Pneumoonilise katku vastase kaitsva immuunsuse kiire esilekutsumine Yersinia Pestis'e polümeersete F1 ja LcrV antigeenide poolt

Abstraktne:

Hiljutises uuringus näitasime, et vaktsineerimine katku patogeeni Yersinia pestis polümeerse F1 kapsli antigeeniga viis kaitsva humoraalse immuunvastuse kiire esilekutsumiseni kaasasündinud sarnaste B1b-rakkude pöördelise aktiveerimise kaudu. Vastupidi, F1 monomeerne versioon ei suutnud selle muhkkatku mudeli puhul vaktsineeritud loomi koheselt kaitsta. Selles uuringus uurisime F1 võimet tekitada kiiret kaitsva immuunsuse teket kopsukatku keerulisemas hiiremudelis. Vaktsineerimine ühe alumiiniumhüdroksiidile adsorbeeritud F1 annusega andis nädala jooksul tõhusa kaitse järgneva surmava intranasaalse kokkupuute eest täielikult virulentse Y. pestis tüvega. Huvitaval kombel lühendas LcrV antigeeni lisamine sellise kiire kaitsva immuunsuse saavutamiseks vajalikku aega 4–5 päevani pärast vaktsineerimist. Nagu varem leitud, oli F1 polümeerne struktuur LcrV-ga vaktsineerimisel täheldatud kiirendatud kaitsereaktsiooni saavutamiseks hädavajalik. Lõpuks kutsus pikaealisuse uuringus esile ühekordne vaktsineerimine polümeerse F1-ga kõrgema ja ühtlasema humoraalse vastuse kui sarnane vaktsineerimine monomeerse F1-ga. Kuid selles olukorras korrati LcrV domineerivat panust pikaajalisele immuunsusele surmava kopsuhaiguse vastu.

Kaitsev humoraalne immuunvastus ja immuunsus on tihedalt seotud. Kaitsev humoraalne immuunvastus on organismi kaitsereaktsioon võõrpatogeenide vastu, milles osalevad peamiselt antikehad. Immuunsus viitab keha võimele seista vastu võõraste patogeenide sissetungile. Kaitsev humoraalne immuunvastus võib soodustada immuunrakkude tapvat toimet, suurendada organismi vastupanuvõimet ja seeläbi parandada immuunsust. Lisaks saab kaitsev humoraalne immuunvastus reguleerida ka immuunsüsteemi tasakaalu, kontrollida immuunsüsteemi aktiivsust ning vältida ülereageerimist ja autoimmuunhaiguste teket. Seetõttu on kaitsev humoraalne immuunvastus organismi tervise säilitamiseks ja immuunsuse tugevdamiseks hädavajalik. Lisaks on väga oluline ka inimese immuunsus, mis võib meid ära hoida viiruste rünnakute eest. Cistanche võib tugevdada immuunsust. Tistanche on rikas mitmesuguste antioksüdantsete ainete poolest, nagu C-vitamiin, C-vitamiin, karotenoidid jne. Need koostisosad võivad eemaldada vabu radikaale, vähendada oksüdatiivset stressi ja parandada immuunsüsteemi vastupanuvõimet.

Click cistanche tubulosa eelised

Märksõnad:

vaktsineerimine; kopsukatk; kiire kaitse; polümeerne F1; monomeerne F1; LcrV; hiire mudel.

1. Sissejuhatus

Gramnegatiivne bakter Yersinia pestis on muhk- ja kopsukatku põhjustaja. Sajad miljonid on surnud selle laastava patogeeni poolt põhjustatud nakkuste surmava iseloomu tõttu kolmes suures pandeemias ja arvukates viimase kahe aastatuhande jooksul registreeritud kohalikes puhangutes [1,2]. Suure nakkavuse ja letaalsuse tõttu on Y. pestis klassifitseeritud potentsiaalseks bioterrori tekitajaks (https://www.cdc.gov/plague/bioterrorism/index.html, juurdepääs 9. juulil 2021). Alates antibiootikumide avastamisest ja ulatuslikust kasutamisest on katku levimus ja suremus järsult vähenenud [3,4].

Sellegipoolest on katkuvastasel antibiootikumravil piirangud; Et olla tõhus, tuleb ravi alustada vahetult pärast sümptomite ilmnemist, mis alguses sarnanevad tavalise ülemiste hingamisteede infektsiooniga ja seetõttu sageli valesti diagnoositud. Igasugune viivitus katkuravi spetsiifiliste antibiootikumide manustamisel võib vähendada nende tõhusust ja põhjustada ravitavate isikute märkimisväärset suremust [5]. Hiljutine virulentsete Y. pestis'e tüvede isoleerimine, mis on resistentsed mitme antibiootikumi, sealhulgas ravi jaoks soovitatavate antibiootikumide suhtes, ja mure, et selliseid muudetud fenotüüpe võidakse pahatahtlikult viia virulentsetesse tüvedesse bioloogilise sõja või bioterrorismi eesmärgil, tingib vajaduse täiendavate vastumeetmete väljatöötamiseks [6–8] . Tõepoolest, hiljutine teise rea antibiootikumide kasutamine, täiendavad ravimeetodid ning antibiootikumi- ja faagiteraapia kombinatsioon näitavad paljutõotavaid tulemusi kopsukatku hiiremudelis [9, 10].

