Sidt2 on autofagia-lüsosomaalse lagunemise raja võtmevalk ning oluline neeru struktuuri ja filtreerimisfunktsiooni säilitamiseks Ⅱ
Nov 07, 2023
ARUTELU
Suur hulk uuringuid on näidanud, et LMP-d on seotud neerufunktsiooni või struktuurse homöostaasiga [21–25]. Meie eelmine uuring näitas, et LMP Sidt2 mõjutab põletikulist signaalirada ja kahjustab hiire glomerulaarseid mesangiaalrakke [28]. Selles uuringus uurisime esimest korda LMP Sidt2 poolt põhjustatud mõju hiire neerude struktuurile ja funktsioonile. Leiti, et Sidt2 deletsioon viis hiire neeru jala protsesside liitumiseni, basaalmembraani paksenemiseni, neerutuubulite epiteelirakkude ödeemi, mikrovilli kahjustuseni ja proteinuuria suurenemiseni 24 tunni pärast, mis näitab, et Sidt2 kadumine põhjustab filtreerimisfunktsiooni halvenemist. ja hiire neeru struktuur, kuid selle üksikasjalik mehhanism pole selge.
Kuna LMP-d on lüsosoomi olulised funktsionaalsed üksused [17] jalüsosomaalne düsfunktsioonon paljude krooniliste neeruhaiguste (CDK) üks levinumaid patogeenseid tegureid (viide [4, 29]), oleme pärast Sidt2 deletsiooni läbi viinud seotud uuringuid lüsosoomide kohta ja leidnud, et happeliste lüsosoomide arv vähenes ja neerude pH vähenes. lüsosoomid suurenesid in vitro. Siiski ei ilmnenud elektronmikroskoopia analüüsiga autofagosoomidega seotud primaarsete lüsosoomide arvu ja lüsosoomide koguarvus ilmseid muutusi. Katepsiinid esindavad suurimat proteolüütiliste ensüümide rühma lüsosoomides [30], mille hulgas on CTSB üks levinumaid lüsosomaalseid proteaase [31].
Kuna katepsiine tuleb küpsemiseks (aktiveerimiseks) hapestada, viib pH muutus lõpuks valgu lagunemise olulise vähenemiseni [32]. In vivo ja in vitro tasemed näitasid lüsosomaalse happe hüdrolaasi aktiivsuse ja sisalduse vähenemist, kinnitades veelgi, et Sidt2 inhibeerib lüsosomaalset funktsiooni, mõjutades lüsosoomide proteaaside küpsemist.
KLIKI SIIA, ET HANKIDA TAIMSETE TSISTANŠE VALMISTID
Vahepeal toimib lüsosoom ringlussevõtukeskusena raku metaboliitide ja jääkproduktide lagundamiseks autofagia lõpus [1]. Normaalne lüsosomaalne lagunemisfunktsioon on autofagia jaoks hädavajalik, säilitades raku homöostaasi ja võimaldades rakkudel füsioloogilistes seisundites ellu jääda [33–36]. On tõestatud, et paljude neeruhaiguste esinemine ja areng on seotud ebanormaalse autofagiaga [37–39]. Hiljutised uuringud on leidnud, et Sidt2 on lüsosomaalne DNA/RNA transporter. Ebatavalised autofagia tüübid RNautofagia ja DNautofagia (RDA) kaudu on olulised selektiivse RNA / DNA lagunemise jaoks [40]. Oleme varem leidnud, et Sidt2 deletsioon kahjustab autofagosoomide ja lüsosoomide sulandumist, põhjustades kahjustatud mitokondrite lagunemist, mille tulemuseks on skeletilihaste struktuuri ja funktsiooni kahjustus [41]. Seetõttu uurisime selles uuringus autofagiat, kui neerukahjustuse põhjustas Sidt2 deletsioon. Me täheldasime, et Sidt2-/- hiirte neerudesse kogunesid elektronmikroskoopia abil autofagolüsosoomid. Autofagia on dünaamiline protsess, mis hõlmab autofagosoomide moodustumist ning autofagolüsosoomide moodustumist ja lagunemist. Varaste autofagosoomide teket kontrollib Atg geen ja LC3-II moodustumine on märk autofagosoomide moodustumisest [42]. Leidsime, et autofagiaga seotud valkude Atg ja LC3-II ekspressioonid suurenesid pärast Sidt2 deletsiooni, mis näitab, et autofagia aktiivsus võib suureneda. LC3-II kuhjumise võib aga põhjustada ka autofagolüsosoomide raja blokeerimine autofagia lõpus
