Cistanche Tubulosa kuue efektiivse komponendi kiire üheaegne määramine lähiinfrapuna spektroskoopia abil

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Xinhong Wang, Xiaoguang Wang ja Yuhai Guo

Abstraktne:

Mitme tõhusa komponendi kvantitatiivne määramine antud taimes nõuab tavaliselt väga suurt hulka autentseid loodustooteid. Selles uuringus pakkusime välja kiire ja mittepurustava meetodi ehhinakosiidi, verbaskosiidi, mannitooli, sahharoosi, glükoosi ja fruktoosi samaaegseks määramiseksCistanche tubulosalähi-infrapunaspektroskoopia (NIRS) abil. 116 Cistanche tubulosa proovipartiiga viidi läbi lähi-infrapuna-hajutatud peegeldusspektroskoopia (DRS) ja kõrgjõudlusega vedelikkromatograafia (HPLC). DRS-i andmeid töödeldi standardse normaalvariandi (SNV) ja multiplikatiivse hajumise korrigeerimise (MSC) meetoditega. Cistanche tubulosa huvipakkuvate komponentide kalibreerimismudelite koostamiseks kasutati osalist vähimruutude regressiooni (PLSR). Seejärel hinnati kõiki mudeleid kalibreerimise ruutkeskmise vea (RMSEC) ja kalibreerimiskorrelatsioonikordaja (r) arvutamise teel. Kõigi kuue kalibreerimismudeli r väärtused määrati suuremaks kui 0,94, mis viitab sellele, et iga mudel on usaldusväärne. Seetõttu saab selles uuringus esitatud kvantitatiivseid NIR-mudeleid kvalifitseerida kuue ravimikomponendi sisalduse täpseks kvantifitseerimiseks.Cistanche tubulosa.

Märksõnad: Cistanche tubulosa; kõrgsurvevedelikkromatograafia; lähiinfrapuna spektroskoopia; osalised vähimruudud

Sissejuhatus

Cistanche(Hoffmg. Et Link) on mitmeaastane fanerogaamiline perekond Orobanchaceae taimede perekonnast. Enamikku Cistanche perekonda kuuluvaid liike on Hiinas kasutatud ravimtaimena aastatuhandeid; omama suurepärase tooniku mainet; ja neid tuntakse kui "kõrbete ženšenni" [1,2].Cistanche tubulosaon mitmeaastase taime Tamarix Chinensis juurte kohustuslik parasiit. See on Hiina farmakopöas dokumenteeritud kui 2005. aasta väljaande Cistanches Herba (hiina nimi: Roucongrong) autentne allikas [3]. Kaasaegsed farmakoloogilised uuringud Cistanche liikide kohta algatati 1980. aastatel [4]. Farmakoloogilised uuringud näitasid, et Cistanche taimede ekstraktidel on lai toimespekter, näiteks neerupuudulikkuse ja seniilse kõhukinnisuse ravimine, õppimis- ja meeldejätmisvõime parandamine, Alzheimeri tõve vastu võitlemine, immuunsuse tugevdamine, vananemisvastane, väsimusevastane toime jne. [1,5–7]. Viimase kolme aastakümne jooksul on põhjalikud ja süstemaatilised farmakoloogilised uuringud kombineeritud fütokeemiliste uuringutega, et valgustada Cistanche taimede juurte kasulike mõjude materiaalset alust. Need uuringud näitavad, et fenüületanoidglükosiidid (PhG-d) olid Cistanche taimede peamised tõhusad komponendid, mis mängisid võtmerolli neerupuudulikkuse, impotentsuse [8], vananemisvastase [9] ja Alzheimeri tõve ravis [10]. Hiina farmakopöas nõuti kahe PhG (ehhinakosiidi ja verbaskosiidi) sisu. Samal ajal on Cistanche taimede süsivesikutel, nagu mannitool, sahharoos, glükoos ja fruktoos, lahtistav funktsioon ning Cistanche taimede süsivesikute klastreid on kasutatud kõhukinnisuse raviks [11].

