Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui‐ying Shi|Ya‐jun Yang|Wei Chen|Lian-feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche on vananemisvastase toimega

Abstraktne

Taust: ajaga seotud taastumisvõime ja elundite homöostaasi langus on selle peamine tunnusjoonvananemine. Rehmannia glutinosa ja Astragalus membranaceus on kasutatud traditsiooniliste Hiina taimsete ravimitena, et tugevdada immuunsust ja pikendada eluiga. Kuid mehhanism, mille abil see taimne ravim aeglustab vananemist, pole teada. Selles uuringus uurisime ravimtaime mehhanismivananemisvastane toime.

Meetodid: Hiiri toideti 10 kuu jooksul R. glutinosa või A. membranaceus'ega täiendatud dieediga; kontrollrühma toideti standardse dieediga. Fenotüüpe hinnati hindamissüsteemi ja ellujäämisanalüüsi abil. Hematopoeetiliste tüvirakkude (HSC) vananemisfenotüüpide protsendid määrati fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimise analüüsiga. HSC-de funktsiooni ja mehhanismi analüüsiti klonogeense testi ja reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooni abil.

Tulemused: Thevananemisvastane toimeR. glutinosa kahjustus on tingitud HSC-de tõhustatud funktsioonist. R. glutinosaga toidetud hiirtel ilmnesid aeglustunud hiirte omadusedvananemineprotsessi, sealhulgas vananemise vähenemine ja suurenenud ellujäämise määr. Voolutsütomeetria analüüs näitas Lin-Sca1 pluss c-kit- (LSK) rakkude, pikaajaliste HSC-de (LT-HSC-d) ja lühiajaliste HSC-de (ST-HSC-de) arvu vähenemist R. glutinosa rühmas. In vitro näitasid klonogeensed testid R. glutinosa rühma LT-HSC-de suurenenud enesereaktsioonivõimet ning LSK rahu säilitamist ülesreguleeritud p18 ekspressiooni kaudu. R. glutinosa rühmas vähenes ka reaktiivsete hapnikuliikide tase ja ‐gal pluss rakkude protsent raku vananemisega seotud valgu p53 ja p16 alareguleerimise tõttu.

Järeldus: Rehmannia glutinosa avaldabVananemisvastanemõju, säilitades HSC-de vaikuse ja vähendades vananemist.

MÄRKSÕNAD: vananemisvastane, vereloome tüvirakud, rahutus, Rehmannia glutinosa

1|SISSEJUHATUS

Vananemist määratletakse kui ajast sõltuvat funktsionaalset langust, mis mõjutab enamikku elusorganisme.1 Organismide pikaealisuse tagavad peamiselt tüvirakud.2 Kudespetsiifilised tüvirakud on võimelised ise uuenema ja diferentseeruvad mitmesugusteks efektorrakkudeks. 3 Vananemisprotsessi käigus see eneseuuendusvõime aga väheneb, mis viib lõpuks vananenud organismide parandamata, kahjustatud kudede kuhjumiseni.4 Kaob võime säilitada tasakaal vaikse ja diferentseerumise vahel tüvi-/eellasrakus. Sektsioon võib põhjustada surma või vanusega seotud haigusi.2 Lisaks näitavad hiljutised uuringud, et tüvirakkude noorendamine võib vananemisfenotüübi ümber pöörata.5,6 Hematopoeetilises süsteemis vastutavad vereloome tüvirakud (HSC-d) vererakkude tootmise eest. Vanemate hiirte vereloomesüsteem näitab T- ja B-lümfoidrakkude kahjustust ning müeloidrakkude arv on suurenenud. Vananenud HSC-d näitasid vähenenud eneseuuendusaktiivsust ja vähenenud vereloome rekonstrueerimisvõimet. Eelkõige ilmnevad vanusega seotud muutused HSC sektsioonis vananevas peremeesorganismis aneemiana, suurenenud kalduvusena müeloproliferatiivsete neoplasmide tekkeks, immuunfunktsiooni languse ja vähi esinemissageduse suurenemisena.{11}} Kuid HSC vananemise mehhanism ja taimsete ravimite mõju HSC vananemisele on teadmata.10

Vananemisprotsessi edasilükkamise ja noorena püsimise pärast on inimesed olnud mures iidsetest aegadest ningVananemisvastaneon praegu uurimistöö fookuses. Traditsiooniline hiina meditsiin on pälvinud üha enam tähelepanu erinevate vananemisega seotud haiguste ravile. Paljud traditsioonilises hiina meditsiinis kasutatavad ravimtaimed avaldavad teadaolevalt positiivset mõju vananemise vastu erinevate mehhanismide kaudu. Rehmannia glutinosa ja Astragalus membranaceus on sel viisil laialdaselt kasutatud tuhandeid aastaid.