Sidt2 mõju edasiseks uurimiseks neeru autofagia seisundile mõõdeti P62 lastivalgu ekspressiooni ja moodustumist ning uuriti ka autofagiale suunatud ravimite (CQ ja RAPA) mõju. P62 tuleb kombineerida LC3B-ga ja seejärel lüsosoomis lagundada. P62 valgu taseme tõus tähistab sageli autofagia voo blokeerimist [43]. P62 produktsiooni suurenemise põhjuse kõrvaldamiseks mõõtsime P62 mRNA taset ja leidsime, et P62 tootmine vähenes, seega oli LC3-II akumuleerumine tõenäoliselt tingitud takistatud lagunemisest. Autofagia protsessi edasiseks uurimiseks viisime läbi klorokiini flip-katse. Klorokiin võib neutraliseerida lüsosoomi happelist keskkonda ja seejärel hävitada lüsosoomi funktsiooni ja pärssida autofagiat [44]. LC3-II valgu suurenemine enne ja pärast CQ-ravi peegeldab lüsosoomide poolt lagunenud autofagosoomide arvu, mis võib peegeldada autofagia aktiivsust. Sama CQ flip testi saab kasutada ka P62 lagunemise määra määramiseks autofagolüsosoomi raja kaudu. Kooskõlas meie tulemustega põhjustas Sidt2 kustutamine autofagia voolu vähenemise autofagia blokeeritud otsa tõttu. Samal ajal tõusid RAPA eksperimendis LC3-II ja P62 valgu tasemed märkimisväärselt Sidt2−/− rühmas, mis võib veelgi kinnitada, et Sidt2 puudumine kahjustab autofagia lõppfaasi.
Autofagia lõppfaas hõlmab autofagolüsosoomide moodustumist ja lagunemist. Autofagosoomide ja lüsosoomide sulandumise tuvastamiseks [45, 46] kasutasime LAMP1 ja LC3B immunofluorestsentsi kaaslokaliseerimise katseid ning tulemused näitasid, et autofagosoomide ja lüsosoomide liitmine blokeeriti pärast Sidt2 deletsiooni. Ad-mCherry-GFP-LC3B topeltmärgistamise katse tuvastab autofagolüsosoomide moodustumise ja lagunemise [27]. Lisaks kinnitas see, et autofagolüsosoomide moodustumise ja lagunemise blokeerimine on pärast Sidt2 deletsiooni neerude struktuuri ja funktsiooni kahjustamise peamine põhjus.
Ülaltoodud tulemustest võime järeldada, et Sidt2 puudumine põhjustab happeliste lüsosoomide arvu vähenemist ja lüsosoomide hapestumise düsfunktsioon mõjutab hüdrolüüsitud ensüümide küpsemist. See võib lisaks autofagosoomide ja lüsosoomide sulandumise häiretele olla kõige olulisem autofagia-lüsosoomi lagunemisraja kahjustuse põhjus. Samal ajal võib kahjustatud autofagia protsess olla tihedalt seotud kahjustatud neerustruktuuri ja filtrifunktsiooniga pärast Sidt2 deletsiooni (joonis 8). Meie uuring käsitleb ainult osa Sidt2 mõjust neerude struktuurile ja funktsioonile, kuid huvitav on see, et peamiste autofagia valkude akumuleerumine ning Sidt2 deletsioonist põhjustatud neerude struktuuri ja funktsiooni kahjustus on sarnased muutustega peamistes autofagia valkudes ja suurendas oluliselt diabeetilise nefropaatia korral täheldatud proteinuuriat [37, 47]. Lüsosoomi funktsiooni parandamine võib olla potentsiaalne uus strateegia diabeetilise nefropaatia ravis [37]. Loodame, et Sidt2 pakub tulevikus võimaluse uurida neeruhaiguste patogeneesi ja ravi.
