Abstraktne

Depressioon on maailmas väga levinud ja invaliidistav psühhiaatriline häire. Kasvavad tõendid näitavad, et ülemäärane neuroinflammatoorse aktiveerumine hipokampuses aitab oluliselt kaasa depressiivsete sümptomite ilmnemisele ja progresseerumisele. Cistanche fenüületanoolglükosiidid (CPhG), peamised bioaktiivsed koostisosad, mis on ekstraheeritud traditsioonilistest söödavatest ravimtaimedestCistanche deserticolajaCistanche tubulosa, on varasemates uuringutes näidanud mitmeid neuroprotektiivseid farmakoloogilisi omadusi. Käesoleva uuringu eesmärk oli uurida CPhG-de terapeutilisi mõjusid ja molekulaarseid mehhanisme depressioonitaolistele käitumuslikele fenotüüpidele, mille käivitas krooniline ettearvamatu kerge stress (CUMS) C57BL/6 hiirtel.

Kuuskümmend SPF-klassi C57BL/6 hiirt jaotati juhuslikult kuueks katserühmaks: kontrollrühm, CUMS-mudeli rühm, suure annusega CPhG-de rühm (700 mg/kg), keskmise annusega CPhG-de rühm (350 mg/kg), väikese annusega CPhG-de rühm (175 mg/kg), 5 mg/kg-positiivne rühm. Pärast neljanädalast ravimisoodiga sekkumist pärast CUMS-i modelleerimist viidi läbi põhjalikud neurokäitumuslikud hinnangud, sealhulgas sahharoosi eelistustesti (SPT), avatud välja testi (OFT), saba riputamise test (TST) ja sunnitud ujumise test (FST). Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) komplektid kvantifitseerisid seerumi monoamiini neurotransmitterite kontsentratsiooni koos hipokampuse põletikueelsete tsütokiinide ja põletikuliste vahendajatega. Hematoksüliin-eosiini (HE) värvimine ja Nissli värvimine visualiseerisid neuronaalseid patoloogilisi vigastusi hipokampuse dentate gyrus piirkondades. Immunohistokeemia tuvastas gliaalfibrillaarse happelise valgu (GFAP), ioniseeritud kaltsiumi siduva adaptermolekuli-1 (Iba-1), NLRP3 ja kaspaas-1 valkude ekspressiooni intensiivsuse. Immunofluorestsentsvärvimine hindas täiendavalt ülesvoolu TLR4 / NF-κB signaaliülekande kaskaadi aktivatsiooni olekut.

Meie katsetulemused näitasid, et suukaudne CPhG-de manustamine leevendas märkimisväärselt depressiooniga seotud käitumishäireid. CPhG-d suurendasid sahharoosi eelistusprotsenti ja vähendasid liikumatuse kestust meeleheitel põhinevates käitumisparadigmades. Lisaks taastas CPhG-ravi ammendunud seerumi ja hipokampuse serotoniini (5-HT) ning dopamiini (DA) taseme. Biokeemiline tuvastamine näitas hipokampuse põletikueelsete vahendajate olulist pärssimist ja tsütokiinide ületootmist. Histopatoloogilised vaatlused näitasid annusest sõltuvat leevendust CUMS-i poolt põhjustatud hipokampuse neuronite kahjustustele. Immunohistokeemilised tulemused näitasid, et CPhG-d suurendasid GFAP-ga tähistatud astrotsüütide tihedust, inhibeerisid Iba-1-positiivse mikrogliia patoloogilist hüperaktivatsiooni ja vähendasid NLRP3 põletikuga seotud valkude arvukust. Immunofluorestsentsanalüüsid kinnitasid, et CPhG-d piirasid liigset TLR4 ja fosforüülisid NF-κB p65 aktivatsiooni hipokampuse koes.

Kokkuvõttes kinnitavad need leiud, et CPhG-d avaldavad hiirtel silmapaistvat antidepressandilaadset toimet CUMS-i poolt stimuleeritud depressioonitaoliste ilmingute vastu. Selle farmakoloogiline mehhanism on osaliselt vahendatud kahe regulatiivse funktsiooni kaudu: monoamiini neurotransmitteri homöostaasi taastamine ja TLR4 / NF-κB / NLRP3 signaalitelje poolt vahendatud neuroinflammatoorsete reaktsioonide piiramine. See loomkatse annab prekliinilise eksperimentaalse aluse, mis toetab CPhG-de edasist kasutamist kui paljulubavaid looduslikke kandidaataineid või funktsionaalseid toidu koostisosi depressiooni adjuvantraviks.