Rehmannia glutinosa kasutatakse erinevate diabeetiliste häirete raviks, luude ainevahetuse kiirendamiseks osteoporoosi korral ning maksapõletike ja fibroosi pidurdamiseks. Lisaks on sellel ravimtaimel muid toimeid, sealhulgasväsimuse vastane, antidepressandid ja neuroprotektiivsed omadused. Viimastel aastatel on R. glutinosa ja selle aktiivsete komponentide farmakoloogilised uuringud keskendunud peamiselt selle laiaulatuslikule toimele vere-, endokriin-, südame-veresoonkonna- ja närvisüsteemile.{1}} Seega näidati, et R. glutinosa omab tugevat immuunsüsteemi. ‐täiendustegevus, mis on andnud teoreetilise aluse edasisteks õpinguteks.

Astragalus membranaceusel on toonilised, hepatoprotektiivsed, diureetilised ja rögalahtistavad omadused15 ning on näidatud, et see on immunomoduleeriv,16põletikuvastane,jaantioksüdant17 Traditsiooniliste Hiina ravimite mõju aluseks olevate molekulaarsete mehhanismide selgitamine kliinilises praktikas on oluline samm nende ülemaailmse rakendamise suunas ja see teema pakub praegu intensiivset uurimishuvi.

Seega andsime selles uuringus hiirtele 10 kuud R. glutinosa ja A. membranaceus'e toidulisandit, et uurida mehhanismi, mis on aluseks R. glutinosa võimele pikendada eluiga.

2|MATERJALID JA MEETODID

2.1|Loomade rühmitamine ja ravi

C57BL/6J emaseid hiiri hoiti patogeenivabas keskkonnas ja neid toideti standardse dieediga. Loomade kasutamise selles uuringus kiitsid heaks Peking Unioni meditsiinikolledži laboratoorsete loomade teaduse instituudi loomade hooldamise ja kasutamise komiteed. Hiired (vanuses 10 kuud) jagati juhuslikult kolme rühma (n=20/rühm). Kontrollrühma toideti standardse dieediga (Peking HFK Biosicence, Peking, Hiina). Ülejäänud kahe rühma dieeti täiendati jahvatatud R. glutinosa ja A. membranaceus'ega (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Peking, Hiina) annuses 200 mg/päevas 10 kuu jooksul. See annus valiti kehapinna normaliseerimise meetodil, et kinnitada ravimiannuseid inimuuringutest kuni hiirte uuringuteni. Kehakaal määrati iga 2 kuu järel ja ellujäämist registreeriti iga päev.

2.2|Vananemisastme hindamine

Vananemisastme hindamiseks võeti kasutusele hindamissüsteem vastavalt Takeda jt kriteeriumidele.18 Iga protokollis loetletud kategooria valiti välja vananemisprotsessiga seotud kliiniliste tunnuste hulgast. Iga hiir hinnati 18 kuu vanuselt ja iga kategooria skoor liideti, et määrata üldine hindepunkt.