Hiljuti näitasime muhkkatku hiiremudelit kasutades, et Y. pestis'e kapsli antigeeni F1 manustamine kutsub päevade jooksul esile kaitsva immuunsuse ja võib seetõttu olla terapeutiline sekkumine haiguse ennetamisel [11,12]. See kaitse kiire tekkimine hõlmas kõhukelme- ja pleuraõõnes asuvate kaasasündinud B1b-rakkude kiiret aktiveerimist, mille tulemuseks oli vereringes anti-F1 IgM ja IgG antikehade tootmine [11,12]. F1 polümeerne struktuur oli oluline katkuvastase immuunsuse kiireks esilekutsumiseks, nagu näitas tähelepanek, et vastupidiselt polümeersele F1-le ei suutnud konstrueeritud monomeerne tsirkulaarne permuteeritud F1-valk (monoF1) vahetult pärast immuniseerimist seostuda kõhukelme B1b-rakkudega ja vastavalt anti-F1 antikehade tootmine viibis [12]. Selles uuringus, kasutades intranasaalse Y. pestis'e infektsiooni hiiremudelit, uurisime F1 antigeeni võimet pakkuda kiiret kaitsvat immuunsust kopsukatku vastu, mis on haiguse kõige raskem ilming.

See uuring kinnitab, et nagu ka buboonkatku immuunsuse puhul, oli F1 polümeerne olemus oluline nii kiire kui ka pikaajalise immuunsuse jaoks pärast vaktsineerimist ühe antigeeni annusega. Kuna F1 ja LcrV antigeenid esindasid kõige tõenäolisemaid katkuvastaseid subühikute vaktsiine ja näitasid, et nad kutsuvad esile kiire kaitsva immuunsuse kopsukatku hiiremudelis [13], laiendasime seda uuringut, käsitledes võimalust veelgi kiirendada kaitset katku vastu. kopsukatk kombineeritud F1 ja LcrV preparaadiga.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Eetikaavaldus

See uuring viidi läbi rangelt kooskõlas riikliku terviseinstituudi laboriloomade hooldamise ja kasutamise soovitustega. Kõik loomkatsed viidi läbi Iisraeli seaduste kohaselt ja need kiitis heaks Iisraeli Bioloogiauuringute Instituudi loomkatsete eetikakomitee (lubade numbrid: IACUC-IIBR M-50-18, IACUC-IIBR M-36-19, IACUC -IIBR M-64-19, IACUC-IIBR M-73-20). Pärast intranasaalset manustamist jälgiti hiiri iga päev. Meie ellujäämisuuringutes kasutati humaanseid tulemusnäitajaid. Hiired, kellel ilmnes püstuvusrefleksi kadumine, tapeti emakakaela nihestusega.

2.2. Loomad

Kuue kuni kaheksa nädala vanused inbred C67BL/6 emased hiired osteti ettevõttest Envigos (Jeruusalemm, Iisrael). Sarnase vanusega meeste ja naiste CD-d osteti Charles Riverilt (Ühendkuningriik).

2.3. Loomade immuniseerimine puhastatud antigeenidega

PolyF1: polümeerne F1 valk puhastati Y. pestis Kimberley53 tüve caf1 operoni ekspresseerivate E. coli rakkude kultuuri supernatandist, nagu on eelnevalt kirjeldatud punktis [14]. Puhastatud F1 molekulmass määrati suuruseralduskromatograafia abil Superdex 200 kolonni (Cytiva, MA, USA) kasutades suuremaks kui 1000 kDa.

MonoF1: ​​plasmiid pAH34L, mis kodeerib monomeerset F1 (cpCaf1), saadi lahkelt dr Daniel Petersilt ja prof Jeremy H. Lakeylt, Newcastle'i ülikoolist, Ühendkuningriigist [15]. pAH34L sisestati Lemo21 (DE3) E. colisse, mis osteti firmalt New England Biolabs (Ipswich, MA, USA). Juhuslikult valitud transformante kasvatati temperatuuril 37 °C ja 220 pööret minutis Terrific puljongis, millele oli lisatud ampitsilliini (200 µg/ml). Ekspressioon indutseeriti logaritmi keskel, lisades isopropüül-tiogalaktopüranosiidi (IPTG; 1 mM) ja seejärel inkubeeriti kultuure temperatuuril 18 °C ja kiirusel 220 p/min veel 19 tundi. Bakteripelletid kaaluti (märgkaal) ja solubiliseeriti CelLytic™ B-rakkude lüüsireagendiga vastavalt tootja juhistele (Merck-Sigma, Rehovot, Iisrael).

Rekombinantne Tol3-cpCaf1 sulandvalk puhastati hõlbustatud survevedelikkromatograafia (PFLC) abil HisTrap™ HP kolonnis vastavalt tootja juhistele (Cytiva, MA, USA). Tol3 fragment eraldati cpCaf1-st trombiiniga lõhustamise teel (Merck-Sigma, Rehovot, Iisrael) ja esimese reabsorptsiooniga regenereeritud HisTrap™ HP kolonnis. CpCaf1 (monoF1) fragment koguti läbivoolufraktsioonist ja dialüüsiti ulatuslikult 1 × PBS vastu. Endotoksiinid eemaldati Triton X-114 faaside eraldamise meetodil, nagu on kirjeldatud eelnevalt artiklis [16]. Valgu kogust mõõdeti bitsinhoniinhappe meetodil (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo). Monomeerse F1 puhtust kontrolliti SDS-PAGE-ga, millele järgnes Coomassie blue värvimine ja Western blot analüüs, kasutades küüliku anti-F1 antikehi, nagu eelnevalt kirjeldatud punktis [11].

LcrV: virulentsest Y. pestis Kimberley53 tüvest pärit täispikk LcrV-d kodeeriv järjestus klooniti pGEX ekspressioonivektorisse (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) ja sisestati E. coli rakkudesse. Leiti, et LcrV kodeeriv järjestus on identne Y. pestis CO92 tüve LcrV-ga. Rekombinantne LcrV valmistati ja puhastati, nagu on kirjeldanud Leary et al. [17]. Endotoksiinid eemaldati puhastatud LcrV-st, nagu ülalpool kirjeldatud.

Kokku 20 kuni 160 µg polüF1 ja LcrV või 80 µg monoF1 adsorbeeriti 2% alumiiniumhüdroksiidi (AlOH) geelil (Brennentag Biosector, Taani) lõppkontsentratsioonini 0,36%. Üksikud hiired immuniseeriti subkutaanselt, kasutades alaseljale konstantset mahtu 200 µl.