Märksõnad: Cistanche fenüületanoolglükosiidid (CPhG-d); depressioon; krooniline ettearvamatu kerge stress; neuropõletik; astrotsüüdid; mikrogliia; TLR4 / NF-κB / NLRP3 põletikurada

1. Sissejuhatus

Depressioon on mitmetahuline afektiivne psühhiaatriline haigus, mida iseloomustavad peamised kliinilised ilmingud, mille hulka kuuluvad püsiv madal meeleolu, anhedoonia, psühhomotoorne aeglustumine, une-ärkveloleku häired ja somaatiline düsfunktsioon. Rasked depressiivsed episoodid võivad viia enesevigastamise ja enesetapumõteteni, tekitades kogu maailmas tohutult rahvatervist. Hiina epidemioloogiliste uuringute andmetel ulatub depressiooni levimus riigis 2,1 protsendini ja Maailma Terviseorganisatsioon on liigitanud raske depressiivse häire kõige populaarsemate haiguste hulka, mis aitavad kaasa ülemaailmsele puude järgi korrigeeritud eluaastate kaotusele.

Sellegipoolest on depressiooni patogeneesi aluseks olev täielik molekulaarne etioloogia endiselt ebatäielikult välja selgitatud, takistades täiuslikke kliinilisi terapeutilisi lahendusi. Kaasaegsed patofüsioloogilised hüpoteesid on keskendunud neuroimmuunsete läbirääkimiste mehhanismidele. Prekliiniliste ja kliiniliste uuringute kogunemine toob esile püsiva neuropõletiku kui depressiivsete häirete olulise patogeense tõukejõu. Krooniliste psühholoogiliste või füsioloogiliste stressiprobleemide korral aktiveeruvad hipokampuse gliiarakkude populatsioonid ebanormaalselt. Üleaktiveeritud mikrogliia ja düsfunktsionaalsed astrotsüüdid vallandavad mitmete põletikueelsete vahendajate tugeva vabanemise, luues põletikueelse tsütokiini kaskaadi võimendamise efekti. Sellised neuro-põletikulised solvangud indutseerivad veelgi neuronite morfoloogilist halvenemist, neurotransmitterite metaboolseid häireid ja sünaptilise plastilisuse häireid, hõlbustades lõpuks depressioonilaadset patoloogilist progresseerumist.

Praegused peamised kliinilised antidepressantide sekkumised põhinevad peamiselt sünteetilistel keemilistel antidepressantidel, mida esindab fluoksetiin, selektiivne serotoniini tagasihaarde inhibiitor (SSRI). Vaatamata teatud patsientide sümptomite osalisele leevendusele on sünteetilistel antidepressantidel hästi äratuntavad puudused: ebarahuldavad täieliku remissiooni suhtarvud, sagedased jääkdepressiivsed sümptomid, suur retsidiivide tõenäosus pärast ravimi ärajätmist, pluss pikaajalisel manustamisel seedetrakti, maksa ja metaboolsed kõrvaltoimed. Seevastu traditsioonilistel taimsetel ravimitel on mitme eesmärgiga moduleerivad omadused ja suhteliselt leebe ohutusprofiil, mis tekitab kasvavat uurimishuvi meeleoluhäirete adjuvantravi vastu.

Cistanche deserticolajaCistanche tubulosa, mida tavaliselt nimetatakse "kõrbe ženšenniks", kuuluvad Orobanchaceae perekonda. Nende lihavad varred on traditsioonilises Aasia ravimtaimepraktikas klassikaline homoloogne ravimtoidu tooraine. Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud dokumenteerivad mitmeid neuroprotektiivseid bioaktiivsusiCistancheekstraktid, sealhulgas neurodegeneratsioonivastane toime Alzheimeri tõve ja Parkinsoni tõve vastu. Fenüületanoolglükosiidid moodustavad peamised bioaktiivsed fraktsioonidCistancheekstraktid, mis sisaldavad peamiselt ehhinakosiidi ja verbaskosiidi. Tsistanche fenüületanoolglükosiididel (CPhG-d) on kasvajavastane, antioksüdantne, immunomoduleeriv ja neuroprotektiivne bioaktiivsus mitmel katseplatvormil.

Eelnev laboritöö on näidanud, et CPhG-d võivad näriliste loommudelites tõsta striataalset dopamiini kontsentratsiooni ja leevendada menopausiga seotud depressiivseid fenotüüpe. Siiski puudub süstemaatiline uurimine, kas CPhG-d avaldavad kaitsvat mõju kroonilise stressi põhjustatud depressioonile ja selliseid bioaktiivsusi vahendavaid üksikasjalikke signaaliülekandekaskaade. Kroonilise ettearvamatu kerge stressi (CUMS) loomade paradigma on üks hästi väljakujunenud prekliinilise depressiooni mudel. Kokkupuutes laboratoorsed närilised järjestikuste nädalate jooksul mitmekesiste juhuslike kergete stressoritega, võtab CUMS usaldusväärselt kokku peamised depressiivsed tunnused, nagu anhedoonia, käitumuslik meeleheide ja hipokampuse neuropatoloogilised kahjustused.