2,3|Voolutsütomeetria

Rakud koguti harknäärest, põrnast, perifeersest verest (PB) ja luuüdist (BM). Põrn ja harknääre lõigati kohe välja, pesti soolalahusega ja kaaluti. Põrnad ja tüümused homogeniseeriti õrnalt klaashomogenisaatoris ja rakud suspendeeriti steriilses fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS). PB rakke kasutati vere punaliblede lüüsiks (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). BM-i rakud eraldati nii sääreluu kui ka reieluu loputamisega steriilse PBS-iga. Kõik rakud eraldati filtrimisega läbi steriilse nailonvõrgu ja värviti 30 minutit 4 kraadi juures järgmiste fluorofooriga konjugeeritud antikehadega: fükoerütriiniga (PE) konjugeeritud anti-CD3 (G4.18), allofükotsüaniiniga (APC) konjugeeritud anti-CD3. - CD4 (OX35) ja PE-Cy7-konjugeeritud anti-CD8a (OX8). BM-rakkude puhul värviti liini markerid, kasutades biotiiniga konjugeeritud hiirevastaseid CD4 (RM4-5), CD5 (53-7.3), CD8a (53-6.7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), TER119 (TER‐ 119) ja Gr1 (RB6‐8C5), millele järgnes värvimine antikehaga APC-eFluor 780- konjugeeritud streptavidiiniga, saadi samuti ettevõttest eBioscience (San Diego, CA, USA). Pinnavärvimiseks kasutati järgmisi antikehi: APC immunoglobuliin (Ig)M (II/41), fluorestseiini isotiotsüanaat (FITC) IgD (11-26), PE-Cy7 Sca-1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3‐6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP‐Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) ja PerCP‐Cy5.5 CD3e (145‐2C11). Kõik antikehad saadi ettevõttest eBiosciences (San Diego, CA, USA). Andmed kogus FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) ja analüüsiti FlowJo tarkvara abil (Three Star, Ashland, OR, USA).

2.4|Rakutsükli analüüs

Rakutsükli analüüsiks värviti kogu BM-rakud tüvirakkude pinnamarkerite jaoks (Lin-Sca‐1 pluss c‐KitHigh; LSTK-d), seejärel fikseeriti ja permeabiliseeriti (00-5123-43; Becton Dickinson). ) enne FITC Ki-ga värvimist

67 antikeha ja 7-aminoaktinomütsiin D (7-AAD). Andmete kogumine viidi läbi seadmega FACS Aria II (Becton Dickinson). Andmeid analüüsiti FlowJo tarkvara abil.

2,5|Vananemisega seotud ‐gal värvimine

Vananemisega seotud (SA)-gal aktiivsust analüüsiti ka voolutsütomeetria abil, kasutades C12FDG-d, nagu on kirjeldanud tootja (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Lühidalt, tüvirakud värviti esmalt rakupinna markerite jaoks ja seejärel inkubeeriti 100 nmol L-1 bafilomütsiin A1-ga 1 tund 37 kraadi juures, et kutsuda esile lüsosomaalne leelis. Pärast PBS-ga pesemist inkubeeriti rakke 2 mmol L-1 C12FDG-ga 1-2 tundi 37 kraadi juures ja seejärel analüüsiti FACS Aria I (Becton Dickinson) abil.

2,6|Reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) produktsiooni määramine

Rakke inkubeeriti dikloro-dihüdro-fluorestseiindiasetaadiga (DCFH-DA; Beyotime, Shanghai, Hiina) 37 kraadi juures 20 minutit. DCFH-DA difundeerub passiivselt rakkudesse, kus see deatsetüülitakse esteraasidega, moodustades mittefluorestseeruva 2',7'-diklorofluorestseiini (DCFH). Eraldatud fluorestsentsi hulk korreleerub ROS-i kogusega rakus. Andmed koguti seadmega FACS Aria I (Becton Dickinson) ja analüüsiti FlowJo tarkvara abil.

2,7|Reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) analüüs

Kogu RNA ekstraheeriti rakkudest, kasutades TRIzol reagenti (Invitrogen, San Diego, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. Huvipakkuvad geenid amplifitseeriti DNaas I-ga töödeldud kogu-RNA-dest, kasutades M-MLV pöördtranskriptaasi (Promega, Madison, WI, USA)

