Üherakuline transkriptoomika paljastab häiritud neerufiltri rakkude ja rakkude koostoimed pärast varajast ja selektiivset podotsüütide vigastust
Jul 01, 2024
Kroonilised neeruhaigused (CKD)mõjutab maailmas veel 700 miljonit inimestspecific teraapiadon puudulikud.1 Paljudneeruhaigused tekivad inGlomerulus,Ühendusneerude itratsiooniüksus. Glomerulus koosneb (i) podotsüütidest, spetsialiseeritud postmitootilistest rakkudest, millel on keerukad jalaprotsessid, mis interdigiteerivad, moodustades pilu diafragmasid ja ümbritsedes glomerulaarkapillaare; (ii) endoteelirakud, mis asuvad jagatud glomerulaarsel alusmembraanil (GBM) podotsüütide vastas; (iii) mesangiaalrakud, mis moodustavad maatriksi, mis tagab glomerulusele struktuurse toe; ja (iv) parietaalsed epiteelirakud (PEC), mis ääristavad Bowmani kapslit.2 Eelkõige põhjustab podotsüütide kahjustus paljusid väga levinud progresseeruvaid neeruhaigusi, sealhulgas diabeetiline neeruhaigus (DKD), fokaalne segmentaalne glomeruloskleroos (FSGS) ja nefrootiline sündroom (nii idiopaatiline kui ka geneetiline). Vigastuse kanooniline muster põhjustab aktiini tsütoskeleti ümberkorraldamise tõttu interdigiteeruvate podotsüütide jalaprotsesside kadumise, mida tuntakse jala protsessi kadumisena. See tuhmumine põhjustab pilu diafragma, füüsilise barjääri, mis toimibÜhenduslter, millele järgneb podotsüütide eraldumine või surm.3,4 Teisest küljest, lisaks tervetele podotsüütidele, moodustub ja säilitatakseglomerulaarneÜhendusltratsioonitõkenõudaintraglomerulaarne side, mida kontrollivad tihedalt mitmed autokriinsed ja parakriinsed signaalimehhanismid. Näiteks vaskulaarne endoteeli kasvufaktor A (VEGFA) on ellujäämise signaal podotsüütide poolt sekreteeritavatele endoteelirakkudele ja trombotsüütidest tuletatud kasvufaktor B (PDGFB) on endoteelirakkude poolt sekreteeritavate mesangiaalsete rakkude ellujäämise signaal.5 Nende raku-rakkude interaktsioonide katkemist täheldatakse sageli paljude glomerulaarhaiguste, sealhulgas FSGS ja DKD korral.6 Seetõttu võib glomeruli kõige varasemate häirivate muutuste tuvastamine pakkuda uudseid sihtmärke ja võimalust optimeerida ravi edukust.neeruhaiguste ravi.
UUED ÜRTID JAOKSNEERUHAIGUSTE RAVI
Toetab NIH Riiklik Diabeedi ja Seede- ja Neeruhaiguste Instituut, annab toetusi DK103658, DK099465 ja DK095045 (AG). Intraglomerulaarne side, mida kontrollivad tihedalt mitmed autokriinsed ja parakriinsed signaalimismehhanismid. Näiteks on veresoonte endoteeli kasvufaktor A (VEGFA) ellujäämise signaal podotsüütide poolt sekreteeritavatele endoteelirakkudele ja trombotsüütidest tuletatud kasvufaktor B (PDGFB) on ellujäämise signaal endoteelirakkude poolt sekreteeritavatele mesangiaalrakkudele.5 Nende rakkude häirimine rakkude interaktsioone täheldatakse sageli paljude glomerulaarhaiguste, sealhulgas FSGS ja DKD korral.6 Seetõttu võib glomeruli kõige varasemate häirivate muutuste tuvastamine pakkuda uudseid sihtmärke ja võimalust optimeerida neeruhaiguste ravi edukust.
Üherakuline RNA sekveneerimine (scRNAseq) on muutnud keeruliste kudede ja rakuseisundite üksikute rakutüüpide uurimise pärast spetsiifilisi häireid.7,8 Hiljutised scRNAseq-i uuringud neerudega on andnud ülevaate neerurakkude tüüpide transkriptsiooniprofiilidest tervetel hiirtel ja inimese proovid, samuti mõned haigusseisundid, sealhulgas DKD ja luupusnefriit.9e12 Siiski on glomerulaarrakkude seisundite üksikasjalikke uuringuid piiranud analüüsiks saadaolevate rakkude väike arv. Lisaks ei ole jälgitud kõige varasemaid rakutüübispetsiifilisi muutusi, mis esinevad kõigis podotsüütide kahjustuse korral glomerulaarrakkudes ja need on veel määratlemata.