Looduslikud ressursidCistanche tubulosaon levinud peamiselt Taklamakani kõrbe ümbritsevas piirkonnas Xinjiangi autonoomse piirkonna lõunaosas Hiinas. Sarnaselt paljudele teistele traditsiooniliste hiina ravimitena kasutatavatele liikidele on C. tubulosa suure majandusliku väärtusega ja oma looduslikus elupaigas liigkogumise tõttu peaaegu välja surnud. C. tubulosa kasvatamist alustati 1990. aastatel Hiinas, et tagada Cistanches Herba toorainega varustamine ning kaitsta looduslikke taimeressursse. Xinjiangi Hotani prefektuuris on 2017. aasta seisuga ligi 13 tuhat ha kultiveeritud C. tubulosa't [12,13]. Nõutud on istutustehnoloogia edusammud nii kasvatamise laiendamiseks kui ka kvaliteedi parandamiseksCistanche tubulosa.

Kasvatamise esmane eesmärkCistanche tubulosaon toota Cistanches Herba, mis on rikas nende tõhusate komponentide poolest. Kuid Cistanches Herba tõhusate komponentide, nagu PhG-d ja oligosahhariidid, sisaldust võivad tootmise ajal oluliselt mõjutada paljud tegurid [12,13]. Tuleks uurida C. tubulosa kvaliteedi reaalajas tuvastamise süsteemi. Seetõttu on vaja välja töötada suure läbilaskevõimega meetod, et täita täielikult suure hulga proovide analüüsimise nõue lühikese aja jooksul. Traditsiooniliselt saavutati nende esmaste tõhusate komponentide, nagu PhG-d ja süsivesikud, määramine C. tubulosa puhul tavaliselt kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil [14,15]. Kuigi see on täpne ja usaldusväärne, on andmete kogumine ja töötlemine aeganõudev ja töömahukas. Lisaks nõuab palju aega ja vaeva ka proovide ettevalmistamiseks, mis tavaliselt hõlmab HPLC analüüside peenestamist, ekstraheerimist ja filtreerimist. Seetõttu on suhteliselt suure andmehulga saamiseks vaja selget põhimõtet ja lihtsalt kasutatavat tööriista. Õnneks on lähiinfrapunaspektroskoopiat (NIRS) laialdaselt kasutatud põllumajandussaaduste [16], toidu [17], meditsiiniliste proovide [18] ja farmaatsiatoodete [19] hindamiseks, kuna see on nii kiire kui ka mittepurustav. Seetõttu võib NIRS täpselt vastata TCM-ide tõhusa mõõtmise nõuetele ja pole üllatav, et NIRS-i on kasutatud TCM-ides kvalitatiivseks identifitseerimiseks [20, 21] ja ühendite [22] kvantifitseerimiseks.

Selles uuringus määrati esmalt HPLC abil kuue tõhusa komponendi, sealhulgas ehhinakosiidi, verbaskosiidi, mannitooli, sahharoosi, glükoosi ja fruktoosi sisaldus 116 C. tubulosa proovipartiis, mis koguti Xinjiangi Hotani prefektuurist aastatel 2013–2015. Seejärel loodi nende kuue komponendi kalibreerimismudelid osalise vähimruutude regressiooni (PLSR) meetodil. Seejärel kinnitati need mudelid kalibreerimiskomplektide korrelatsioonikoefitsiendi ja ennustusvigadega. Tulemused näitasid, et väljatöötatud meetodit saab kasutada usaldusväärse meetodina C. tubulosa kvantitatiivseks analüüsiks.