ja polü-dT praimerid. PCR jaoks kasutatud praimerid olid järgmised: p21 (5'-TCCAGACATTCAGAGCCACA-3' ja 5'-CGAAGAGACAACGG-CACACT-3', Tm=60 kraad, 30 tsüklit), p5'-TCCAGACATTCAGAGCCACA-3' 3′ ja 5′′-TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 kraad, 35 tsüklit), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ ja T 5′‐ {kraad, 5′‐ CGAATCTGCA2} tsüklid), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ ja 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 kraad, 30 tsüklit), p19 (GTTCG‐GTTCG‐ ja GTTCG‐ ja GTTCG‐ ja GTTCG‐ ja GTTCG‐ ja GTTCG′ GTTCG′3GTTG′TTG′TTGTTG ′, Tm=61 kraad, 35 tsüklit), p18 (5'-GGGACCTAGAGCACTTACT-3' ja 5'-TGACAGCAAAAC-CAGTTCCA-3', Tm=61 kraad, fafaate-3glütseraldehüostsükleid 30 dehüdrogenaas (5'-GAGCGAGACCCCACTAACAT-3' ja 5'-TTCACACCCATCACAAACAT-3', Tm=60 kraad, 25 tsüklit). Reaalajas (RT)-PCR viidi läbi, kasutades SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Jaapan) ABI StepOne™ tuvastussüsteemis (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

2,8|Klonogeensed testid

Pikaajalised (LT)-HSC-d sorteeriti fluorestsents-aktiveeritud rakkude sorteerimise (FACS) abil ja seejärel kultiveeriti 96-süvendilistel rakuplaatidel, kasutades metüültselluloosi baasi söödet (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). . Iga proovi jaoks valmistati ette kümme korduvat süvendit. Kasutasime 96 süvendiga rakukultuuri plaati, kolm rakku süvendi kohta. Kaks nädalat pärast külvamist loendati mikroskoobi all kolooniate arv ja suurus.

2,9|Statistiline analüüs

Andmeid analüüsiti ühesuunalise ANOVA abil, kasutades Microsoft Exceli (Microsoft, Redmond, WA, USA) ja GraphPad Prismi (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) tarkvara. Andmed esitati kui keskmine ± SD. P < 0,05="" loeti="" statistiliseks="">

3|TULEMUSED

3.1|R. glutinosa ja A. membranaceus avaldasid vananemisvastast toimet

Et kinnitadavananemisvastane toimeR. glutinosa ja A. membranaceus'e puhul uurisime toidulisandina (200 mg/päevas) manustamise mõju. Seejärel registreerisime hiirte kehakaalu, vananemisastme ja ellujäämismäära. R. glutinosa või A. membranaceus'ega toitunud hiirte kehakaal oli kontrollrühma omadega võrreldes normaalne, kuigi 20 kuu pärast esines R. glutinosa ja A. membranaceus'e rühma kehamassi langus (joonis 1A). Vananemisastme analüüs näitas R. glutinosa ja A. membranaceus'e rühmades vanuse suurenedes pidevat ja pöördumatut hindamisskoori tõusu kontrollrühmaga võrreldes, kuigi tõus oli märgatavam A. membranaceus'e puhul. rühm (joonis 1B). Kõrge hinde skoor oli tingitud passiivsuse ja reaktsioonivõime varasemast kadumisest, naha läike kadumisest ja suurenenud karedusest, juuste väljalangemisest, perioftalmilistest kahjustustest, lülisamba suurenenud lordoküfoosist ja nende raskuse märgatavamast suurenemisest.18 Hiired A-s membranaceus hiirte rühmal ilmnesid märgatavamad vananemisfenotüübi omadused, sealhulgas naha läike kadu ja juuste väljalangemine. Elulemuskõverad näitasid, et hiirte eluiga R. glutinosa ja A. membranaceus rühmades oli veidi pikem kui kontrollrühmas (joonis 1C). Need andmed kinnitasidvananemisvastane toimenii R. glutinosa kui ka A. membranaceus, kuigi leiti, et R. glutinosa on tõhusam vananemisprotsessi aeglustamisel.