Podotsüüdi ablatsioon olulise endogeense valgu, CTCF podotsüütide-spetsiifilise indutseeritava deletsiooni kaudu, põhjustab progresseeruvat proteinuurilist neeruhaigust ja kroonilist neeruhaigust.13 Ajalooliselt loodi kroonilise neeruhaiguse hiiremudelid neerukahjustuse esilekutsumisel eksogeensete toksiinide või kirurgiliste sekkumiste kaudu, mis ei ole optimaalsed süsteemid järjestikuste mehaaniliste muutuste kokkuvõte. Olulise endogeense molekuli CTCF-i kustutamine põhjustab podotsüütide kiiret kadu, rasket progresseeruvat albuminuuriat, luu mineraalide metabolismi muutusi, neerupuudulikkust ja enneaegset surma.13 Indutseeritava podotsüütide-spetsiifilise CTCF-i deletsiooni (iCTCFpod / ) mudel annab ainulaadse võimaluse uurida. muutused intraglomerulaarsetes rakkude ja rakkude interaktsioonides indutseeritud podotsüütide kahjustuse tagajärjel. Podotsüüdi CTCF ekspressioon ei ole tuvastatav varaseimal ajahetkel, 1 nädala pärast doksütsükliini vahendatud Cre induktsiooni iCTCFpod / hiirtel.13 Märkimisväärne ja progresseeruv podotsüütide kadu, mõõdetuna histoloogilise analüüsiga, algab 2 nädalat pärast Cre induktsiooni. Käesolevas uuringus viidi 1-nädalal läbi üksikasjalik analüüs, et teha kindlaks podotsüütide vigastusest tingitud intraglomerulaarsete rakkude ja rakkude interaktsioonide varaseimad muutused, mis lõpuks viivad kroonilise neeruhaiguseni.
Materjalid ja meetodid
Loomade eest hoolitsemine
Selle uuringu kiitis heaks Harvardi meditsiinikooli Brighami ja naistehaigla loomade hooldamise ja kasutamise komitee. Kõik loomkatsed viidi läbi vastavalt juhistele, mille on kehtestanud ja heaks kiitnud Harvardi meditsiinikooli Brighami ja naiste haigla loomade hooldamise ja kasutamise komitee. iCrepod-Ctcfwt/fl hiired genereeriti vastavalt eelnevalt kirjeldatule13 ja inbriiditi, et luua iCrepod-Ctcffl/fl (iCTCFfl/fL) ja iCrepod-Ctcfwt/wt [metsiktüüpi (WT)] hiiri. Selles uuringus kasutati nii isaseid kui emaseid hiiri. Doksütsükliini (4 g/l) (Sigma D9891) manustati pidevalt joogivees, mis sisaldas sahharoosi (50 g/l) (VWR BDH0308) nii iCTCFfl/fL-le (tekitab iCTCFpod / hiired) kui ka WT pesakonnakaaslaste kontrollhiirtele (6 kuni 8). nädala vanuselt doksütsükliini kasutamise alguses), et juhtida Cre ekspressiooni spetsiifiliselt podotsüütides.
Glomerulaarne rikastamine kogu neerust
iCTCFpod / ja WT hiired surmati pärast 1-nädalast doksütsükliinravi ning neerud lõigati kiiresti lahti ja pesti jääkülma Hanksi tasakaalustatud soolalahusega (katalooginumber 14170112, Thermo Scientific, Waltham, MA). Pärast neerukapslite eemaldamist rikastati glomeruleid 4 °C juures, kasutades sõelumistehnikat14 180-mm, 75-mm ja 53-mm sõeladega. 53-mm sõelalt kogutud glomerulaarrikastatud fraktsioonid loputati jääkülma 1 Hanksi tasakaalustatud soolalahusega ja asetati jääle.
Üherakuliste suspensioonide valmistamine
Raamatukogu ettevalmistamine ja üherakuline sekveneerimine
Üksikuid rakke töödeldi läbi 10 Chromium 30 Single Cell platvormi, kasutades Chromium Single Cell 30 raamatukogu, geeli helmeste ja kiibi komplekte (10 Genomics, Pleas anton, CA), järgides tootja protokolli. Lühidalt, igasse kiibi kanalisse lisati 10 000 rakku, mis jagati kroomiinstrumendis emulsiooniga geelhelmesteks, millele järgnes rakkude lüüs ja RNA vöötkoodiga pöördtranskriptsioon tilkades. Emulsiooni purustamisele järgnes amplifitseerimine, fragmenteerimine ning adapteri ja prooviindeksi lisamine. Raamatukogud ühendati ja sekveneeriti Illumina HiSeq abil.