Sellest lähtuvalt koostas see uuring CUMS-i indutseeritud depressiivse hiire mudeli, et hinnata süstemaatiliselt CPhG-de kolme gradientannuse in vivo antidepressantide sarnast tugevust. Keskendusime eelkõige monoamiini neurotransmitterite taastumisele, hipokampuse gliiarakkude fenotüübilisele transformatsioonile ja TLR4/NF-κB-ga juhitavale NLRP3 põletikulisele neuro-põletikulisele rajale. Selle uuringu eesmärk on anda objektiivseid eksperimentaalseid tõendeid, et toetada depressiivsete sümptomite parandamiseks mõeldud CPhG-de edasist ravimiarendust ja funktsionaalset toidu kasutamist.

2. Materjalid ja meetodid

2.1 Katsematerjalid, reaktiivid ja instrumendid

Standardiseeritud CPhG-de toorekstrakt saadi ettevõttelt Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd (partii nr. 20231221, Xinjiang, Hiina). Fenüületanoolglükosiidi üldsisaldus 85 % või suurem, sisaldab ehhinakosiidi 40 % või rohkem ja verbaskosiidi 16 % või rohkem. Fluoksetiinvesinikkloriidi kapslid saadi firmalt Patheon France. Kaubanduslikud ELISA testikomplektid 5-HT, DA, iNOS, COX-2, PGE2, TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN- jaoks hangiti kvalifitseeritud bioloogiliste reaktiivide tarnijatelt. Immunohistokeemia ja immunofluorestsentsi jaoks kasutatud primaarsed antikehad hõlmasid anti-GFAP, anti-Iba-1, anti-NLRP3, anti-kaspaas-1, anti-TLR4 ja anti-fosfo-NF-κB p65 antikehi. HE ja Nissl värvimise histoloogilised värvimiskomplektid valmistati parafiini ajuosa töötlemiseks.

Peamised laboratoorsed analüütilised instrumendid hõlmasid ülitäpseid elektroonilisi analüütilisi kaalusid, Milli-Q ülipuhta vee puhastamise tööjaama, SpectraMaxi mitmerežiimilist mikroplaadilugejat, Leica püstist fluorestsentsmikroskoopi, lisaks täielikku näriliste käitumise analüüsi riistvara ja SMART 3.0 liikumisjälgimise tarkvarasüsteemi.

Kuuskümmend isast SPF-klassi C57BL/6 hiirt, seitsmenädalased esialgse kehamassiga 18–22 g, osteti ettevõttelt Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Kõik hiirte eksperimentaalsed manipulatsioonid said ametliku eetilise heakskiidu Shaanxi Hiina meditsiini ülikooli loomaeetika komiteelt ID: (SUC3101500). Hiiri hoiti spetsiifilistes patogeenivabades loomapidamisruumides. Keskkonnaparameetreid hoiti ümbritseva õhu temperatuuril (21 ± 2) kraadi ja suhtelisel õhuniiskusel 60% ± 10%, rakendades standardseid 12-tunniseid hele-pimeduse valgustuse tsükleid. Näriliste toidule ja joogiveele oli juurdepääs ad libitum. Enne ametlike eksperimentaalsete töövoogude alustamist viidi läbi ühenädalane adaptiivne aklimatiseerumisperiood.

2.2 Loomade rühmitamine, CUMS-i modelleerimine ja ravimihaldus

Pärast ühenädalast adaptiivset kasvatamist välistasid esialgsed sahharoosieelistuste sõeluuringud üksikud hiired, kellel oli omane madal suhkrujoomise eelistus. Kvalifitseeritud katsehiired randomiseeriti kuue uuringurühma (igas rühmas n = 10 looma):

Kontrollrühm (Con): CUMS-i stressi puudumine, isovolummeetrilise deioniseeritud vee intragastriline manustamine;

CUMS-i mudelirühm (Mod): täieliku CUMS-stimulatsiooni saamine, sondiga võrdse mahuga deioniseeritud vesi;

Suurte annustega CPhG-de rühm (CPhGs-H): CUMS-i kokkupuude, CPhG-d 700 mg/kg kehamassi kohta päevase sondiga;

Keskmise annusega CPhG-de rühm (CPhGs-M): CUMS-i kokkupuude, CPhG-d 350 mg/kg päevase sondiga;

Madala doosiga CPhG-de rühm (CPhGs-L): CUMS-i kokkupuude, CPhG-d 175 mg/kg päevase sondiga;

Fluoksetiini positiivne kontrollrühm (FLX): CUMS-i kokkupuude, fluoksetiini 15 mg/kg sondiga üks kord päevas.