JOONIS 1 Rehmannia glutinosa ja Astragalus membranaceus olidvananemisvastane toime. Hiirtele anti toitu, millele oli lisatud jahvatatud R. glutinosa või A. membranaceus (200 mg/päevas); kontrollrühma toideti standardse dieediga. A, muutused hiirte kehakaalus, mõõdetuna iga 2 kuu järel. B, muutused hiirte vananemishinnangus vanusega. C, ellujäämiskõverad. Andmed esindavad keskmist ± SD; n=20 hiirt/rühm. Andmed esindavad keskmist ± SD; n=5 hiirt rühmas.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa vähendas hematopoeetiliste tüvirakkude arvu

Arvatakse, et tüvirakkude kurnatus on mitut tüüpi vananemisega seotud kahjustuste integreeriv tagajärg ning kudede ja organismide vananemise üks peamisi põhjusi.1 Hiljutised uuringud näitavad, et tüvirakkude noorendamine võib muuta vananemisfenotüübi organismi tasandil.5 oletas, etvananemisvastane toimeR. glutinosa poolt vahendatud tüvirakkude funktsiooni parandamine. Seetõttu teostasime 10 kuu jooksul R. glutinosa või A. membranaceus'ega (200 mg/päevas) täiendatud hiirtelt (vanuses 20 kuud) eraldatud hematopoeetiliste tüvi-/eellasrakkude arvu voolutsütomeetrilise analüüsi (joonis 2A). . LSK-de protsent vähenes R. glutinosa ja A. membranaceus'e rühmades (joonis 2B). LT- ja lühiajaliste (ST)-HSC-de arv vähenes R. glutinosa rühmas ligikaudu kaks korda võrreldes kontrollrühmaga (joonis 2C-D). R. glutinosa rühmas tuvastati suurem arv tavalisi lümfoidseid eellasrakke (CLP-sid) võrreldes kontrollrühmaga (joonis 2I). R. glutinosa rühmas ei esinenud erinevusi multipotentsete eellaste (MPP), tavaliste müeloidsete eellaste (CMP), granulotsüütide-makrofaagi eellaste (GMP) ja megakarüotsüütide-erütroidsete eellaste (MEP) arvus võrreldes nende arvuga R. glutinosa rühmas. kontrollrühm. A. membranaceus'e rühmas ei olnud LT‐ ja ST‐ HSCde arvus olulist erinevust kontrollrühma arvuga võrreldes (joonis 2C‐ D). Lisaks ei erinenud MPP, CMP, MEP ja CLP rakkude arv võrreldes kontrollrühma arvuga (joonis 2E, 2F, 2H ja 2I); GMPde arv aga vähenes A. membranaceus'e rühmas. Seega ilmnes R. glutinosa-ga täiendatud dieediga hiirtel vereloome tüvi- ja eellasrakkude arvu vähenemine.

3,3|R. glutinosa parandas HSC-de funktsiooni ja säilitas vaikse

HSC-de funktsiooni hindamiseks uuriti LT-HSC-de klonogeenset potentsiaali in vitro. Sorteerisime LT-HSC rakud FACS-i abil metüültselluloosi baasil söötmesse ja loendasime kolooniate arvu ja suuruse 14 päeva pärast. Võrreldes kontrollrühma hiirte rakkude poolt toodetud kolooniate arvu ja suurusega, ilmnes R. glutinosa rühma hiirte rakkudes kolooniate arvu suurenemine, eriti väikese suurusega (P=0.0241). ) ja suure suurusega kloon (P=0.0418), samas kui A. membranaceuse rühma hiirte arv ei erinenud (joonis 3). Suurenenud kolooniate suurus ja arv R. glutinosa rühmas viitas sellele, et see ravimtaim suurendab LT-HSC-de iseenesliku uuenemise potentsiaali.

Enamik täiskasvanud hiirte HSC-sid jäävad vaiksele;19 seetõttu on rakkude vaikuse säilitamine tüvirakkude iseenesliku uuenemise oluline mehhanism.20,21 Täheldatud HSC-de vähenemine viitab rakkude proliferatsiooni vähenemisele R. glutinosa ja A. membranaceus rühmad; seetõttu uurisime HSC-de rakutsükli staatust proliferatiivse rakumarkeri Ki-67 analüüsiga koos DNA sisalduse 7-AAD määramisega LSK populatsioonis. Me täheldasime R. glutinosa ja A. membranaceuse rühmades LSK rakkude arvu suurenemist G0 faasis võrreldes kontrollrühmaga (joonis 4A). Need tulemused näitasid, et R. glutinosa ja A. membranaceus säilitasid HSC-de vaikuse.