Hübridisatsiooni ahelreaktsioon
Kõik hübridisatsiooni ahelreaktsiooni (HCR) v3 reagendid (sondid, juuksenõelad ja puhvrid) osteti firmalt Molecular Technologies (Pasadena, CA). Õhukesed koelõigud (10 m) paigaldati 24-kaevu klaasist põhjaplaatidele (katalooginumber 82050-898, VWR, Radnor, PA), mis olid kaetud 1:5{{38} } (3-aminopropüül)trietoksüsilaani (katalooginumber 440140, Sigma-Aldrich) lahjendus. Kudele lisati järgmised lahused: 10% formaliini (katalooginumber 100503- 120, VWR) 15 minutit, kaks pesu 1 PBS-iga (katalooginumber AM9625, Thermo Fisher Scientific), jääkülm 70% EtOH 20 °C juures. C 2 tundi (kuni üle öö), kolm pesu 5 ui soolalahusega naatriumtsitraadiga 0,2% Tween-20 (SSCT) (katalooginumber 15557044, Thermo Fisher Scientific), hübridisatsioonipuhvriga (Molecular Technologies) 10 minutit, proovid hübridisatsioonipuhvriga üleöö, neli pesu pesupuhvriga (Molecular Technologies) 15 minutit, kolm pesu 5 SSCT-ga, amplifikatsioonipuhvri (Molecular Technologies) 10 minutit ja kolm 15-minutilist pesu 5 SSCT-ga (1:10,{{31) }} DAPI, katalooginumber TCA2412-5MG, VWR) teises pesus. Juuksenõelad kuumdenatureeriti amplifikatsioonipuhvris üleöö. Proovid salvestati ja pildistati 5 SSCT-s. Pildistamine viidi läbi pöörleva ketta konfokaalsel (Yokogawa W1 Nikon Eclipse Ti-l), mis töötas NIS-elementide AR-tarkvaraga. Kujutise analüüs ja töötlemine viidi läbi ImageJ Fiji tarkvara versiooniga 2.1.0/1.53c (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij).
Andmetöötlus ja kvaliteedikontroll
A Cellranger toolkit (version 2.1.1) was used to perform demultiplexing using the cellranger mkfastq command and the cellranger count command for alignment to the mouse transcriptome, cell barcode partitioning, collapsing unique molecular identifier (UMI) to transcripts, and gene-level quantification. Cells were filtered to include cells expressing a minimum of 500 genes and a maximum of 4000 genes. Furthermore, the percentage of reads mapping to mitochondrial genes was capped at 12%. DoubletFinder was used to identify potential doublets.15 Clusters with >Edasisest analüüsist eemaldati 75% kõrge usaldusväärsusega dublettidena klassifitseeritud rakkudest. Ülejäänud rakud, mis klassifitseeriti kõrge usaldusväärsusega dublettidena, eemaldati samuti edasisest analüüsist. Analüüs hõlmas selle erinevuse arvessevõtmiseks lahtrite arvu vähendamist. Näiteks kui antud rakutüübis oli vähem WT-rakke, kasutati diferentsiaalekspressioonianalüüsiks juhuslikku iCTCF-rakkude valimit, mis võrdub WT-rakkude arvuga.
Järelevalveta rühmitamine ja mõõtmete vähendamine
Seurat R paketi 16 versiooni 3.0 vaikeseadeid kasutati geeniekspressioonide arvu normaliseerimiseks (NormalizeData), muutuvate geenide tuvastamiseks (FindVariableGenes), integratsiooniankrute leidmiseks (FindIntegrationAnchors) ja proovide integreerimiseks (IntegrateData). . Soovimatu variatsioon tekkis UMI-de arvu ja mitokondriaalsete geenide lugemise kaardistamise (ScaleData) suhte tõttu. Mõõtmete vähendamine viidi läbi, kasutades väga varieeruvate geenide põhikomponentide analüüse (RunPCA). Funktsiooni PCElbowPlot() kasutati põhikomponentide eristamiseks edasiseks analüüsiks. Kõigi lahtrite rühmitamiseks hõlmasid esimesed 4 0 põhikomponenti piisavalt kogu dispersiooni. Molekulaarselt erinevad klastrid tuvastati vaikeparameetrite (FindClusters) ja eraldusvõime 0.4 (FindNeighbors) abil. Andmeid töödeldi ja skaleeriti ülalkirjeldatud viisil pärast glomerulaarrakkude alamhulka. Kokku kasutati allavoolu rühmitamiseks 30 peamist komponenti eraldusvõimega 0,3 (FindNeighbors).