Tulemus

HPLC analüüs

Ehhinakosiidi ja verbaskosiidi sisaldus määrati kirjanduses täpselt määratletud HPLC-UV meetodil [3,23] ja neli süsivesikuid (mannitool, sahharoos, glükoos ja fruktoos) määrati täpselt määratletud HPLC-ELSD meetodil aastal. kirjandus [24] kõigi 116 proovi kohta. Proovide ettevalmistamise ja määramise meetodeid kirjeldati punktides 3.1 ja 3.3. Joonisel 1 on kujutatud segastandardite iseloomulikud kromatogrammid. On näha, et kõik kuus tõhusat komponenti olid algtasemel eraldatud ja seetõttu saab neid kvantifitseerida. HPLC meetod valideeriti enne proovide testimist. HPLC meetodi peamised tulemused on toodud tabelis 1. Tulemustes on näidatud ehhinakosiidi määramismeetodi soodne lineaarne seos (r=0.9998) ja saagis (98,5 protsenti ), sama tulemus kui kõigi viis komponenti. Seetõttu saab kuue tõhusa komponendi sisaldust täpselt määrata. Kõik määratud sisuvahemikud on kokku võetud tabelis 1.

NIRS-i analüüs

Joonisel 2 on näidatud C. tubulosa proovide NIR-spektrid (4000–10,000 cm-1 ). Märkimisväärsed neeldumispiigid ilmnesid kõigis proovides vahemikus 4000 cm-1 kuni 7500 cm-1, samas kui õrnad kõikumised ilmnesid vahemikus 7500 cm-1 kuni 10 000 cm-1. NIR-spektrite algtaseme triiv tekkis, kuna proovi mõjutasid kergesti sellised tegurid nagu osakeste suurus ja värvus (joonis 2A). Ebavajaliku teabe mõju teatud määral vähendamiseks kasutati spektrite matemaatilist eeltöötlust. Matemaatilised eeltöötlused hõlmasid esimest tuletamist (1. tuletus), teist tuletamist (2. tuletamist), standardset normaalvarianti (SNV) ja multiplikatiivset hajumise korrigeerimist (MSC). Joonisel 2B on kujutatud C. tubulosa NIR-spektrite teine ​​tuletus ja ilmselgelt on täheldatud olulisi erinevusi, mis ilmnesid kolmes piirkonnas, 4000–4500 cm–1, 5000–5500 cm–1 ja 7000–7500 cm–1. .

Kvantitatiivsete kalibreerimismudelite loomine

Osaline vähimruutude regressioon (PLSR) on klassikaline modelleerimismeetod ja seda on tulemuste kõrge kvaliteedi tõttu laialdaselt kasutatud kvantitatiivsetes mudelites. PLSR-i eelised hõlmavad selle head prognoosimisvõimet ja suhtelist lihtsust. PLSR-i on laialdaselt kasutatud ka TCM-ide kvantitatiivsete kalibreerimismudelite loomisel [25]. Eeltöödeldud NIR-spektrite ja C. tubulosa kuue efektiivse komponendi NIR-i kvantitatiivse analüüsi mudeli põhjal loodi PLSR-meetodit kasutades HPLC analüüsi andmeid tegelike väärtustena. 116 proovi jagati juhuslikult kalibreerimis- ja valideerimiskomplektideks suhtega 3:1. Kalibreerimiseks valiti sobivaimad tingimused madala RMSEC-i ja kõrge korrelatsioonikoefitsiendiga.

Kalibreerimismudelite laineriba valik

Sobiva laineriba valimine oli oluline samm kalibreerimismudelite ehitamisel. Selles uuringus võrreldi NIR-intervalli spektreid 4000–7500 cm-1 (soovitab TQ analüütiku tarkvara) ja 4000–10 000 cm-1. Täheldati, et see vahemik ei sobinud kalibreerimiseks intervalliga 4000 cm-1 ja 7500 cm-1 tabelist 2. Seetõttu olid käesolevas uuringus kuue keemilise koostisosa spektrivahemikud. kõik on valitud vahemikust 4000 kuni 10 000 cm{15}}, võrreldes RMSEC-i ja korrelatsioonikoefitsiendi toimivust.