Uriini valgu testimine hiirtel Juhuslikult valitud 12-nädala vanused WT hiired ja Sidt2−/− isased hiired pandi metaboolsetesse puuridesse ja paastus, kuid neile anti vett. Koguti 24-tunnised uriiniproovid ja seejärel testiti neid uriinivalgu suhtes (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, CHN, C035-2-1) (üksikasjalike meetodite saamiseks vaadake lisamaterjale). MPC5 hiire glomerulaarsed podotsüüdid osteti ettevõttest BeNa Culture Collection ja neid kultiveeriti 10% FBS-iga (Excell Bio, Lõuna-Ameerika, FSP500) ja madala glükoosisisaldusega DMEM-iga (Sigma-Aldrich, 6046). SV40 MES 13 hiire glomerulaarsed mesangiaalsed rakud osteti Hiina Teaduste Akadeemia tüüpilisest kultuuri säilitamise komitee rakupangast ja neid kultiveeriti 10% FBS-iga (Excell Bio, Lõuna-Ameerika, FSP500) ja kõrge glükoosisisaldusega DMEM-iga (Sigma-Aldrich, 6429). . Rakukultuuri kasti CO2 kontsentratsiooni hoiti 5% ja temperatuuri 37 kraadi juures. Klorokviin (CQ) ja rapamütsiin (RAPA) osteti firmalt Sigma-Aldrich (C6628, V900930). 10 mM CQ ja 25 mg/ml rapamütsiini lahustati ülipuhtas vees. Petri tassile lisati CQ, nii et lõppkontsentratsioon oli 50 μM, ja inkubeeriti 16 tundi autofagia inhibiitorina. Rapamütsiini lisati Petri tassile lõppkontsentratsioonis 15 μM ja inkubeeriti 2 tundi autofagia aktivaatorina. Sidt2 geeni eemaldamiseks kasutati CRISPR/Cas9 geeni redigeerivat lentiviiruse vektorisüsteemi. Osteti plasmiidid Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang) ja sgRNA veebidisaini tööriista (http://crispr.mit.edu/) kujundage sgRNA, mis on suunatud Sidt2-le.
Praimeri järjestused olid järgmised: F: 5'-ACCACACCGTGACCC CAC-3', R: 5'-GTTGCGGGTCACTGGTGT-3', sünteesitud biotehnoloogiaettevõtte (Sangon Biotech, Shanghai, CHN) poolt. Lenticrispr-v2 plasmiid lineariseeriti CRISPR/Cas9 lentiviiruse süsteemi abil ja ühendati anniilitud sgRNA dupleksiga, et konstrueerida Lenticrispr-v{{1{{180}}}} Sidt2 rekombinantne plasmiid. Lenticrispr-v2 plasmiidi ja Lenticrispr-v2-Sidt2 rekombinantse plasmiidi transfekteerimiseks kasutati Vigofecti (Vigorous Biotechnology, Beijing, CHN) transfektsioonireagenti, et luua lentiviirus. Saadud lentiviirus transfekteeriti MPC5 rakkudesse ja SV40 MES 13 rakkudesse. 48 tunni pärast inkubeeriti rakke selektsioonini 72 tundi purinomütsiiniga. Ellujäänud rakud olid Sidt2+/+ rühm ja Sidt2−/− rühm, mis olid edukalt transfekteeritud. RNA eraldamine ja reaalajas PCR analüüs Hiire neerurakkudest RNA ekstraheerimiseks kasutati Trizoli (Invitrogen) ja spetsiifiline RT-PCR meetod oli selline, nagu eelnevalt kirjeldatud [21]. RT-PCR praimerite järjestused olid järgmised: Aktiin (senss: F: 5′- GGACTCC TATGTGGGTGACG-3′, R:5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′), P62 (senss: F:5 ′- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3′, R: 5′-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3′), Sidt2 (senss: F:5′-TAGTGCCTGTTACCACGTCTGC-3′-RTCGAT:TAGCAG'-CTG, {48}}′). Western blotting Spetsiifiline meetod on nagu eespool mainitud [28]. Selles uuringus hõlmasid primaarsed antikehad küüliku anti-LC3B (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), küüliku anti-P62 (1:1000; Abcam ab205719), hiire anti- -aktiini (1:1000; Sigma Aldrich). A5316), küüliku anti-Sidt2 (1:1000; Invitrogen PA5-69064), küüliku anti-Atg5 (1:1000; Cell Signaling Technology 9980S), küüliku anti-Atg7 (1:1000; Cell Signaling Technology 8558S) , küüliku anti-Atg12 (1:1000; Cell Signaling Technology 2011S), hiire anti-LAMP1 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology H4A3), küüliku anti-katepsiin B (1:1000; Cell Signaling Technology 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Rakud inokuleeriti Nunc klaaspõhjaga Petri tassidele. Pärast sobiva tiheduseni kasvatamist lisati Ad-mCherry-GFP-LC3B (Beyo time, Shanghai, CHN, C3011-10 ml), mille tulemuseks oli lõppkontsentratsioon 10–11 vp/ml. Pärast 48-tunnist stimuleerimist jälgiti mCherry ja GFP fluorestsentspunktide arvu otse laserkonfokaalse mikroskoobi all (Leica SP8, Saksamaa). Immunofluorestsents Rakud inokuleeriti klaaspõhjaga Petri tassidele ja fikseeriti paraformaldehüüdiga. Pärast blokeerimist inkubeeriti rakke üleöö primaarse antikehaga ja seejärel inkubeeriti