Rakkude tüübi klassifikatsioon
Klastriga rikastatud või markergeenid arvutati, kasutades Wilcoxoni järgu summa testi (FindAllMarkers), et määrata geenide erinevat ekspressiooni klastrirakkudes võrreldes kõigi teiste rakkudega ja valida need geenid, mis läbivad korrigeeritud P väärtuse (vale avastamise määr) piiri {{1 }}.05 klastri esindajana. Klastri identiteedi määramiseks võrreldi andmepõhiseid geene küpsete neerurakkude tüüpide kirjanduses kureeritud geenide loendiga.
Diferentsiaalne geeniekspressiooni analüüs
Paaripõhist diferentsiaalset ekspressioonianalüüsi Seurat's (FindMarkers) kasutati, kui logivoldi muutuse lävi oli seatud väärtusele {{0}},01 ja vaikeparameetrid, et analüüsida iCTCFpod / ja WT-rakkude vahelist erinevat ekspressiooni konkreetses klastris. FindMarkersis määrati ident.1 klastrispetsiifilisteks iCTCFpod / rakkudeks ja ident.2 vastavateks klastrispetsiifilisteks WT-rakkudeks. Oluliseks peeti geene, mille korrigeeritud P <0,05.
Üleesindatuse analüüs
Üleesindatuse analüüsi kasutati selleks, et teha kindlaks, kas mis tahes teadaolevad bioloogilised funktsioonid või protsessid olid erinevalt ekspresseeritud geenide loendis üleesindatud või rikastatud.17 Üleesindatuse analüüsiks kasutati R-paketi clusterProfiler18, täpsemalt funktsiooni enrichGO. Kasutati vaikeparameetreid, välja arvatud ont Z BP, pvaluecutoff Z 0.25 ja qvaluecutoff Z 0.25. Seejärel kasutati R-paketi enrichplot (GitHub, https://github.com/YuLab-SMU/enrichplot, viimati juurdepääs 30. augustil 2021), täpsemalt emapplot funktsiooni, et visualiseerida rikastamistulemusi, joonistades graafikule peamised rikastamistingimused.
Ligandi retseptori analüüs
iTALK19 kasutati retseptorite kaardistamiseks liganditega, mida ekspresseeriti erinevalt iCTCFpodis / podotsüütides. Täpsemalt, rawParse'i kasutati iga geeni keskmise ekspressiooni arvutamiseks, kasutades Seurati skaleeritud andmeid. Ligandi- ja retseptoripaaride tuvastamiseks kasutati FindLR-i, kasutades andmetüüpi Z keskmist arvu. Huvipakkuvad ligandi- ja retseptoripaarid joonistati graafikule, kasutades LRPloti vaikeparameetreid. Joonte paksus näitab ligandi suhtelist keskmist ekspressiooni ja noolepea suurus näitab retseptori suhtelist keskmist ekspressiooni.
NicheNeti analüüs
R-paketti NicheNet20 kasutati ligandretseptorite interaktsioonide ennustamiseks, mis võivad põhjustada geeniekspressiooni muutusi huvipakkuvas rakutüübis. Selle analüüsi jaoks ühendati kõik podotsüütide klastrid ja kõik endoteeli klastrid. Kasutati kõiki vaikeparameetreid, välja arvatud _ligandi_sihtmärgi{5}}visualiseerimiseks madalama piirläve 0.11 määramine. HCR kujutise töötlemine ja kvantifitseerimine Pilte töödeldi ImageJ2 tarkvara abil (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij). ImageJ-failide jaoks kasutati versiooni 2.1.0/1.53c (http://imagej.net/ Contributors (viimati kasutatud 2. augustil 2020). Toores ND2-failid lahutati taustast, kasutades Rolling Ball meetodit (rullitav Z 50 libisev virn) Seejärel projitseeriti Z-stacki kujutiste keskmised intensiivsused ning fluorestsentsi intensiivsuse alusel kasutati rakkude segmenteerimiseks CellProfileri versiooni 3.1.5 (Broad Institute of MIT ja Harvard, MA). DAPI kanali mõõtmiseks ja ülejäänud kanalite integreeritud fluorestsentsi intensiivsuse mõõtmiseks statistilise analüüsi jaoks hinnati kõiki kolme 40 kujutise glomeruli.
Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Lisateabe saamiseks ostke:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-pood
25% EHHINAKOSIIDI JA 9% AKTEOSIIDI NEERUTUNGIMISEKS LOODUSLIKU ORGAANILISE TASTANHEKSTRAKTI SAAMISEKS KLIKI SIIA