CUMS-i mudeli ehitamiseks võeti kasutusele kümme erinevat tüüpi kerget stressitegurit: füüsiline piiramine (60 min), horisontaalne raputamine (60 min), saba vedrustus (60 min), puur kallutatud 45-kraadise nurga all (24 h), niiske allapanu keskkond (24 h), tühja puuri isoleerimine (24 h), üleöö kuum vesi (12 h valgustus), 4 min. külmas vees ujumine 4 kraadi juures 5 minutit ja sabaklambri stimulatsioon, mis kestab 2 minutit. Iga päev rakendati juhuslikult kahte erinevat stressitegurit; identne stressor ei ilmuks järjestikku kahel kõrvutisel päeval. CUMS-i modelleerimisprotseduur kestis neli nädalat.

Pärast neljanädalase stressimodelleerimise lõpetamist manustati vastavaid uuritavaid aineid või lahusti vehiikulit maosiseselt üks kord päevas veel nelja nädala jooksul. Kaheksandal katsenädalal rakendati järjestikku kõiki neuro-käitumusliku tuvastamise projekte.

2.3 Neuro-käitumusliku testi aku

2.3.1 Sahharoosi eelistuste test (SPT)

Sahharoosi eelistuste test hindab näriliste anhedoonia-sarnast tuum-depressiivset fenotüüpi. Enne ametlikku mõõtmist majutati iga hiir eraldi. Viidi läbi kolmepäevane sahharoosijoogi kohanemise faas. Esimene päev: kaks pudelit 1% sahharoosilahusega asetatakse igasse puuri 24 tunniks. Teine päev: üks sahharoosilahuse pudel, mis on ühendatud ühe puhastatud vee pudeliga. Kolmas päev: vahetage suhkruvee ja puhta vee mahutite asendit, et välistada asukoha nihke mõju. Pärast kohanemistsüklit paastusid hiired toidust ja veest 24 tundi. Seejärel tarniti eelnevalt kaalutud 1% sahharoosi veepudel ja puhastatud vee pudel. Pudelite positsioonid vahetati 12 tunni pärast. Pärast kogu 24-tunnist testimist registreeriti mõlema pudeli järelejäänud vedeliku mass täpselt. Sahharoosi eelismäär (%)=(sahharoosilahuse tarbimine)/(sahharoosilahuse tarbimine + puhastatud vee tarbimine) × 100 %.

2.3.2 Avatud välja test (OFT)

Avatud aparaat moodustas 50 cm × 50 cm × 50 cm avatud kuupkasti. Keskväljaku piirkond määratleti kui 25 cm × 25 cm kesktsoon, mille keskpunkt oli areeni sees. Iga hiir asetati õrnalt avatud väljakasti keskpinnale. Lubatud oli viis minutit vaba kohanemisaega. Käitumise salvestamine ja andmete analüüs keskendusid järgnevale viieminutilisele vaatlusperioodile. Peamised näidikud sisaldasid kogu liikumiskaugust, kesktsoonis viibitud aega ja kesktsooni sisenemise sagedust. Need parameetrid peegeldavad spontaanset liikumisaktiivsust ja uurimisvalmidust tundmatutes keskkonnatingimustes.

2.3.3 Sabavedrustuse test (TST)

Hiire sabaosa oli kindlalt fikseeritud, võimaldades loomal rippuda tagurpidi maapinna kohal. Salvestusaeg kokku oli kuus minutit. Dokumenteeriti liikumatu aja kestus hilisema neljaminutilise lõigu jooksul. Suurenenud liikumatuse aeg näitab käitumise-meeleheite depressiivse seisundi paranemist.

2.3.4 Sunnitud ujumise test (FST)

Läbipaistev silindriline ujumistünn (läbimõõt 15 cm, kõrgus 50 cm) täideti veega, mida hoiti (25 ± 2) kraadi juures; vee sügavus ulatus 20 cm-ni. Iga hiir asetati õrnalt ujumismahutisse kuueminutilise salvestusintervalli jaoks. Viimase nelja minuti ujuva liikumatuse aeg kvantifitseeriti statistiliselt. Pikem liikumatusperiood näitab meeleheitega seotud käitumuslikkuse intensiivistumist.

2.4 Proovide võtmine ja kudede ettevalmistamine

8. nädala katse lõpp-punktis süstiti hiirtele sügava anesteesia eesmärgil 3% pentobarbitaalnaatriumi (10 ml/kg) intraperitoneaalselt. Vereproovid koguti silmamuna eemaldamise verejooksu tehnikaga. Seejärel viidi läbi emakakaela dislokatsiooni eutanaasia. Külma normaalse soolalahusega südameperfusioon puhastas ajukudedes ringleva vere. Terviklikud koguaju proovid lõigati kiiresti välja. Pool ajukoed kasteti 4% paraformaldehüüdi lahusesse 72 tunniks koefiksatsiooniks järgnevaks histoloogiaks. Hippokampuse ajupiirkonnad eraldati kiiresti ülejäänud ajuproovidest eeljahutatud jääplatvormil ja säilitati vedela lämmastiku hoiukeskkonnas. Biokeemiliseks mõõtmiseks segati 10 mg hipokampuse koeproovi eeljahutatud normaalse soolalahusega massi-mahu suhtega 1:9, läbides jäävannis mehaanilise homogeniseerimise. Kudede homogenaati tsentrifuugiti kiirusel 4000 p/min 15 minutit ja supernatandi fraktsioonid koguti ELISA biomarkerite kvantifitseerimiseks.