Kalibreerimismudelite optimaalse arvu tegurite valik

PLSR selgitab andmete maksimaalset varieeruvust, vähendades spektriandmete mõõtmelisust tegurite arvutamisega. "Alafitseerimise" probleem ilmnes ebapiisava teabe tõttu, mis tulenes piiratud arvust teguritest; mudelis toodud optimaalsetest väärtustest suuremate tegurite valimine toob aga kaasa "ülepaigutamise" probleemi. Kas "ala- või ülepaigutamine" vähendab väljakujunenud mudelite ennustusvõimet [22]. Joonisel 3 on näidatud seos RMSECV ja tegurite vahel kõigi kuue ühendi puhul. Seetõttu valisime need tegurid, mis vastavad RMSECV madalaimatele väärtustele. Kalibreerimismudelite tegurite optimaalne valik on loetletud tabelis 3.

Kalibreerimismudelite spektraalse eeltöötluse valik

Teine kalibreerimismudelite kõige kriitilisem mõjutegur on spektraalne eeltöötlus, mille eesmärk on vähendada hajumise ja baasjoone triivi mõju, suurendada signaali-müra suhet ja kõrvaldada ebaregulaarsed kõikumised. Tavapäraselt kiirguse hajumise mõju kõrvaldamiseks kasutati multiplikatiivset hajumise korrektsiooni (MSC) ja standardset normaalvariatsiooni (SNV) meetodeid. Baasjoone triivi mõjude lahendamiseks võrreldi 1. ja 2. tuletisspektrit ning valiti 2. tuletus [26]. Soovitud efekti saavutamiseks silusime spektrid Savitzky-Golay (SG) filtri algoritmiga enne tuletamist, et vältida müra suurenemist. Tabelis 3 on esitatud teave spektraalse eeltöötluse kohta ja selle tulemused kalibreerimismudelite jaoks.

Väljakujunenud mudelite hindamine

Heal NIRS-i kalibreerimismudelil peaksid olema madalad RMSEC- ja RMSEP-väärtused, samuti kõrge korrelatsioonikoefitsient (r) ja väikesed erinevused RMSEC-i ja RMSEP-i vahel [27–29]. Kuue valitud ühendi kalibreerimismudelid loodi vastavalt ülalmainitud protseduuridele (tabel 3). Ehhinakosiidi kalibreerimiskomplekti RMSEC ja r väärtused olid vastavalt 27,6 ja 0,9808. Teiste keemiliste ühendite mudelite toimivusparameetrid on loetletud tabelis 3, millest võime järeldada, et loodud mudelid annavad rahuldavaid ennustustulemusi ja neid saab kasutada C. tubulosa kiireks kvantitatiivseks analüüsiks. Kuue keemilise ühendi hajuvusdiagrammid on näidatud joonisel 4, et muuta kalibreerimismudelid kirjeldavamaks ja visuaalselt vaadeldavaks. Nagu on näidatud joonisel 4, ilmnesid prognoositavate ja mõõdetud väärtuste vahel väikesed erinevused, kuna enamik punkte jaotati ümber regressiivse kõvera võrrandiga y=x. Seetõttu täheldati joonisel 4 suurepäraseid ennustavaid jõudlusi.

Materjalid ja meetodid

Proovi ettevalmistamine

Aastatel 2013–2015 koguti Xinjiangi autonoomsest piirkonnast Hotani prefektuurist sada kuusteist C. tubulosa proovi. Kõiki proove kasvatati, kuid need koguti erinevatel kasvuetappidel. Proovide värske kaal jäi vahemikku 20 g kuni 1000 g. Pärast päikese käes kuivatamist kuivatatud proovid purustati ja sõeluti läbi 60-sõela [3,23].