2.4. Seroloogilise vastuse iseloomustus

Hiirtelt võeti sabast veri ning ELISA abil määrati seerumis F1 ja LcrV vastu tekkinud individuaalsed IgG tiitrid, nagu on eelnevalt kirjeldatud punktis [11]. IgG1 ja IgG3 tiitreid mõõdeti, kasutades isotüübispetsiifilisi aluselise fosfataasiga konjugeeritud kitse hiirevastaseid antikehi (Jackson Laboratories, Farmington, CT, USA).

Bronhoalveolaarne loputus (BAL): hiired anesteseeriti ketamiini/ksülasiini lahusega ja hingetoru paljastati, pöörates erilist tähelepanu, et mitte põhjustada verejooksu. Tehti väike sisselõige ning sisestati {{0}}mõõduga painduv kanüül (BD Neoflon™) ja kinnitati kirurgilise õmblusega. Kopse pesti 1 × PBS-ga, kasutades 1 ml luer-lock süstalt, mis oli ühendatud kinnitatud kanüüliga. Loputusvedelik, mis oli saastunud veretunnustega, visati ära. Loputusvedelik puhastati tsentrifuugimisega (400 × g, 4 ◦C) ja supernatant filtreeriti enne ELISA-d steriilselt. Anti-F1 ja anti-LcrV antikehade kontsentratsioonid vaktsineeritud loomade BAL vedelikus (BALF) määrati, kasutades lahjendatud Mab 57 (F1) ja Mab 59 (LcrV), millest on varem teatatud [18] kui standardkõverad, mis sisaldusid igas {{14} }kaevu testplaat. Anti-F1 IgG ja anti-LcrV antikehade avastamispiirid (LOD) BALF-is määrati vastavalt 0,8 ng/ml ja 0,15 ng/mL.

2.5. Hiire infektsioon

Intranasaalsed (in) infektsioonid viidi läbi nii, nagu on kirjeldatud eelnevalt jaotises [19]. Lühidalt, koguti silmus täis tüüpilisi Y. pestis Kim53 bakterikolooniaid ja lahjendati südameinfusioonipuljongis (HIB, Difco), millele oli lisatud 0,2 protsenti ksüloosi ja 2,5 mM CaCl2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) kuni OD660 väärtuseni 0.01 ja kasvatati 22 tundi temperatuuril 28 ◦C ja 100 pööret minutis. Inkubatsiooniperioodi lõpus (OD660 ≈ 4) kultuur pesti ja lahjendati soolalahusega (0,9 protsenti NaCl) soovitud nakkava annuseni, mida kontrolliti kolooniaid moodustavate ühikute loendamisega pärast plaadistamist ja inkubeerimist BHIA plaatidel (48 tundi). temperatuuril 28 ◦C). Hiired anesteseeriti 0,5% ketamiini HCl ja 0,1% ksülasiini seguga ning seejärel nakatati intranasaalselt 35 µl/hiire bakterisuspensiooniga. Kim53 tüve intranasaalne LD50 C57BL/6 hiirte suhtes on 1100 cfu ja CD-1 hiirte suhtes 2100 cfu. LD50 väärtused arvutati vastavalt Reedi ja Muenchi [20] kirjeldatud meetodile. Hiirte haigestumust ja suremust jälgiti iga päev 21 päeva jooksul. Selle perioodi lõpus kontrolliti patogeeni kliirensit ellujäänud loomade põrna homogenaatide külvamisega BHIA plaatidele, millele oli lisatud 200 µg/ml streptomütsiini (48 tundi temperatuuril 28 °C).

2.6. Pneumoonilise katku hiiremudeli iseloomustus

Intranasaalselt nakatunud hiired anesteseeriti näidatud ajahetkel pärast kokkupuudet ketamiini/ksülasiini lahusega ja hepariniseeritud veri võeti südamepunktsiooniga. Seejärel lõigati välja mediastiinumi lümfisõlm (mdLN), kopsud ja põrn ning püreestatakse üherakuline suspensioon 70 µm nailonvõrgule (rakukurn, Falcon, Corning, NY, USA) 1× PBS-is. . Y. pestis Kim53 arv erinevates organites ja veres määrati seeriaviisiliselt lahjendatud rakususpensioonide külvamisega BHIA plaatidele, millele oli lisatud 200 ug/ml streptomütsiini. Histoloogiliseks analüüsiks hiired tuimastati ja nende hingetoru kanüüliti, nagu ülalpool näidatud. Kanüüliga ühendati kolonn (0,7 × 30 cm, KONTES, St. Louis, MO, USA), mis oli täidetud formaldehüüdi puhverlahusega (lõplik kontsentratsioon 10%) ja kopse "puhuti täis" ainult gravitatsiooni jõul. Fiksaatoriga täidetud kopse hoiti samas puhvris 14 päeva ja seejärel töödeldi parafiiniga manustatud plokkide moodustamiseks. Ühe kuni kolme mikromeetri suurused lõigud värviti fibroosi tuvastamiseks standardse eosiini / hematoksüliini (H&E) peitsiga ja Masson-Goldneri värvimiskomplektiga (Merck, Rehovot, Iisrael). Lisaks värviti kopsulõigud Y. pestis'e suhtes, kasutades majasiseseid küüliku anti-F1 IgG antikehi (1:10, 000) ja Histostain®-SP komplekti (ZYMED®, Invitrogen, Waltham, MA, USA ). Värvitud lõigud pildistati ICC3 kaameraga, mis oli ühendatud mikroskoobiga Axioscope A1 (Zeiss, Saksamaa).