2.5 Biokeemilise indeksi mõõtmine

Vastavalt kaubanduslike ELISA komplektide tootja kasutusjuhenditele mõõdeti seerumi ja hipokampuse homogenaadi supernatandi proove, et saada monoamiini neurotransmitterite, sealhulgas 5-HT ja DA, kontsentratsiooni väärtused. Hippokampuse homogenaadi supernatanti analüüsiti lisaks põletikuliste vahendajate indikaatorite iNOS, COX-2, PGE2 ja põletikueelsete tsütokiinide TNF-, IL-1, IL-18, IL-6 ja IFN- suhtes. Optilise tiheduse neeldumisnäidud saadi mikroplaadi spektrofotomeetriga. Proovi valgu kontsentratsioon kalibreeriti enne tsütokiinide tuvastamist BCA valgu kvantifitseerimiskomplekti abil.

2.6 Hippokampuse histopatoloogiline värvimine

Fikseeritud ajukoe proovid sisestati parafiinvahasse ja viilutati 4 μm paksusteks histoloogilisteks lõikudeks. HE värvimiseks: parafiini lõigud läbisid ksüleeni vahade eemaldamise, gradiendiga etanooli hüdratatsiooni, hematoksüliini tuumavärvimise, eosiini tsütoplasmaatilise vastuvärvimise, vesinikkloriid-alkoholi diferentseerimise, gradiendi etanooli dehüdratsiooni, ksüleeni läbipaistvuse töötlemise ja neutraalse kummi paigaldamise. Mikroskoopiline vaatlus keskendus raku morfoloogiale, tuuma staatusele ja tsütoplasmaatilisele struktuurilisele terviklikkusele hipokampuse dentate gyrus piirkonnas.

Nissl-värvimine visualiseerib neuronaalseid Nissl-i kehakesi, mis peegeldavad neuronaalset biosünteetilist aktiivsust ja rakkude elujõudu. Deparafiini viilud inkubeeriti Nissli värvimislahuses. Pärast destilleeritud veega pesemist tehti sektsioonid dehüdratsioon, läbipaistvusprotseduur ja pitseerimine. Optilise mikroskoobi all täheldati hipokampuse neuronite histomorfoloogilisi variatsioone.

2.7 Immunohistokeemia analüüs

Parafiiniga manustatud hipokampuse koe lõigud vahastati ja hüdreeriti. Järjestikku rakendati antigeeni otsimise, endogeense peroksidaasi blokeerimise ja mittespetsiifilise valgu sidumise blokeerimise etapid. Koelõike inkubeeriti üleöö temperatuuril 4 kraadi koos lahjendatud primaarsete antikehadega: anti-GFAP (1:400), anti-Iba-1 (1:400), anti-NLRP3 (1:300), anti-kaspaas-1 (1:400). Pärast sekundaarse antikeha inkubeerimist viidi läbi DAB kromogeenne reaktsioon. Tuumade värvimise, dehüdratsiooni ja paigaldamise protseduurid viidi lõpule. Valgusmikroskoobiga jäädvustatud digitaalsed vaatevälja kujutised. Image-J pilditöötlustarkvara arvutas välja keskmised optilise tiheduse väärtused, et hinnata poolkvantitatiivselt sihtvalgu ekspressiooniintensiivsust.

2.8 Immunofluorestsentsvärvimine

Ettevalmistatud parafiini hipokampuse lõigud kogesid vaha eemaldamist, antigeeni otsimist ja blokeerimist. Rakendati primaarsed anti-TLR4 (1:400) ja anti-fosfo-NF-κB p65 (1:200) antikehad ja inkubeeriti öö läbi temperatuuril neli kraadi Celsiuse järgi. Fluorestseeruva märgistusega sekundaarsed antikehad lisati ühetunniseks inkubeerimiseks valguse varjestuse seisundis. DAPI tuumavastane plekk lisati paigaldusvahendisse. Laserfluorestsentsmikroskoobiga pildistatud fluorestsentssignaalid. Image-J tarkvara arvutas välja keskmise fluorestsentsi intensiivsuse, mis esindab TLR4 ja p-NF-κB p65 valgu aktiveerimise ulatust.