LSK rakkude rakutsükli regulaatorite reaalajas PCR analüüs näitas, et p18, p19 ja p57 mängisid olulist rolli HSC vaikuse säilitamisel.{4}} P57 ja p19 puhul ei täheldatud ilmseid muutusi (joonis 4C‐ D) ja p18 oli R. glutinosa rühmas ülereguleeritud võrreldes kontrollrühma omaga ja veidi ülesreguleeritud A. membranaceuse rühmas (joonis 4B).

JOONIS 2 Rehmannia glutinosa ja Astragalus membranaceus mõjutasid hematopoeetiliste tüvi-/eellasrakkude arvu. Hiired (vanuses

20 kuud) toideti dieeti, millele oli lisatud R. glutinosa või A. membranaceus (200 mg/päevas) 10 kuu jooksul (n=5/rühm); kontrollrühma toideti standardse dieediga. Värskelt eraldatud luuüdi (BM) rakud värviti näidatud antikehadega ja analüüsiti voolutsütomeetria abil. A, BM hematopoeetiliste tüvirakkude ja eellasrakkude populatsioonide tüüpilised värvimisprofiilid. B, Lin-Sca1 pluss c-kit-rakkude (LSK-de) protsent BM-rakkudes. C‐ I, (C) pikaajaliste rakkude arvud (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus – , Flt3–); D, lühiajaline (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus plus , Flt3–); E, multipotentne eellane (MPP; Lin– ​​, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit plus , Flt3 plus ); F, tavaline müeloidne eellane (CMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/ CD32–); G, granulotsüütide-makrofaagide eellane (GMP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34 plus, CD16/CD32 plus); H, megakarüotsüüt-erütroidne eellane (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34–, CD16/CD32–); ja I, tavaline lümfoidne eellane (CLP; Lin–, Sca‐1low, c‐ Kitlow, CD127 plus). Andmed esindavad keskmist ± SD; n=5 hiirt/rühm. *P < 0,05,="" **p=""><>

3,4|R. glutinosa aeglustas HSC-de vananemist

Pikaajaline toidulisandina R. glutinosa kasutamine võib pikendada hiirte eluiga. Rakkude vananemine suureneb koos vanusega; seetõttu uurisime HSC vananemist vananevatel hiirtel SA‐gal-ga värvitud HSC-de voolutsütomeetrilise analüüsiga, kasutades fluorestseeruvat-gal substraati (C12FDG).25 SA‐gal-positiivsete rakkude protsent vähenes. R. glutinosa rühma, mis näitab, et R. glutinosa aeglustab LSK rakkude vananemist (joonis 5A).

Reaktiivsed hapniku liigid mängivad HSC vananemises suurt rolli ja HSC rahuoleku kadumine on sageli korrelatsioonis suurenenud rakulise ROS-iga.26 Rakusisese ROS-i analüüs LSK-des näitas, et R. glutinosa rühmas olid tasemed langenud võrreldes kontrollrühma omadega. rühm (joonis 5B). Need andmed näitasid, et R. glutinosa võib säilitada HSC rahu ja parandada HSC funktsiooni, vähendades ROS taset.

Seejärel uurisime LSK rakkude RT-PCR analüüsi abil mitmete rakkude vananemisega seotud geenide ekspressiooni. Võrreldes

JOONIS 3 Vereloome tüvirakkude funktsioon, mida parandab toidulisandiga Rehmannia glutinosa. Hiirte (n=3) pikaajaliste maksa tähtrakkude in vitro klonogeenne potentsiaal

kontrollrühmaga oli rakkude vananemisega seotud valkude p53 ja p16 ekspressioon R. glutinosa rühmas allareguleeritud (joonis 5D-E). Kuid p53 ja p16 ekspressioon ei olnud A. membranaceus'e rühma ja kontrollrühma vahel oluliselt alla reguleeritud (joonis 5D-E). Kokkuvõttes näitavad need andmed, et mitmed võtmetähtsusega rakutsükli ja raku vananemisega seotud geenid reguleerivad HSC-de funktsiooni hiirtel, keda toidetakse R. glutinosaga täiendatud dieedil.