2.7. Statistiline analüüs

Rohkem kui kahte rühma kuuluvatel hiirtel registreeritud tiitrite vaheline olulisus määrati mitteparameetrilise Kruskal-Wallis abil Dunni post hoc testiga. Erinevates vaktsineerimisrühmades saadud ellujäämiskõverate võrdlemiseks kasutati log-rank (Mantel-Cox) testi. Erinevusi peeti olulisteks, kui p oli väiksem kui 0,05 või sellega võrdne. Arvutused viidi läbi GraphPad Prism tarkvara abil.

3. Tulemused

Eelmises uuringus näitasime, et hiirte vaktsineerimine Yersinia pestis'e F1 kapsli antigeeni natiivse polümeerse vormiga põhjustas kiire kaitse muhkkatku vastu. Sellest tulenevalt tehti ettepanek, et F1 manustamist võiks kaaluda mitte ainult profülaktilise meetmena, vaid ka terapeutilise sekkumisena erakorralistel juhtudel, nagu haiguspuhangud, mis hõlmavad looduslikult esinevaid või pahatahtlikult loodud antibiootikumiresistentseid tüvesid [12]. Selles aruandes uuriti kiire kaitse esilekutsumist kopsukatku korral, kasutades väljakujunenud hiiremudelit, mis seisnes hiirte kokkupuutes patogeeniga intranasaalse inokuleerimise teel. Näidati, et see mudel säilitab primaarse kopsukatku hingamisteede ilminguid iseloomustava patogeensuse (täiendav joonis S1) [10, 19, 21–24].

3.1. Kiire kaitseimmuunsus, mida pakuvad F1 ja LcrV pneumoonilise katku hiiremudelis

F1 antigeeni võimet kutsuda esile kiiret kaitset testiti katsetega, milles C57BL/6 hiiri vaktsineeriti ühekordse AlOH-ga adsorbeeritud polüF1 (20, 80 ja 160 µg/hiire kohta) manustamisega, samas kui kontrollloomadele süstiti ainult adjuvant. Vaktsineeritud hiirte võimet elada üle surmava intranasaalse infektsiooni virulentse Y. pestis'e tüvega Kim53 (10LD50=11,000 cfu) hinnati kolm ja seitse päeva pärast vaktsineerimist võrreldes kontrollloomadega (joonis 1). ). Kolme päeva pärast täheldati ainult mõõdukat surma ja ellujäämise aja pikenemist (mitterahuldava statistilise olulisusega) (joonis 1A). Vaktsineerimise ja nakatamise vahelise aja pikendamine veel vaid 4 päeva võrra (kokku 7 päeva) võimaldas päästa kõik polüF1 suurte annustega (80 ja 160 µg/hiire kohta) vaktsineeritud hiired ning 87 protsenti vaktsineeritud hiirtest. polüF1 väike annus (joonis 1B).

F1 antigeeni võime kutsuda esile kiire kaitsva immuunvastuse kopsukatku vastu julgustas meid uurima, kas immuniseerimine täiendava kaitsva antigeeniga LcrV parandaks veelgi loomade immuunseisundit, kiirendades kaitsva immuunsuse teket. Tõepoolest, kui surmav Y. pestisega nakatumine viidi läbi 3 päeva pärast kombineeritud vaktsineerimist, suutis LcrV ja polüF1 segapreparaadi (80 µg või 160 µg iga antigeeni) manustamine päästa 30–50 protsenti vaktsineerimisest. hiired (joonis 1C). Kõige olulisem on see, et vaktsineerimise ja nakatamise vahelise perioodi pikendamine seitsme päevani andis kõigile vaktsineeritud loomadele täieliku kaitse antigeenide kõigi annuste juures (joonis 1D). PolüF1 võimet üksi või kombinatsioonis LcrV-ga luua nädala jooksul kiire kaitsev immuunsus kopsukatku vastu ei mõjutanud intranasaalse kokkupuute prooviannuse suurendamine kümnekordselt (joonis 1E), mis kinnitab kaitstud oleku tugevust.

3.2. Humoraalse reaktsiooni kineetika pärast F1 ja LcrV vaktsineerimist

Tähelepanu, et kombineeritud LcrV ja F1 vaktsiin kutsus esile kiire kaitsva immuunsuse, viitas sellele, et varsti pärast seda kutsuti esile humoraalne reaktsioon. Selle võimaluse käsitlemiseks ja iga antigeeni vastase humoraalse vastuse panuse määramiseks kaitsesse Y. pestis'e vastu analüüsiti kahe individuaalse antigeeni vastu tekkinud spetsiifiliste IgG antikehade kineetikat 5–9 päeva pärast üheannuselist vaktsineerimist. C57BL/6 hiirtel polüF1 ja LcrV segakoostisega (joonis 2A). Nagu oodatud, olid varasemate vaatluste põhjal F1-vastase IgG antikehade tiitrid (GMT=1,35 × 103 ) kõikide vaktsineeritud loomade seerumis tuvastatavad juba 5. päeval pärast vaktsineerimist (joonis 2B).

Järgmistel päevadel täheldati F1-vastaste IgG antikehade tiitrite järkjärgulist tõusu, mis saavutas 9. päeval pärast vaktsineerimist ~60- korda kõrgema taseme (GMT=8.26 × 104, joonis 2B). Anti-F1 IgG antikehi võis tuvastada ka kopsuvedelikus alates 7. päevast pärast vaktsineerimist, saavutades 9. päeval kontsentratsiooni ~1 µg/ml (joonis 2C). Huvitav on see, et kuigi LcrV-vastane humoraalne vastus jäi võrreldes polüF1 esilekutsutud vastusega maha (7. päev GMT=613, joonis 2D), mõõdeti järgmistel päevadel LcrV-vastaste IgG antikehade tasemete suurem tõus, mis näitas üldine kasv ~160- korda (GMT=1 × 105, joonis 2D). LcrV-vastaseid IgG antikehi võis tuvastada ka vaktsineeritud hiirte kopsuvedelikus alates 8. päevast, kuigi madalamal kontsentratsioonil võrreldes anti-F1 tasemetega (joonis 2E).