2.9 Statistiline analüüs

Algseid katseandmeid töödeldi SPSS 26.0 statistikatarkvara ja GraphPad Prism 9.0 graafikuprogrammi abil. Kõik kvantitatiivsed tulemused väljendati kui keskmine ± standardhälve (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Rühmadevahelised statistilised võrdlused viidi läbi asjakohaste statistiliste testidega. P-väärtust alla 0,05 hinnati statistiliselt oluliseks erinevuseks; P< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Katsetulemused

3.1 CPhG-d parandasid anhedoonia sümptomeid ja taastasid monoamiini neurotransmitterite tasemed

Enne CUMS-i modelleerimise alustamist ei näidanud sahharoosieelistuste algtasemed selget statistilist erinevust kõigi katseloomade kohortide lõikes. Pärast neljanädalast CUMS-i stressi pluss neljanädalasi sekkumistsüklit oli CUMS-i mudelirühmal selgelt vähenenud sahharoosi-eelistuse suhe võrreldes stressita kontroll-loomadega (P< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

Võrreldes Mod mudeli kohordiga tekitasid kõrge, keskmise ja väikese annuse CPhG-ravi rühmad ning fluoksetiini positiivsed rühmad sahharoosieelistuse protsendi, seerumi 5-HT, seerumi DA, hipokampuse 5-HT ja hipokampuse DA sisalduse märgatava tõusu (P< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 CPhGs täiustatud uurimuslik tegevus avatud välitestis

Käitumise avatud välja hindamisel näitasid CUMS-mudeli hiired märkimisväärset kogu liikumiskauguse, kesktsoonis viibimise aja ja keskpiirkonda sisenemise sageduse vähenemist võrreldes kontrollhiirtega (P< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 CPhG-d lühendasid liikumatuse aega meeleheitel põhinevates käitumisparadigmades

Sabavedrustuse test ja sundujumise test tuvastavad käitumusliku meeleheite, esindades põhilisi depressiivseid käitumisnäiteid. Mod-rühmal oli nii TST kui ka FST korral drastiliselt pikenenud liikumatusaeg (P< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3,4 CPhG-d vähendavad üleekspresseeritud hipokampuse põletikueelseid tsütokiine

Hipokampuse põletikueelsete tsütokiinide (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) kontsentratsioon CUMS-mudeli loomadel oli kontrollrühmaga võrreldes drastiliselt kõrgem (P< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3,5 CPhG allareguleeritud hipokampuse põletikulise vahendaja biomarkerid

Hippokampuse põletikulised vahendajad iNOS, COX-2 ja PGE2 suurenesid CUMS-mudeli hiirtel märkimisväärselt (P< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3,6 CPhG-d nõrgestatud CUMS-i käivitatud hipokampuse neuronaalne patoloogiline vigastus

HE värvimistulemused: Mod rühma hipokampuse dentate-gyrus neuronid esitasid tõsiseid patoloogilisi kahjustusi: raku ebakorrapärane paigutus, tuuma püknoos, tsütoplasmaatiline vakuolaarne degeneratsioon, mis avaldas silmatorkavaid neuronaalseid kahjustusi. CPhGs-L rühmal oli ainult triviaalne paranemisefekt. Keskmise ja suure annusega CPhG-d muutsid sellised patoloogilised muutused ilmselgelt ümber; suurte annuste CPhGs-H rühmal oli osalistel nägemisväljadel parem neuronite kaitseefekt võrreldes fluoksetiini rühmaga.

Nissl-värvimise tulemused: Mod-rühma hipokampuse neuronitel ilmnes ebakorrapärane paigutus, Nissl-i korpuse hulga silmatorkav vähenemine, mis peegeldas neuronite sünteetilise funktsiooni halvenemist ja madalat raku elujõudu. CPhG-de manustamine taastas annusest sõltuvalt Nissl-keha arvukuse. Neuronaalne morfoloogia ja Nissl-kehade tihedus CPhGs-H rühmas lähenesid normaalsele kontrollrühma tasemele. Histopatoloogilised leiud kinnitasid, et CPhG-d kaitsesid hipokampuse neuronite terviklikkust kroonilise stressi vahendatud hävimise eest.

3,7 CPhG-de reguleeritud hipokampuse gliiarakkude aktiveerimise olek

GFAP on astrotsüütide populatsiooni spetsiifiline biomarker. Võrreldes Con-rühmaga langes Mod-grupi hipokampuse GFAP positiivse signaali intensiivsus märkimisväärselt (P< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

Iba-1 valgu marker esindab mikrogliat. CUMS-i mudelirühm näitas järsult suurenenud Iba-1 positiivse ekspressiooni signaali (P< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3,8 CPhG inhibeeritud hipokampuse NLRP3-põletikulise-seotud-valgu ekspressioon

Immunohistokeemia tuvastamine näitas, et NLRP3 ja kaspaas-1 valgu ekspressioon Mod-rühma hipokampuses oli märkimisväärselt ülesreguleeritud (P< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3,9 CPhG-d surusid alla TLR4/NF-κB signaaliraja üleaktiveerimise

