Abstraktne
Taust AKI on SARS-CoV-ga nakatumise sagedane tagajärg-2 ning aitab kaasa COVID-i tõsidusele ja suremusele-19. Siin testisime hüpoteesi, etneerude muutusedCOVID-19-ga seotud AKI poolt indutseeritud võib tuvastada uriinist kogutud rakkudes. Meetodid Teostasime üherakulise RNA sekveneerimise (scRNAseq) kaheksa COVID-19-ga (n55) või ilma AKI-ga (n53) haiglaravil oleva patsiendi ja nelja mitte-COVID-19 AKI-ga patsiendi uriinist taastunud rakkudega. (n54), et hinnata raku koostise ja geeniekspressiooni erinevusi AKI ajal. Tulemused 30 076 raku analüüs näitas mitmesuguseid rakutüüpe, millest enamik olidneerud, uroteeli- ja immuunrakud. AKI-ga patsientide torukujuliste rakkude rajaanalüüs näitas kahjustustega seotud radadega seotud transkriptide rikastumist võrreldes AKI-ga patsientidega. ACE2 ja TMPRSS2 ekspressioon oli taastunud rakutüüpide hulgas kõrgeim uroteelirakkudes. Nimelt tuvastasime ühel patsiendil uroteelirakkudes SARS-CoV-2 viiruse RNA. Neid samu rakke rikastati viirusevastaste ja põletikuvastaste radadega seotud transkriptide jaoks. Järeldused Viisime edukalt läbi scRNAseqi COVID-ga haiglaravil olevate patsientide uriinisetete kohta, et mitteinvasiivselt uurida AKI-ga seotud rakulisi muutusi, ja koostasime andmestiku, mis hõlmab nii vigastatud kui ka vigastamata neerurakke. Lisaks esitame esialgsed tõendid kusepõie rakkude otsese nakatumise kohta SARS-CoV-ga-2. Uriini sete sisaldab rohkelt teavet ja on kasulik ressurss patofüsioloogia ja rakuliste muutuste uurimiseks, mis tekivadneeruhaigused.
ORGAANILISED TERVISTOIDUD NEERETE TERVISEKS
Sissejuhatus
Raske ägeda respiratoorse sündroomi koroonaviirus 2 (SARS-CoV-2) infektsioon käivitab patoloogia mitmes süsteemis, sealhulgas neerudes, ning AKI-d seostatakse 2019. aasta koroonaviirushaiguse (COVID-19) märkimisväärse haigestumuse ja suremusega (1) –5). Mitmed uuringud on näidanud AKI kõrget esinemissagedust COVID-i-19 (6) haiglaravil olevate patsientide seas, kusjuures mõnede andmete kohaselt areneb AKI välja kuni 50% nakatunud isikutest (7–9). Primaarne SARS-CoV-2 retseptor ACE2 ekspresseerub epiteelirakkudel kogu kuseteede süsteemis, sealhulgas proksimaalsetes tuubulirakkudes ja uroteelirakkudes (10–13), kuigi on ebaselge, kas COVID-ga patsientidel esineb AKI-19 on tingitud proksimaalsete tuubulite otsesest viirusinfektsioonist või süsteemsest vastusest SARS-CoV-le-2 (14–22). Samuti on ebaselge, kas SARS-CoV-2 võib põhjustada viiruslikku põiepõletikku uroteelirakkude otsese nakatumise kaudu, kuigi seda võimalust on pakutud (23–26). Vaatamata COVID-19-ga seotud AKI suurele levimusele on AKI taustal esinevad rakulised muutused endiselt halvasti mõistetavad.
COVID-19-ga seotud AKI on jäänud suures osas alauurimata, kuna juurdepääs neerukoele nõuab biopsiat või surmajärgset analüüsi (27). Hiljutised uuringud on tuvastanud uriinis mitmesuguseid neeru-, põie- ja immuunrakke (28–30). Seega võib uriin pakkuda väärtuslikku ülevaadet neerumuutuste mitteinvasiivsest uuringust COVID-19-ga seotud AKI ajal. Siin teostasime üherakulise RNA sekveneerimise (RNA-Seq), et iseloomustada rakkude mitmekesisust haiglaravil viibivate patsientide uriinis, kellel on COVID-19 AKI-ga ja ilma. Testisime hüpoteesi, et COVID-19-ga seotud AKI neerumuutusi saab tuvastada uriinist kogutud rakkudes. Samuti kogusime proove patsientidelt, kellel ei olnud COVID-i{9}} ja AKI-d (mitte-COVID-19 AKI). Leidsime COVID-19-ga seotud AKI-s mitu põletikulist immuunrakkude populatsiooni ja erinevalt aktiveeritud radu, samuti esialgseid tõendeiduroteelirakkude otseseks nakatumiseks SARS-CoV-ga-2.
Materjalid ja meetodid
Osalejad ja muutujad 18-aastaseid ja vanemaid täiskasvanuid kontrolliti 2021. aasta märtsist maini Alabama ülikooli Birminghami (UAB) haiglasse vastuvõtu või üleviimise ajal. AKI juhtumid tuvastatiNeeruhaigusGlobaalsete tulemuste definitsiooni parandamine kui seerumi kreatiniini (sCr) tõus.{0}}.3 mg/dl 48 tunni jooksul või 0,1,53 kreatiniini algväärtus. Kontrollid, mille kreatiniinisisaldus ei muutunud, valiti võimaluse korral vanuse ja soo sobitamise alusel ning töödeldi iga vastava AKI prooviga. sCr algtaseme määramiseks kasutati viimast sCr väärtust 7–365 päeva enne haiglaravi. Täiendavad kliinilised andmed demograafiliste andmete, haigusloo, kliiniliste tunnuste ja laboratoorsete väärtuste kohta eraldati patsiendikaartidest UAB Kliiniliste ja translatsiooniteaduste keskuse i2b2 meeskonna kaudu. Kaasatud oli kaheksa COVID-iga haiglaravil olevat patsienti-19, viis AKI-ga ja kolm ilma AKI-ta. Selle uuringu ja proovikogu kiitis heaks UAB institutsiooniline ülevaatusnõukogu. UAB Acute Nephrology Consult Team kogus ka proove mitte-COVID-19 AKI-ga (n54) patsientidelt, et võrrelda rakulisi muutusi COVID-19-ga seotud AKI-ga. Need koguti erineva institutsionaalse läbivaatamisnõukogu protokolli alusel, mis võimaldab koguda uriinijäänuste proove ja on seega anonüümne.