NIR-spektroskoopiline andmete kogumine

Proovide NIR-spektrid koguti 8 cm-1 intervalliga spektripiirkonnas 4000–10 000 cm-1 Antaris MXFT-NIR süsteemiga (Thermo Scientific, Madison, WI, USA), mis on varustatud käeshoitava optilise kiu peegeldusadapteriga. Iga spekter saadi 64 skaneeringu keskmisena. Kõigil proovidel lasti enne NIR spektri skaneerimist toatemperatuurini (25 °C) tasakaalustada, et tagada proovide analüüsimine samal temperatuuril. Niiskust laboris hoiti ümbritseva keskkonna tasemel.

HPLC andmete kogumine

Ekstraheerimise ettevalmistamine

Üks gramm C. tubulosa pulbrit ekstraheeriti 50 ml 50% metanooliga koonilises kolvis ultraheliga töötlemisega (500 W, 40 kHz) 30 minutit. Ekstrakti hoiti temperatuuril 4 °C. Ekstrakti supernatant filtriti, et saada proov HPLC analüüsi jaoks [3,23].

Ehhinakosiidi ja verbaskosiidi samaaegne määramine HPLC-UV-ga

Vedelikkromatograafiline analüüs viidi läbi Shimadzu UHPLC süsteemiga (Shimadzu, Kyoto, Jaapan), mis koosnes kahest LC-20ADXR lahusti kohaletoimetamise seadmest, LC-20AD pumbast, SIL-20ACXRauto proovivõtturist , CTO-20AC kolonniahi, SPD-M20A DAD-detektor, DGU-20A3R degaseerija ja ICBM-20kontroller.

Kromatograafiliseks eraldamiseks kasutatud Grace Prevail Carbohydrate ES kolonni (15{6}} × 2,1 mm, 2,7 mm) hoiti temperatuuril 35 ◦C. Liikuv faas koosnes atsetonitriilist (A) ja 0,1 protsendilisest sipelghappe vesilahusest (B) ning see tarniti gradientprogrammi järgi järgmiselt: 0–7 min, lineaarne gradient 10–20 protsenti A; 7–15 min, 20 protsenti A; ja 15–20 min, lineaarne gradient 20–10 protsenti A. Liikuva faasi kaaskiirus oli 0,4 ml/min. UV-seire viidi läbi 330 nm juures.

Mannitooli, sahharoosi, glükoosi ja fruktoosi samaaegne määramine HPLC-ELSD-ga

HPLC viidi läbi Agilent 1100 seeria LC-süsteemis (Palo Alto, CA, USA), mis koosnes aG1322A degasaatorist, G1311A kvaternaarpumbast, G1311A automaatsest proovivõtturist, G1316A kolonni temperatuuri kontrollerist ja G1315B DAD detektorist.

Kromatograafiliseks eraldamiseks kasutati Sigma Prevail Carbohydrate ES kolonni (4,6 × 25{7}} mm, 5 µm) ja seda hoiti kolonni temperatuuril 25 °C. Liikuv faas koosnes atsetonitriilist ja veest (77:23, maht/maht) ja isokraatlikust liitlasest, mida manustati kiirusega 0,7 ml/min. Heitvett jälgiti vaikeparameetritega aurustuva valguse hajumise detektori (ELSD) abil [23, 24].

Andmetöötlus

Kalibreerimis- ja valideerimiskomplektide jagamiseks, spektrite matemaatiliseks eeltöötluseks, kalibreerimismudelite loomiseks ja muudeks arvutusteks kasutati TQ Analysti (versioon 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA). Kujude valmistamisel kasutati päritolu (versioon 9.1).

Järeldused

Tänuavaldus: seda tööd toetas Hiina riiklik teaduse ja tehnoloogia planeerimise projekt (2015BAD29B00-04).

Autori kaastööd: Xinhong Wang mõtles välja ja kavandas katsed. Xinhong Wang ja Xiaoguang Wang tegid katseid. Xinhong Wang ja Yuhai Guo kirjutasid paberi.

Huvide konflikt: autorid kinnitavad, et huvide konflikte ei esine.