Immunofluorestsentsi tuvastamine näitas, et CUMS-mudeli hiirtel oli TLR4 retseptori ja fosforüülitud NF-κB p65 subühiku fluorestsentsi intensiivsus oluliselt suurenenud (P< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Arutelu

Suur depressiivne häire kujutab endast tõsist neuropsühhiaatrilist haigust. Viimastel aastatel on depressiooni neuro-põletikuline teooria äratanud laialdast teaduslikku tähelepanu. Krooniline korduv psühholoogiline stress võib vallandada kesknärvisüsteemis kaasasündinud immuunsüsteemi aktivatsiooni. Hippokampus, üks ajupiirkond, mis on stressi solvangute suhtes väga haavatav, on tihedalt seotud meeleolu modulatsiooni, tasu töötlemise ja mälufunktsiooniga. Pideva stressistimulatsiooni korral variseb hipokampuse gliiarakkude homöostaas kokku. Hüperaktiveeritud mikrogliia ja kahjustatud astrotsüüdid eritavad suures koguses põletikueelseid tsütokiine, põhjustades neuronaalse struktuuri kahjustusi, monoamiini-neurotransmitteri ainevahetushäireid, mis lõpuks soodustavad depressioonitaolist käitumist.

Traditsioonilistel taimsetest ravimitest saadud aktiivsetel looduslikel toodetel on mitme eesmärgiga farmakoloogilised eelised, mis on paljulubavad kandidaatressursid antidepressantide avastamiseks. CPhG-d on iseloomulikud bioaktiivsed komponendid, millest eraldatakseCistancheravimtaim. See uuring koostas CUMS-i indutseeritud kroonilise stressiga depressiooni hiiremudeli, mis kontrollis põhjalikult gradientannusega CPhG-de in vivo antidepressantide sarnast efektiivsust. Käitumiskatsete tulemused näitasid, et CPhG-ravi leevendas märkimisväärselt anhedoonia sümptomeid, parandas uurimisaktiivsust ja vähendas depressioonimudeliga hiirte meeleheitega seotud liikumatuse aega, mis näitab selget annuse ja mõju korrelatsiooni.

Monoamiini neurotransmitteri hüpotees on klassikaline depressiooni patogeneesi teooria. Serotoniin ja dopamiin täidavad kriitilisi reguleerivaid rolle, mis hõlmavad emotsionaalset stabiliseerimist, tasu ja tagasiside tajumist ja motivatsiooniga seotud käitumise moduleerimist. CUMS-i stress põhjustas meie mudelloomadel 5-HT ja DA kontsentratsioonide ilmse languse seerumi ja hipokampuse kudedes. CPhG-de sekkumine taastas tõhusalt need kaks monoamiini neurotransmitteri taset. See tulemus on kooskõlas varem avaldatud uurimisaruannetegaCistancheekstraktid, mis moduleerivad aju monoamiini neurotransmittereid.

Täiendav biokeemiline biomarkeri testimine näitas, et CUMS kutsus esile mitmete põletikueelsete tsütokiinide (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) pluss põletikuliste vahendajate (iNOS, COX-2, PGE2) tugeva tõusu hipokampuse koes. CPhG-de sekkumine muutis sellise põletikulise üleekspressiooni staatuse oluliselt ümber. Histopatoloogiline HE ja Nissl värvimine tõestas intuitiivselt, et CPhG-d leevendasid stressist põhjustatud hipokampuse-neuronikahjustusi ja kaitsesid neuronite morfoloogilist terviklikkust.

Gliiarakkude populatsioonid on neuro-põletikulisi reaktsioone vahendavad kesksed osalejad. Astrotsüüdid säilitavad neurotransmitterite ringlussevõtu, hematoentsefaalbarjääri struktuuri stabiilsuse ja neuronite toitumise. Mikroglia toimib aju parenhüümis elavate kaasasündinud immuunefektorrakkudena. Krooniline stress kutsub esile astrotsüütide kaotuse või funktsionaalse ebakompetentsuse koos mikrogliia patoloogilise hüperaktivatsiooniga. Meie immunohistokeemia andmed näitasid, et CPhG-ravi suurendas GFAP-positiivsete astrotsüütide tihedust, samal ajal alandas Iba-1-ga tähistatud üleaktiveeritud mikrogliia kogust hipokampuses. See gliiarakkude fenotüüpi reguleeriv omadus võib osaliselt olla aluseks CPhG-de neuroprotektiivsele ja depressioonivastasele farmakoloogilisele toimele.