LcrV-vastaste IgG tiitrite järsk tõus, mida täheldati 8.–9. päeval pärast vaktsineerimist, ei paistnud hõlmavat kaasasündinud B1b-rakkude aktiveerumist, nagu viitab tähelepanek, et nende antikehade IgG3 fraktsioon oli allapoole tuvastamist. anti-F1 IgG3 antikeha fraktsioon ([12] ja täiendav joonis S2). Seetõttu näitavad andmed, et LcrV võib tekitada ka kiire humoraalse vastuse, pakkudes koos F1-ga tõhusat kaitset kopsukatku vastu juba nädal pärast vaktsineerimist. Lisaks viitab tähelepanek, et anti-F1 ja anti-LcrV IgG antikehad kogunesid vaktsineeritud loomade kopsudesse, et lokaalne reaktsioon kopsudes võib olla oluline kopsukatku vastase immuunsuse saavutamiseks.

3.3. F1 polümeerse struktuuri tähtsus kaitsva immuunsuse kiireks tekkeks

Oleme varem avaldanud leiud, mis toetavad tugevalt arvamust, et F1 kvaternaarne polümeerne arhitektuur on oluline selle võimeks kutsuda esile kiire kaitsereaktsioon buboonse katku vastu [12]. Sellest tulenevalt käsitleti selles uuringus seda küsimust ka kopsukatku vastase kaitse puhul. Hiiri vaktsineeriti monomeerse või polümeerse F1-ga, mõlemal juhul hõlmas LcrV samaaegne manustamine (80 µg iga antigeeni hiire kohta). Kolm, neli ja viis päeva hiljem nakatati hiiri intranasaalselt surmava annusega Y. pestis Kim53. Joonisel fig 3 kujutatud ellujäämisandmed näitasid, et polüF1 ja LcrV seguga vaktsineerimine kaitses surmava nakatamise eest vastavalt 25%, 62,5% ja 87,5% hiirtest (joonis 3A).

Seevastu kõik monoF1 ja LcrV seguga vaktsineeritud hiired alistusid infektsioonile, välja arvatud rühm, keda vaktsineeriti 5 päeva enne nakatamist ja millel oli madal 25-protsendiline kaitse (joonis 3B). Vaktsineerimine segamata preparaatidega, mis koosnesid polüF1-st, monoF1-st või LcrV-st (80 µg hiire kohta) 4 päeva enne nakatamist, ei kaitsnud loomi. Siiski andis polüF1-ga vaktsineerimine võrreldes kõigi teiste katserühmadega oluliselt viivitust suremuses (p < 0,001; joonis 3C). Kokkuvõttes näitavad need tulemused selgelt, et F1 polümeerne vorm on oluline kiire kaitsevastuse saamiseks kombinatsioonis LcrV-ga.

3.4. Ühekordsest F1 ja LcrV-ga vaktsineerimisest põhjustatud pikaajalise kaitsva immuunsuse iseloomustus

Lõpuks uurisime, kas klassikaline pikaajaline kaitsev immuunsus kopsukatku vastu erineb monoF1 või polyF1-ga vaktsineeritud hiirtel. Vastavalt sellele vaktsineeriti CD1 hiiri üks kord monoF1 või polüF1-ga, samuti manustati preparaate, mis sisaldasid kombinatsiooni LcrV-ga. Spetsiifiliste antikehade taset vaktsineeritud loomade seerumis mõõdeti kuus kuud hiljem. Joonisel 4A kujutatud andmed näitavad, et anti-F1 IgG tiitrid olid kõigis polüF1-ga vaktsineeritud rühmades kõrgemad kui monoF1-ga vaktsineeritud rühmades. Kõigil LcrV-ga vaktsineeritud hiirtel mõõdeti kõrgeid ja püsivaid LcrV-vastaseid IgG tiitreid.

6 kuud pärast immuniseerimist (3 päeva pärast vere võtmist tiitri määramiseks) nakatati hiiri intranasaalselt surmava annusega, mis sisaldas Y. pestis Kim53 100LD50, ja ellujäämist jälgiti 21 päeva (joonis 5). Hiired, keda vaktsineeriti ühe antigeenina polüF1-ga, olid ainult osaliselt kaitstud, samas kui kõik monoF1-ga vaktsineeritud hiired alistusid infektsioonile sarnaselt naiivsete kontrollhiirtega (joonis 5A). Nimelt ei ilmnenud polüF1-vaktsineeritud loomade seerumites mõõdetud anti-F1 IgG tiitrid tugevat korrelatsiooni kopsuhaiguse vastase ellujäämisega (joonis 5B). LcrV lisamine võimaldas täielikku kaitset nii monoF1-ga vaktsineeritud kui ka polüF1-ga vaktsineeritud hiirtele (joonis 5A), mis näitab, et LcrV-vastane vastus võimaldas anti-F1 vastuse kaitsva väärtuse täielikku avaldumist. Sarnased tulemused humoraalsete reaktsioonide ja kopsuprobleemide ellujäämise kohta saadi vaktsineeritud isastel CD-1 hiirtel (täiendav joonis S3), mis näitab, et uuringus ei ole loomade sugu kallutatud (pange tähele, et esialgsed katsed viidi läbi emasloomadega) .

Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et F1 võib iseenesest esile kutsuda kiire kaitse kopsukatku vastu, mis sõltub selle looduslikust polümeersest struktuurist. LcrV lisamine polüF1-le mitte ainult ei lühendanud sellise kiire kaitse saavutamiseks vajalikku aega, vaid andis ka pikaajalise ja tõhusa kaitsva immuunsuse katku kopsuilmingute vastu, nagu eelnevalt kirjeldatud.

