestatud fusogeensus ja patogeensus. Loodus 603, 700–705 (2022).

21. Smyth, DS jt. NYC reovees tuvastatud salapäraste SARS-CoV-2 liinide jälgimine. Nat. Commun. 13, 635 (2022).

22. Kirby, AE et al. Märkused valdkonnast: varased tõendid SARS-CoV-2 B.1.1.529 (Omicron) variandi kohta kogukonna reovees – Ameerika Ühendriigid, november–detsember 2021. Morb. Surelik. Wkly Rep. 71, 103–105 (2022).

23. Herrmann, A. et al. Läbipääsuvaba SARS-CoV-2 genoomi kloonimine ja mutagenees punase rekombinatsiooni abil. Int. J. Mol. Sci. 22, 10188 (2021).

24. Liu, G. & Gack, MU Optimeeritud tsirkulaarse polümeraasi pikendusreaktsioonil põhinev meetod SARS-CoV funktsionaalseks analüüsiks-2. Eeltrükk aadressil https://doi.org/10.1101/2022.11.26.518005 (2022).

25. Meng, B. et al. SARS-CoV-2 muutnud TMPRSS2 kasutust Omicron mõjutab tropismi ja fusogeensust. Nature 603, 706–714 (2022).

26. Willett, BJ et al. SARS-CoV-2 Omicron on muudetud rakusisenemise rajaga immuunvariant. Nat. Microbiol. 7, 1161–1179 (2022).

27. Martines, RB et al. Surmaga lõppenud koroonaviirushaigusega seotud SARS-CoV-2 patoloogia ja patogenees, Ameerika Ühendriigid. Tekkima. Nakata. Dis. 26, 2005–2015 (2020).

28. Huang, J. et al. Pluripotentsetest tüvirakkudest pärinevate inimese kopsualveolaarsete 2. tüüpi rakkude infektsioon SARS-CoV-2 kutsub esile kiire epiteelisisese põletikulise vastuse. Cell Stem Cell 27, 962–973 (2020).

29. Mulay, A. et al. Inimese esmase kopsuepiteeli SARS-CoV-2 infektsioon COVID-19 modelleerimiseks ja ravimite avastamiseks. Cell Rep. 35, 109055 (2021).

30. Liu, S., Selvaraj, P., Sangare, K., Luan, B. & Wang, TT Spike protein-independent attenuation of SARS-CoV-2 Omicron variant in laboratory hiirtel. Cell Rep. 40, 111359 (2022).

31. Carossino, M. et al. Surmaga lõppenud neurodiseminatsioon ja SARS-CoV-2 tropism K18-hACE2 hiirtel sõltuvad ainult osaliselt hACE2 ekspressioonist. Viirused 14, 535 (2022).

32. Huang, Y., Yang, C., Xu, XF, Xu, W. ja Liu, SW SARS-i CoV{1}} spike-valgu struktuursed ja funktsionaalsed omadused: võimalikud viirusevastased ravimid COVID-i jaoks-19 . Acta Pharmacol. Patt. 41, 1141–1149 (2020).

33. Lan, J. et al. ACE2 retseptoriga seotud SARS-CoV-2 spike retseptorit siduva domeeni struktuur. Nature 581, 215–220 (2020).

34. Chi, X. et al. Neutraliseeriv inimese antikeha seondub SARS-CoV -2 Spike valgu N-terminaalse domeeniga. Science 369, 650–655 (2020).

35. Voss, WN et al. SARS-CoV-2 mitte-RBD piikide epitoopide levinud, kaitsev ja konvergentne IgG tuvastamine. Science 372, 1108–1112 (2021).

36. Premkumar, L. et al. Viiruse spike-valgu retseptoriga seonduv domeen on immunodominantne ja väga spetsiifiline antikehade sihtmärk SARS-CoV-2 patsientidel. Sci. Immunol. 5, eabc8413 (2020).

37. Ju, B. et al. SARS-CoV-2 infektsiooni poolt esile kutsutud inimese neutraliseerivad antikehad. Nature 584, 115–119 (2020).