3,5|R. glutinosa tugevdas B-raku immuunsust

B- ja T-lümfotsüüdid on mõlemad immunoloogiliste reaktsioonide jaoks olulised. T-lümfotsüüdid mängivad olulist rolli rakulises immuunsuses ja selle regulatsioonis, samas kui B-lümfotsüüdid osalevad peamiselt humoraalses immuunsuses. Lümfotsüütide proliferatsioon on kõige vahetum indeks, mis peegeldab orgaanilist immuunsust. Immunoloogilise võimenduse rolli uurimiseks uuriti R. glutinosa ja A. membranaceuse mõju lümfotsüütide proliferatsioonile.

R. glutinosa rühma hiirtel vähenes HSC-de arv ja suurenes CLP-de arv. Voolutsütomeetriline analüüs näitas küpsete B-rakkude (B220 pluss) arvu suurenemist R. glutinosa rühma hiirte PB-s, BM-is ja põrnas võrreldes kontrollrühmas tuvastatud arvuga (joonis 6A); Siiski ei olnud kahe rühma vahel olulisi erinevusi T-rakkude (CD4 pluss ja CD8 plus), monotsüütide ja granulotsüütide (CD11b pluss) arvus (joonis 6B-D). Seega näitavad need tulemused, et toidust saadav R. glutinosa suurendab B-raku immuunsust.

JOONIS 4 Rehmannia glutinosa ja Astragalus membranaceus'e toidulisandid säilitasid hematopoeetiliste tüvirakkude rahu. A, rakkude protsent rakutsükli igas faasis. 7-aminoaktinomütsiin D (7-AAD) ja Lin-Sca1 pluss c-kit-rakkude (LSK-de) värvimise Ki-67 voolutsütomeetriline analüüs. B, sorteeritud LSK raku geeniekspressiooni reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooni analüüs; Normaliseerimiseks kasutati GAPDH-d. Andmed esindavad kolme katse keskmist ± SD. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

JOONIS 5 Rehmannia glutinosa toidulisand vähendas maksa tähtrakkude (HSC) vananemist. Hiirtele (vanuses 20 kuud) toideti toitu, millele oli lisatud Rehmannia glutinosa või Astragalus membranaceus (200 mg/d) 10 kuud (n {{4). }}/Grupp); kontrollrühma toideti standardse dieediga. A, SA-gal-positiivsete rakkude Lin-Sca1 pluss c-kit- (LSK) voolutsütomeetriline analüüs, kasutades fluorestseeruvat galaktosidaasi substraati (C12FDG). B, reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) positiivsete rakkude protsent LSK-des. ROS-positiivsete LSK-de voolutsütomeetriline analüüs. Andmed esindavad keskmist ± standardhälvet (SD). *P < 0,05,="" ***p="">< 0,001.="" c,="" raku="" vananemisega="" seotud="" geenide="" ekspressioonimuster="" lsk-des;="" normaliseerimiseks="" kasutati="" gapdh-d.="" andmed="" esindavad="" kolme="" katse="" keskmist="" ±="" sd.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

4|ARUTELU

Selles uuringus uurisime selle mehhanismivananemisvastane toimeR. glutinosa või A. membranaceus'e vastu, täiendades hiirte dieeti ravimtaimedega annuses 200 mg/päevas 10 kuu jooksul. Leiti, et R. glutinosa avaldab vananemisvastast toimet, sealhulgas vähenenud vananemist ja suurenenud HSC-de ellujäämist, samuti

tugevdatud B-rakkude immuunsus. Mis puutub mehhanismivananemisvastane toime, leidsime, et R. glutinosa vähendas HSCde arvu, samas kui proliferatsioonivõime suurenes. Veelgi enam, R. glutinosa säilitas HSC rahuoleku ja vähendas SA-gal-positiivsete rakkude arvu ja ROS-i taset p18, p53 ja p16 reguleerimise kaudu. Üheskoos kinnitasid meie tulemused, etvananemisvastane toimeR. glutinosa't hiirtel ravitakse rahuoleku säilitamise ja HSC-de funktsiooni tugevdamisega.