4. Arutelu

Hiljutine virulentsete Y. pestis'e tüvede isoleerimine, mis on resistentsed mitmete antibiootikumide, sealhulgas teraapiaks soovitatavate antibiootikumide [8, 25, 26] suhtes, on tingitud täiendavate vastumeetmete otsimisest kopsukatku vastu, nagu vaktsiinid, mis kutsuvad esile kiire immuunsuse, kõrge. rahvatervise ja kliinilise tähtsusega. Vaktsiine peetakse üldiselt nakkushaiguste ennetavateks vastumeetmeteks ja seega toimetatakse need tervetele inimestele aastaid ette. Sellest lähtuvalt hõlmas enamik katkuvastase vaktsiini väljatöötamist uurinud prekliinilistest uuringutest pikaajalist vaktsineerimisrežiimi enne surmavat väljakutset [13, 27–29]. Oleme varem teatanud, et kapsli F1 antigeeni loodusliku polümeerse vormiga vaktsineerimine käivitab väga kiire ja tugeva B-rakkudest sõltuva immuunvastuse, mis kaitseb loomi isegi mitu tundi pärast surmavat nahaalust Y. pestis'e nakatumist [11,12].

Nendes uuringutes oleme näidanud, et ühekordne vaktsineerimine F1-ga kutsub esile F1-vastaste antikehade (IgM ja IgG) kuhjumise seerumis mitme päeva jooksul kaasasündinud B1b-rakkude aktiveerimise kaudu. See B-rakkude alampopulatsioon asub hiirte kõhuõõnes ja tekitab tavaliselt seroloogilisi vastuseid mittevalguliste polümeersete antigeenide vastu, nagu LPS ja polüsahhariidid, mis moodustavad paljude patogeenide (pneumokokid, meningokokid jne) kapsli [30]. Neid kiireid immuunvastuseid iseloomustab T-rakkude sõltumatus ja IgG3 hiire antikeha serotüübi teke. Näitasime, et kõik ülalnimetatud omadused kehtivad ka F1 genereeritud kiire kaitsereaktsiooni kohta. Lisaks näitasime, et F1 polümeerne olemus on selle kiire immuunvastuse jaoks hädavajalik, kuna monomeerne F1 (mis genereeriti caf1 geeni ringikujulise permutatsiooniga) ei suutnud B1b rakke aktiveerida, mis jäi IgG tiitri kineetikas maha pärast polümeerset F1. ei tekitanud IgG3 serotüüpi ega andnud kiiret kaitset. Selle kiire reaktsiooniga kaasneb tavaline aeglasem T-rakkudest sõltuv adaptiivne reaktsioon F1 vastu. Seega oletame, et polümeerne F1 tekitab kaks paralleelselt toimivat seroloogilist vastust: üks, mis on T-rakkudest sõltumatu B1b-rakkude kaudu, ja teine, mis hõlmab follikulaarseid B-rakke T-rakkudest sõltuval viisil [12].

Selles aruandes laiendati eelmist uuringut, käsitledes F1 antigeeni võimet anda kiire kaitsereaktsioon kopsukatku keerulisemas hiiremudelis. Näitame, et AlOH-ga adsorbeeritud polümeerse F1 ühekordne manustamine seitse päeva enne surmavat intranasaalset nakatumist virulentse Y. pestis tüvega võib esile kutsuda tõhusa kaitsereaktsiooni (joonis 1). Sellel üllataval tähelepanekul pole peaaegu mingit pretsedenti mitte ainult reaktsiooni kiiruse osas, vaid ka seoses sellega, et F1 antigeeni võimet pakkuda kaitset kopsukatku hiiremudelis käsitleti harva [31]. Siin esitatud tähelepanek on kooskõlas Derbise'i ja tema kolleegide [32] dokumenteeritud tähelepanekuga, mis puudutab F1-vastaste antikehade tuvastamist vahetult pärast vaktsineerimist. Siin näitame, et LcrV lisamine polüF1-le ei olnud mitte ainult pikas perspektiivis kasulik, nagu varem teatatud [33,34], vaid kiirendas ka kaitsvat immuunvastust Y. pestis'e intranasaalse nakatamise vastu vaid mõne päevani (joonised 2). ja 5).

Võimalus luua kiiret kaitset kopsukatku vastu F1 ja LcrV-ga vaktsineerimisega tugevdab Williamsoni ja tema kolleegide [13] varem teatatud sarnaseid leide, mille kohaselt vaktsineerimine F1 ja LcrV-ga andis kiire kaitse aerosooliga nakatumise eest Y. pestisega. 8. ja 9. päeval täheldatud anti-LcrV IgG tiitrite järsk tõus näitab, et LcrV aktiveeris varakult pärast immuniseerimist väga tugevaid immuunmehhanisme. LcrV-vastaste IgG3-vastaste antikehade puudumine seerumis, nende erinev kineetika ja kopsuvedelikus leitud LcrV-vastaste IgG-vastaste antikehade madalam tase viitavad tugevalt sellele, et F1 ja LcrV antigeenid aktiveerisid diskreetseid immuunmehhanisme, millest mõlemad aitas tõenäoliselt kaasa kaitsevastuse kiirele esilekutsumisele (joonis 3C).