Viited

1. Jiang, Y.; Tu, PF Tsistanche liikide keemiliste koostisosade analüüs. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

2. Xu, R.; Chen, J.; Chen, S.-L.; Liu, T.-N.; Zhu, W.-C.; Xu, J. Cistanche deserticola Ma kasvatati Hiinas uue põllukultuurina. Genet. Ressurss. Crop Evol. 2008, 56, 137–142. [CrossRef]

3. Hiina farmakopöa komitee toimetamine. Hiina farmakopöa, 2005. väljaanne; Chemical Industrial Press: Peking, Hiina, 2005; 1. köide, lk. 90.

4. Kobayashi, H.; Komatsu, J. CistanchE herba koostisosad (1). Yakugaku Zasshi 1983, 103, 508–511. [CrossRef] [PubMed]

5. Laul, ZH; Lei, L.; Tu, PF Edusammud tsüstanche huffingi taimede farmakoloogilise aktiivsuse uurimisel. Et link. Lõug. Tradit. Ürt. Drugs 2003, 34, 473–476.

6. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Cistanche deserticola fenüületanoidide antioksüdatiivne toime. Biol. Pharm. Bull. 1996, 19, 1580–1585. [CrossRef] [PubMed]

7. Xuan, GD; Liu, CQ Uurimused Cistanche deserticola fenüületanoidglükosiidide (PEG) mõju kohta D-galaktoosi poolt indutseeritud vananemisvastastele hiirtele. J. Chin. Med. Mater. 2008, 31, 1385–1388.

8. Sato, T.; Kozima, S.; Kobayashi, K.; Kobayashi, H. Cistanchis Herba farmakoloogilised uuringud. I. Cistanchis Herba koostisosade mõju seksile ja õppimiskäitumisele kroonilise stressi all kannatavatel hiirtel. Yakugaku Zasshi 1986, 105, 1131–1144. [CrossRef]

9. Shen, CY; Jiang, JG; Yang, L.; Wang, DW; Zhu, W. Vananemisvastased toimeained traditsioonilises hiina meditsiinis kasutatavatest ürtidest ja toitainetest: farmakoloogilised mehhanismid ja mõju ravimite avastamisele. Br. J. Pharmacol. 2016, 11, 1395–1425. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Cistanches Herba Therapy neuroprotektiivne toime mõõduka Alzheimeri tõvega patsientidele. Evid. Põhinev komplement. Altern. Med. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]

11. Gao, JY; Jiang, Y.; Dai, F.; Han, ZL; Liu, HY; Bao, Z.; Zhang, TM; Tu, PF Uuring lahtistavate koostisosade kohta Cistanche deserticola YC Ma. Mod. Lõug. Med. 2015, 17, 307–310.

12. Tu, PF; Chen, QL; Jiang, Y.; Guo, YH; Yang, TX; Wang, XY; Aierkan, M.; Li, XB; Du, Y.; Nan, ZD; et al. Cistanche tubulosa ja selle peremehe Tamarix spp. Mod. Lõug. Med. 2015, 17, 349–358.

13. Tu, PF; Jiang, Y.; Guo, YH; Tian, ​​YZ; Li, XB; Wang, XY; Wei, J.; Chen, QL; Aierkan, M. Tistanches herba ökoloogilise tööstuse arendamine läänepoolse kõrbepiirkonna ökoloogilise tsivilisatsiooni edendamiseks. Mod. Lõug. Med. 2015, 17, 297–301.

14. Lu, DY; Zhang, JY; Yang, ZY; Liu, HM; Li, S.; Wu, BJ; Ma, ZG Tistanches herba kvantitatiivne analüüs, kasutades kõrgjõudlusega vedelikkromatograafiat koos dioodide massiivi tuvastamise ja kõrge eraldusvõimega massispektromeetriaga koos kemomeetriliste meetoditega. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef] [PubMed]Molecules 2017, 22, 843 9/9

15. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Herbatsitankide eristamine sõrmejälgede järgi kõrgjõudlusega vedelikkromatograafia-dioodide massiivituvastus-massispektromeetriaga. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

    ---