38. Piccoli, L. et al. Neutraliseerivate ja immunodominantsete saitide kaardistamine SARS-CoV-2 spike retseptorit siduval domeenil struktuuripõhise kõrge eraldusvõimega seroloogia abil. Cell 183, 1024–1042 (2020).

39. Chang, MC, Hild, S. & Grieder, F. Ahvilised mudelid SARS-CoV-2 uurimiseks: kaaluge makaakide alternatiive. Laboranim. 50, 113–114 (2021).

40. Kumari, P. et al. Neuroinvasioon ja entsefaliit pärast SARS CoV{1}} intranasaalset inokuleerimist K18-hACE2 hiirtel. Viirused 13, 132 (2021).

41. Peacock, TP et al. SARS-CoV-2 Omicroni variandi muutunud sisenemistee ja antigeenne kaugus kaardistavad spike-valgu domeenide eraldamise. Eeltrükk aadressil https://doi.org/ 10.1101/2021.12.31.474653 (2022).

42. Padmanabhan, P. & Dixit, NM Modelleerib, kuidas SARS-CoV-2 Omicroni variandi muutunud rakkude sisenemisradade kasutamine võib mõjutada TMPRSS2 ja katepsiin B/L inhibiitorite tõhusust ja sünergiat. Eeltrükk aadressil https://doi.org/10.1101/2022.01.13.476267 (2022).

43. Hui, KPY et al. SARS-CoV-2 Omikroni variandi replikatsioon inimese bronhides ja kopsudes ex vivo. Nature 603, 715–720 (2022).

44. Grau-Exposito, J. et al. SARS-CoV-2 sisenemise, põletiku ja uute ravimite hindamine inimese kopsukoe rakkudes. PLoS patog. 18, e1010171 (2022).

45. Zhao, H. et al. SARS-CoV-2 Omicroni variant näitab vähem tõhusat replikatsiooni- ja liitmisaktiivsust võrreldes Delta variandiga TMPRSS2-ekspresseeritud rakkudes. Tekkima. Mikroobid nakatavad. 11, 277–283 (2022).

46. ​​Ricciardi, S. et al. NSP6 roll SARS-CoV-2 replikatsiooniorganelli biogeneesis. Nature 606, 761–768 (2022).

47. Sun, X. et al. SARS-CoV-2 mittestruktuurne valk 6 käivitab NLRP3-sõltuva püroptoosi, sihtides ATP6AP1. Rakkude surma erinevus. 29, 1240–1254 (2022).

48. Cottam, EM, Whelband, MC & Wileman, T. Coronavirus NSP6 piirab autofagosoomide laienemist. Autofagia 10, 1426–1441 (2014).

49. Benvenuto, D. et al. SARS-CoV-2 evolutsiooniline analüüs: kuidas mittestruktuurse valgu 6 (NSP6) mutatsioon võib mõjutada viiruse autofagiat. J. Infect. 81, e24–e27 (2020).

50. Gosert, R., Kanjanahaluethai, A., Egger, D., Bienz, K. & Baker, SC Hiire hepatiidiviiruse RNA replikatsioon toimub topeltmembraansetes vesiikulites. J. Virol 76, 3697–3708 (2002).

51. Liu, Z. et al. SARS-CoV-2 mutatsioonide tuvastamine, mis nõrgendavad monoklonaalsete ja seerumi antikehade neutraliseerimist. Cell Host Microbe, 29, 477–488 (2021).

52. Shah, M. & Woo, HG Omicron: tugevalt muteerunud SARS-CoV-2 variant seostub tugevamalt ACE2-ga ja pääseb tõhusalt COVID-19 heakskiidetud terapeutiliste antikehade eest. Esiosa. Immunol. 12, 830527 (2021).

53. Ye, G., Liu, B. & Li, F. SARS-CoV-2 omicron spike protein ectodomeeni krüo-EM struktuur. Nat. Commun. 13, 1214 (2022).

54. Carreno, JM et al. Taastusravi ja vaktsiiniseerumi aktiivsus SARS-CoV-2 Omicroni vastu. Nature 602, 682–688 (2022).