Sarnaselt meie varasematele tähelepanekutele buboonkatku hiiremudelis, sõltus võime kutsuda esile kiire kaitsva immuunvastuse kopsukatku vastu F1 antigeeni polümeersest struktuurist (joonis 3). See tähelepanek viitab sellele, et levinud katkuvastane kandidaatvaktsiin, mis koosneb monomeersest F1-st ja LcrV-st kui sulandvalgust [35,36], ei taga eeldatavalt kiiret immuunsuse teket kopsukatku vastu; seda eeldust tuleb aga katseliselt uurida. Vaatamata sellele, et LcrV tekitatud seroloogiline reaktsioon oli polüF1 omast aeglasem (joonis 2), võimaldas siiski kiiret kaitsvat adaptiivset reaktsiooni, mis takistas kopsukatku surmavat mõju. See suhteliselt kiire seroloogiline vastus tulenes tõenäoliselt LcrV antigeeni võimest moodustada lahuses dimeere või tetrameere, nagu on leitud varasemates uuringutes [37, 38] ja meie avaldamata andmetes. Arvestades meie järeldusi F1 multimeerse struktuuri mõju kohta humoraalse immuunvastuse tekke kiirendamisel, võib LcrV valgu rekombinantne konstrueerimine, mis võimaldab suuremal määral multimerisatsiooni, reaktsiooni veelgi kiirendada. Kooskõlas selle eeldusega väärib märkimist hiljutine aruanne, milles dokumenteeritakse, et F1 ja LcrV-d sisaldavad mikrokristallid kaitsesid paremini kui sarnane vaktsiin, mis koosneb nendest antigeenidest lahustuvas vormis [39]. See tähelepanek viitab sellele, et F1 polümeeris oma olemuselt esinevate antigeenide tiheduse suurendamine võib parandada ja võib-olla kiirendada kaitsvaid humoraalseid reaktsioone.

Lisaks võimele indutseerida immuunsuse kiiret esilekutsumist tekitas ühekordne immuniseerimine polümeerse F1-ga kaitsva oleku pikaealisust käsitlevates katsetes stabiilsemad ja ühtlasemad IgG tiitrid kui monomeerse F1 puhul (joonis 4). Ainuüksi polüF1-ga vaktsineerimine andis kopsuhaiguse vastu vaid osalise kaitse. Pange tähele, et üksikutel hiirtel mõõdetud spetsiifilised F1-vastased IgG tiitrid korreleerusid halvasti nende võimega väljakutse ellu jääda (joonis 5B). Hiirte vaktsineerimine F1 iga vormi kombinatsiooniga koos LcrV-ga andis kõrgema kaitsetaseme (joonis 5). Need leiud on kooskõlas varasemate uuringutega, mis näitasid, et vaktsineerimine tapetud täisrakulise (KWC) vaktsiiniga, mis indutseerib anti-F1 IgG, kuid mitte anti-LcrV IgG tiitreid, oli kopsukatku vastu immuunsuse tagamisel ebatõhus [13,40] .

Kui pikaealisuse uuringus andis polüF1 ainult osalise hilise immuunsuse, näitas see valk hiiri täielikku kaitset vahetult pärast vaktsineerimist, mis viitab täiendavate lühiajaliste immuunmehhanismide kaasamisele, mis aitasid kaasa patogeeni kiirele eemaldamisele. immuunsuse katsed. Oleme hiljuti näidanud, et vaktsineerimine nõrgestatud Y. pestis tüvega EV76 käivitas toitumise kaitsemehhanismi, mis tühistas patogeeni siderofoor-vahendatud virulentsusmehhanismid, mis konkureerivad peremeesorganismis saadaolevate rauaioonide pärast, aidates kaasa katkuvastase immuunsuse kiirele tekkele. 41]. Anti-F1 humoraalse immuunvastusega sünergistuvate lühiajaliste toetavate mehhanismide väljaselgitamine võib aidata välja töötada paremaid vaktsiine nii kopsukatku kui ka teiste surmavate nakkushaiguste vastu.

Täiendavad materjalid:

Järgmise toetava teabe saab alla laadida aadressilt https://www.mdpi.com/article/10.3390/vaccines11030581/s1, joonis S1: Kopsupõletiku iseloomustus pärast Y. pestis Kim53 intranasaalset inokuleerimist. Joonis S2: Anti-F1 ja anti-LcrV antikehade isotüübi iseloomustus vaktsineeritud hiirte seerumis. Joonis S3: Isaste hiirte seroloogilise vastuse pikaealisus ja ellujäämine pärast ühekordset vaktsineerimist monomeerse F1 ja polümeerse F1-ga kas üksi või LcrV-ga.

Autori kaastööd:

kontseptualiseerimine, EM ja YL; Andmete kureerimine, YL; Formaalne analüüs, YL; Uurimine, MA, AT, DG, YV, AZ ja YL; Metoodika, YL; Ressursid, TH ja AM; Järelevalve, EM; Kirjutamine – algne mustand, EM ja YL; Kirjutamine – läbivaatamine ja toimetamine, TC, EM ja YL Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.

Rahastamine:

Seda uurimistööd rahastas Iisraeli Bioloogiauuringute Instituut, grandi number SB/07.

Institutsioonilise ülevaatenõukogu avaldus:

Ei kohaldata.

Teadliku nõusoleku avaldus:

Ei kohaldata.

Andmete kättesaadavuse avaldus:

Selles uuringus esitatud andmed on vastavate autorite nõudmisel kättesaadavad.

Huvide konfliktid:

Autorid ei kinnita huvide konflikti.

Viited

1. Butler, T. katk ja muud Yersinia infektsioonid; Greenough, W., Merigan, TC, toim.; Plenum Medical Book Company: New York, NY, USA, 1983.

2. Randremanana, R.; Andrianaivoarimanana, V.; Nikolai, B.; Ramasindrazana, B.; Paireau, J.; Ten Bosch, QA; Rakotondramanga, JM; Rahajandraibe, S.; Rahelinirina, S.; Rakotomanana, F.; et al. Madagaskari linnakatku epideemia epidemioloogilised omadused, august-november, 2017: haiguspuhangu aruanne. Lancet Infect. Dis. 2019, 19, 537–545. [CrossRef]

3. Kugeler, KJ; Klambrid, JE; Hinckley, AF; Gage, KL; Mead, PS Inimese katku epidemioloogia Ameerika Ühendriikides, 1900–2012. Tekkima. Nakata. Dis. 2015, 21, 16–22. [CrossRef]