Proovide kogumine ja töötlemine
Kõik sammud viidi läbi jääl. Uriin koguti kas tühjendatud proovina või uriinikateetrist. Proovid viidi koheselt töötlemiseks bioohutuse taseme 21 laborisse. Uriiniproovid viidi 50-ml koonilisse katsutisse ja tsentrifuugiti 10003g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C. Rakupelleteid pesti jääkülma PBS-ga, filtriti läbi 40-mm filtri ja tsentrifuugiti uuesti. Elusrakud puhastati, kasutades MACS prahi eemaldamise komplekti (Miltenyi Biotec), millele järgnes EasySep Annexin V surnud rakkude eemaldamise komplekt (StemCell). Lühidalt, rakud resuspendeeriti jääkülmas PBS-is ja segati prahi eemaldamise lahusega. Segule kaeti külm PBS ja tsentrifuugiti 3003 g juures 10 minutit temperatuuril 4 °C. Kaks ülemist faasi aspireeriti ja ülejäänud rakke pesti PBS-ga. Rakud resuspendeeriti ja segati enne EasySepi magnetis eraldamist Dead Cell Removal Cocktail'i, Biotin Selection Cocktail'iga ja seejärel RapidSpheres'iga. Rakud pesti ja resuspendeeriti 52 ml PBS-s (ilma kaltsiumi ega magneesiumita) 10,04% BSA-s (Fisher Scientific) scRNAseq-i töötlemiseks
scRNAseq
Puhastatud rakud viidi üle UAB Flow Cytometry ja Single Cell Core'i ning töödeldi kohe, kasutades Chromium 39 Single-Cell RNA Sequencing Kit (103).Genoomika) vastavalt tootjale's juhiseid.Rakususpensioon loendati ja kombineeriti 10-ga3 Kroomreaktiivi segu ja laaditakse mikrokambrissefluidicüherakuline jaotusseade, milles toimub lüüs ja tagasikäiktranskriptsioon toimub mikrotilkades. Saadud cDNAoli amplifiPCR abil ja seejärel töödeldi saagiseks
vöötkoodiga sekveneerimisteegid. Paaritud otsa sekveneerimine viidi läbi Illumina NovaSeq6000 või NextSeq500 sekveneerimisplatvormil (Illumina). Lugemisi töödeldikasutades 103 Genomics Cell Ranger üherakuline tarkvaraUAB Cheaha High-Performance'i komplekti versioon 6.0Arvutusklaster. BCLfiles muudeti FASTQ-ksfivähem kasutades CellRangeri kiirfunktsiooni. CellRangerFASTQ joondamiseks kasutati kiiretfikohandatud genoomimis koosneb hg38 inimese genoomist (GRCh38.p13) koos
eksonina sisestatud SARS-CoV-2 genoom (NC_045512.2) (31). Analüüsi jaoks loodi geenide tabel, vöötkooditabel ja transkriptsiooni ekspressioonimaatriksidallpool näidatud.
Andmete analüüsid
Analüüsid viidi läbi R statistilise analüüsi keskkonnale (versioon 4.06) loodud pakettide abil. Andmeid analüüsiti peamiselt Seurat' versioonis 3.2.3 (32,33) ja sellesseotud sõltuvused. Andmed iga patsiendi kohtaimporditi Read10 abil3 funktsioon ja seejärel struktuurmuudeti Seurati objektiks, kasutades CreateSeuratObjecti. Sestkvaliteedikontroll, ainulaadse funktsiooniga rakke on üle 2500või alla 200 ja rakud mitokondriaalse proportsiooniga.15% olidfivälja filtreeritud. Andmed normaliseeriti Logi abilNormaliseerige ja skaleerige, et valmistuda lineaarseks mõõtmiseksvähendamine. Üksikute patsientide objektid märgistatiunikaalse rühma identiteedigafikatioonid ja seejärel liideti aÜks objekt, kasutades Seurat' liitmisfunktsiooni. Patsient samPles integreeriti funktsiooniga RunHarmony, kasutadesHarmony R pakett (34). Põhikomponentide analüüsviidi läbi ja seejärel rühmitati rakud selle põhjaldiferentsiaalne geeniekspressioon, mille on määranud SeuratFunktsiooni FindAllMarkers eraldusvõime on üks. Dimensionaalne redutseerimine viidi läbi, kasutades ühtlast kollektoritlähendamine ja projektsioon. Rakutüübid tuvastatifitoimvõrreldes erinevalt väljendatud transkripteiga klaster koos teadaolevate transkriptidega, mis on seotud spetsiifigafic rakutüübid (29,35,36). Töötamiseks kasutati Escape R pakettiGeenikomplekti rikastamise analüüs (GSEA) (37). WebGestaltRkasutati geeni ontoloogia analüüsiks radade tuvastamisekskasutades bioloogilist protsessi ja Kyoto entsüklopeediatGeenide ja genoomide andmebaasid (38).