NLRP3 põletik esindab elutähtsat molekulaarset platvormi, mis vahendab neuro-põletikulist kaskaadi. Selle aktiveerimine viib allavoolu IL-1 ja IL-18 põletikueelsete tsütokiinide küpsemisele ja sekretsioonile. TLR4/NF-κB signaali telg toimib NLRP3 põletikulise aktiveerimise jaoks olulise ülesvoolu käivitava signaalina. TLR4 retseptori stimuleerimine soodustab NF-κB subühikute fosforüülimist ja tuuma translokatsiooni, lisaks transaktiveerib NLRP3, pro-IL-1 geeni transkriptsiooni. Meie praeguses uuringus vallandas CUMS-i stress samaaegselt TLR4, fosforüülitud NF-κB p65, NLRP3 ja Caspase-1 valgu ekspressiooni. CPhG-de sekkumine pärssis selgelt kogu selle signaalikaskaadi aktiveerimist. Seetõttu järeldame, et CPhG-d leevendavad osaliselt neuro-põletikulisi vigastusi, piirates TLR4 / NF-κB-vahendatud NLRP3 põletikulist aktivatsiooni.

Kokkuvõttes toetavad meie loommudeli eksperimentaalsed tõendid mehhaanilist mudelit: CPhG-d tekitavad CUMS-i indutseeritud depressiivsetel hiirtel antidepressandilaadseid toimeid kahe peamise mõõtme kaudu: (1) meeleoluga seotud monoamiini neurotransmitterite (5-HT, DA) homöostaasi taastamine; (2) hipokampuse gliiarakkude homöostaasi moduleerimine ja TLR4 / NF-κB juhitud NLRP3 põletikust sõltuva neuro-põletikulise patoloogilise kaskaadi pärssimine.

Selle uurimise mitmed piirangud väärivad tähelepanu. See töö rakendas ainult loomkatseid in vivo. Me ei ole läbi viinud rakutasandi mehhaanilist valideerimist ega inimeste kliinilisi uuringuid. Seetõttu peaks translatsiooniline järeldus inimese depressiooniravi kohta jääma ettevaatlikuks. Lisaks ei lahkanud see uuring üksikute monomeerühendite (ehhinakosiid, verbaskosiid) panust segatud CPhG-de ekstraktis. Tulevased uuringud võivad keskenduda rakukultuuri mehaanilisele kontrollimisele, üksikute komponentide aktiivsuse võrdlusele, aga ka esialgsele inimese ja subjekti pilootvaatlusele.

5. Järeldus

Cistanche fenüületanoolglükosiidid (CPhG-d) tekitavad C57BL/6 hiirtel märkimisväärseid antidepressandilaadseid farmakoloogilisi toimeid krooniliste ettearvamatute kerge stressi põhjustatud depressioonitaoliste käitumuslike fenotüüpide vastu. Selle terapeutilised mehhanismid on seotud seerumi ja hipokampuse serotoniini ja dopamiini neurotransmitterite taseme taastumisega, hipokampuse neuronaalse struktuuri terviklikkuse säilitamisega, astrotsüütide-mikroglia funktsionaalse tasakaalu moduleerimisega, samuti TLR4 / NF-κB / NLRP3 põletikulise põletikulise kakaadi-vahendatud neurotransmitterite pärssimisega. See prekliiniline loomuuring annab eksperimentaalse võrdlusaluse CPhG-de edasiseks arendamiseks loodusliku terapeutilise abiaine või funktsionaalse toidu koostisosana, mis on suunatud depressiivsete sümptomite paranemisele.

Viited

Ren L, Shao YT, Qin SH. Uuring eesmärgi tuvastamise ja saponiin A mõju kohta depressiivsele häirele. Nat Prod Res Dev, 2024, 36:44–51.

Fan L, Peng Y, Wang JW jt. Cistanche tubulosa tüvedest pärinevad glükosiidid leevendavad depressioonitaolist käitumist: fütokemikaalide ja soolestiku mikrobiota kahesuunaline koostoime. Fütomeditsiin, 2021, 83:153471.

Fan L, Peng Y, Chen XN jt. Fütokeemilise koostise, farmakokineetika ja võrgufarmakoloogia integreeritud analüüs, et tuvastada Cistanche deserticola ja C. tubulosa tüvede erinevusi antidepressandi toime põhjal. Food & Function, 2022, 13:8542-8557.

Yirmiya R, Rimmerman N, Reshef R. Depressioon kui mikrogliia haigus. Trends in Neurosciences, 2015, 38:637-658.

Jia XN, Gao ZH, Hu HL. Microglia depressioonis: praegused perspektiivid. Science China–Life Sciences, 2021, 64:911–925.

Wu B, Gan AN, Wang RX jt. Alpinia oxyphylla Miq. lenduv õli leevendab depressiivset käitumist ja pärsib neuropõletikku CUMS-iga kokkupuutunud hiirtel, pärssides TLR4-vahendatud MyD88 / NF-κB signaaliülekande rada. Journal of Chemical Neuroanatomy, 2023, 130:102270.