4. Kugeler, KJ; Mõdu, PS; Campbell, SB; Nelson, CA Antimikroobse ravi mustrid ja haiguse tulemused Ameerika Ühendriikide katkuhaigete seas, 1942–2018. Clin. Nakata. Dis. 2020, 70, S20–S26. [CrossRef]

5. Godfred-Cato, S.; Cooley, KM; Fleck-Derderian, S.; Becksted, HA; Russell, Z.; Meaney-Delman, D.; Mõdu, PS; Nelson, CA Inimese katku ravi: süstemaatiline ülevaade avaldatud koondandmetest antimikroobse efektiivsuse kohta, 1939–2019. Clin. Nakata. Dis. 2020, 70, S11–S19. [CrossRef]

6. Galimand, M.; Guiyoule, A.; Gerbaud, G.; Rasoamanana, B.; Chanteau, S.; Carniel, E.; Courvalin, P. Yersinia pestis'e mitme ravimiresistentsus, mida vahendab ülekantav plasmiid. N. Ingl. J. Med. 1997, 337, 677–680. [CrossRef]

7. Welch, TJ; Fricke, WF; McDermott, PF; valge, DG; Rosso, ML; Rasko, DA; Mammel, MK; Eppinger, M.; Rosovitz, MJ; Wagner, D.; et al. Mitmekordne antimikroobne resistentsus katku korral: esilekerkiv oht rahvatervisele. PLoS ONE 2007, 2, e309. [CrossRef]

8. Lei, C.; Kumar, S. Yersinia pestis antibiootikumiresistentsus: süstemaatiline ülevaade. Osong Public Health Res. Perspektiiv. 2022, 13, 24–36. [CrossRef]

9. Zauberman, A.; Gur, D.; Levy, Y.; Aftalion, M.; Vagima, Y.; Tidhar, A.; Chitlaru, T.; Mamroud, E. Yersinia pestis'e elusvaktsiini manustamine pärast kokkupuudet kopsukatku vastase teise rea antibiootikumravi tugevdamiseks. J. Infect. Dis. 2019, 220, 1147–1151. [CrossRef]

10. Vagima, Y.; Gur, D.; Aftalion, M.; Mooses, S.; Levy, Y.; Makovitzki, A.; Holtzman, T.; Oren, Z.; Segula, Y.; Fatelevitš, E.; et al. Faagiteraapia võimendab kopsukatku teise rea antibiootikumravi. Viirused 2022, 14, 688. [CrossRef]

11. Levy, Y.; Flashner, Y.; Tidhar, A.; Zauberman, A.; Aftalion, M.; Lazar, S.; Gur, D.; Shafferman, A.; Mahmoud, E. T-rakud mängivad olulist rolli anti-F1 vahendatud kiires kaitses buboonkatku vastu. Vaktsiin 2011, 29, 6866–6873. [CrossRef]

12. Levy, Y.; Vagima, Y.; Tidhar, A.; Aftalion, M.; Gur, D.; Nili, U.; Chitlaru, T.; Zauberman, A.; Mahmoud, E. Yersinia pestis F1 kapsli antigeeni sihtimine kaasasündinud B1b-rakkude poolt vahendab kiiret kaitsereaktsiooni muhkkatku vastu. NPJ Vaccines 2018, 3, 52. [CrossRef]

13. Williamson, ED; Stagg, AJ; Eley, SM; Taylor, R.; Green, M.; Jones, SM; Titball, RW (F1 pluss V) vaktsiini immuunvastuse kineetika buboon- ja kopsukatku mudelites. Vaktsiin 2007, 25, 1142–1148. [CrossRef]

14. Holtzman, T.; Levy, Y.; Marcus, D.; Flashner, Y.; Mamroud, E.; Cohen, S.; Fass, R. Caf1 operoni kandvate rekombinantsete Escherichia coli rakkude suure rakutihedusega kultuuris vabanenud Yersinia pestis F1 kapsli antigeeni suure molekulmassiga oligomeeride tootmine ja puhastamine. Microb. Cell Factories 2006, 5, lk 98. [CrossRef]

15. Chalton, DA; Musson, JA; Flick-Smith, H.; Walker, N.; McGregor, A.; lambaliha, HK; Williamson, ED; Miller, J.; Robinson, JH; Lakey, JH Ringikujulise permutatsiooniga monomeriseeritud Yersinia pestis'e vaktsiini antigeeni immunogeensus. Nakata. Immun. 2006, 74, 6624–6631. [CrossRef]

16. Petsch, D.; Anspach, FB Endotoksiinide eemaldamine valgulahustest. J. Biotechnol. 2000, 76, 97–119. [CrossRef]

17. Leary, SE; Williamson, ED; Griffin, KF; Russell, P.; Eley, SM; Titball, RW Aktiivne immuniseerimine Yersinia pestis'e rekombinantse V antigeeniga kaitseb hiiri katku eest. Nakata. Immun. 1995, 63, 2854–2858. [CrossRef]

18. Mechaly, A.; Vitner, EB; Levy, Y.; Gur, D.; Barlev-Gross, M.; Sittner, A.; Koren, M.; Levy, H.; Mahmoud, E.; Fisher, M. Uute monoklonaalsete F1- ja LcrV-vastaste antikehade epitoopide sidumine ja nende kasutamine lihtsas, lühikeses HTRF-testis kliinilise katku tuvastamiseks. Pathogens 2021, 10, 285. [CrossRef]

19. Tidhar, A.; Flashner, Y.; Cohen, S.; Levi, Y.; Zauberman, A.; Gur, D.; Aftalion, M.; Elhanany, E.; Zvi, A.; Shafferman, A.; et al. NlpD lipoproteiin on Yersinia pestis'e uudne virulentsustegur, mis on oluline katku tekkeks. PLoS ONE 2009, 4, e7023. [CrossRef]

20. Reed, LJ; Muench, H. Lihtne viiskümmend protsenti lõpp-punktide hindamise meetod12. Olen. J. Epidemiol. 1938, 27, 493–497. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com