Rehmannia glutinosa, mida on tuhandeid aastaid kasutatud traditsioonilise Hiina taimravimina, saab kasutada hüpoglükeemia raviks mitmesuguste diabeetiliste häirete korral.27,28 Samuti on teatatud, et R. glutinosa ekstrakt suurendab luu ainevahetust.29 Lisaks, R. glutinosa inhibeerib põletikulisi reaktsioone ja sündroome30,31 ning kaitseb rakukahjustuste eest, püüdes vabu radikaale.14,32 Selles uuringus avastasime, et hiirte toidulisandina R. glutinosa.vananemisvastane toimeja tugevdatud B-rakkude immuunsus, suurendades LT-HSC-de proliferatsioonivõimet ja vähendades SA-gal-positiivsete rakkude arvu ja ROS-i taset.

On leitud, et mitmesuguste rakkude ja kudede oksüdatiivse kahjustuse määr suureneb koos vanusega. Oksüdatiivne stress on HSC eneseuuendamise kriitiline määraja. LT-HSC vaikse kadumine korreleerub sageli suurenenud raku ROS-iga, mis on negatiivselt seotud HSC-de iseenesliku uuenemisega.26 Catalpol on iridoidglükosiid, mida on leitud R. glutinosa juurtest. Eelmises uuringus näitas Catalpol oksüdatiivse stressi, DNA kahjustuste ja telomeeride lühenemise pärssimist PGC‐1/TERT raja kaudu.33 Meie uuringus oli ROS-i tase R. glutinosa rühma LSK rakkudes kontrollrühmaga võrreldes langenud. Seega pikendab R. glutinosa hiirte ellujäämist, pärssides HSC-de oksüdatiivset stressi.

JOONIS 6 Küpsete immuunrakkude protsendi voolutsütomeetriline analüüs perifeerses veres (PB), luuüdis (BM), põrnas ja harknääres. Hiirtele (vanuses 20 kuud) lisati Rehmannia glutinosa või Astragalus membranaceus'e (200 mg/päevas) dieeti 10 kuud (n=5/rühm); kontrollrühma toideti standardse dieediga. A, B-rakkude (B220 pluss) protsendi voolutsütomeetriline analüüs PB-s, BM-is ja põrnas. B, Monotsüütide ja granulotsüütide rakkude (CD11b pluss) protsendi voolutsütomeetriline analüüs PB-s ja BM-is. C ja D, voolutsütomeetriline analüüs CD4 pluss ja CD8 pluss rakkude protsendi kohta PB-s, põrnas ja harknääres. Andmed esindavad keskmist ± SD. *P <>

Astragalus membranaceust kasutatakse ka traditsioonilises hiina meditsiinis immuunsuse edendamiseks, veresuhkru vähendamiseks ja kasvajarakkude apoptoosi soodustamiseks ning sellel on kaantioksüdatsioonjaVananemisvastaneomadused. Selles uuringus avastasime, et A. memranaceus'e lisamisel 10 kuu jooksul ei olnud kontrollhiirtel täheldatuga võrreldes ilmseid mõjusid, samas kui hiirte kaal vähenes 20 kuu pärast. Seetõttu võib A. membranaceus olla sobimatu toidetud hiirte LT-raviks.

Kokkuvõtteks näitavad meie tulemused, et R. glutinosa võib pikendada hiirte eluiga, säilitades rahu ja parandades HSC-de funktsiooni. Lisaks võib R. glutinosa vähendada ROS-i rakkudevahelist taset ja SA-gal-positiivsete rakkude arvu ning tugevdada B-raku immuunsust.

TUNNUSTUS

Seda uuringut toetasid osaliselt Hiina riiklik teadusfond (31672374), CAMSi meditsiiniteaduste innovatsioonifond (CIFMS) (2016-12M-1-012) ja PUMC noortefond (2017310018).

HUVIDE KONFLIKTID

Mitte ühtegi.

AUTORI KAASALAD

Kõik loetletud autorid vastavad autorsuse nõuetele. CQ ja LFZ kavandasid ja kavandasid katsed. LB viis läbi katsed ja kirjutas peamise käsikirja testi. GYS teostas ja analüüsis FACSi andmeid. YJY kavandas Hiina traditsioonilise meditsiini eksperimendi. WC juhtis hiiri. Kõik autorid on käsikirja läbi lugenud ja heaks kiitnud.