sekundaarse antikehaga 90 minutit pimedas. Rakud pildistati laserskaneeriva konfokaalse mikroskoobiga (Leica SP8, Saksamaa) pärast tuumade värvimist DAPI-ga (1 ug/ml). Primaarsete antikehade hulka kuulusid P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Santa Cruz Biotechnology H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); sekundaarsete antikehade hulka kuulusid hiirevastane teine anti-Cy{128}}konjugeeritud Affinipure kitse hiirevastane IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00009-1), CoraLite488-konjugeeritud Affinipure kits hiirevastane IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite594- konjugeeritud Affinipure'i kitse küülikuvastane IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA{{144 }}). LysoTrackeri (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046) jaoks inokuleerisime rakud ka klaaspõhjaga Petri tassidele. Pärast sobiva tiheduseni kasvatamist lisati rakkudele rakukultuuri vedelik, mis sisaldas LysoTrackeri lõppkontsentratsiooni 75 nM, mis pildistati pärast 45 m stimulatsiooni. Kasutage ImageJ-d fluorestseeruvate punktide arvu ja Pearsoni korrelatsioonikordaja loendamiseks. Vaatlused ülekandeelektronmikroskoobiga Igast rühmast valiti juhuslikult 3-5 12-nädalased Sidt2-/- ja WT isased hiired, kes valmistasid ette neerukoe elektronmikroskoopilisi proove ning spetsiifiline meetod on selline, nagu varem kirjeldatud [48] , pildistage lõikeid juhuslikult elektronmikroskoobiga, iga hiire kohta on neerulõikudest tehtud üle 10 pildi, valige iga hiire elektronmikroskoobi piltidest juhuslikult 3–5 pilti 8000× suurendusega, arvutage autofagolüsosoomide arv pildil ja võrrelge Sidt2−/− rühma WT rühmaga. Seoses rakuelektronmikroskoobi proovide ettevalmistamisega kraapige rakukaabitsaga vähemalt 105 rakku ja koguge need EP-katsuti, seejärel tsentrifuugige kiirusel 800 p/min 5 m, visake supernatant ära ja täitke see elektronmikroskoobi fiksaatoriga. Pärast 4-kraadises külmikus üle 1 h hoidmist võib selle esitada kontrollimiseks. Elektronmikroskoobi pildi tegi KingMed Diagnostics (Guangzhou, Hiina). LysoSensor Rakud inokuleeriti 96-süvendiga plaadile. Pärast sobiva tiheduseni kasvatamist lisati eelsoojendatud (37 kraadi) sööde, mis sisaldas 1 uM LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545). Rakke inkubeeriti 5 minutit 37 kraadi juures ja seejärel sööde eemaldati ja asendati pärast rakkude kolmekordset pesemist PBS-ga. WellScani režiimi kasutati plaadi lugemiseks rakenduses BioTek Citation 5 (BioTek, Winooski, VT, USA). Fluorestsentsi mõõdeti Ex360nm/Em450nm ja Ex380nm/Em540nm ergastuse/emissiooni lainepikkuste abil ning lüsosoomi pH määrati Em540 ja Em450 suhtest. Statistiline analüüs Tulemused väljendati keskmisena ± SEM. Kahe rühma statistiline võrdlus viidi läbi paaritute t-testide abil. Kui statistilise analüüsi jaoks kasutati Graphics 8.0 tarkvara, peeti statistiliselt oluliseks P < 0,05. Selle uuringu iga katserühma korrati vähemalt kolm korda sõltumatult. ANDMETE KÄTTESAADAVUS Käesoleva uuringu käigus loodud ja/või analüüsitud andmekogumid on mõistliku nõudmise korral kättesaadavad vastavalt autorilt.
VIITED
1. Settembre C, Fraldi A, Medina DL, Ballabio A. Lüsosoomi signaalid: rakkude kliirensi ja energia metabolismi juhtimiskeskus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013;14:283–96.
2. Lamming DW, Bar-Peled L. Lüsosoom: metaboolne signaalimiskeskus. Liiklus. 2019;20:27–38.
3. Ballabio A. Äge lüsosoom. EMBO Mol Med. 2016;8:73–76.
4. Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi A, Kimura T, Namba T, Matsuda J jt. Kõrge rasvasisaldusega dieedist põhjustatud lüsosomaalne düsfunktsioon ja autofagilise voolu kahjustus soodustavad lipotoksilisust neerudes. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1534–51.
5. Nonclercq D, Wrona S, Toubeau G, Zanen J, Heuson-Stiennon JA, Schaudies RP jt. Torukujuline vigastus ja regeneratsioon roti neerudes pärast ägedat kokkupuudet gentamütsiiniga: ajaline uuring. Ren Fail. 1992;14:507–21.
Wecistanche'i tugiteenus - Hiina suurim tsistanšeksportija:
E-post:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel:+86 15292862950
Lisateabe saamiseks ostke:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
