Metformiinravi peatab väljakujunenud mittediabeetilise kroonilise neeruhaiguse progresseerumise rottidel

Praegused ravistrateegiadjaokskrooniline neeruhaigus (CKD)keskenduda peamiseltriskitegurite kontrolli all hoidmine. Metformiin, 2. tüüpi diabeedi esmavaliku ravim, avaldab kasulikke pleiotroopseid toimeid peale ettenähtud kasutuse ja esialgsed andmed on näidanud kaitsvat toimet neerukahjustuse tekke vastu. Selles uuringus hinnati metformiini ja kanagliflosiini, naatrium-glükoosi kaastransporteri -2 (SGLT2) inhibiitori, mille Ameerika Ühendriikide Toidu- ja Ravimiamet on hiljuti heaks kiitnud diabeetilise nefropaatia raviks, terapeutilist efektiivsust väljakujunenud mittediabeetilise kroonilise neeruhaiguse progresseerumise aeglustamisel. . Adeniinist indutseeritud kroonilise neeruhaigusega rotid määrati erinevatesse ravirühmadesse, et saada kas 200 mg/kg metformiini neli või viis nädalat pärast adeniinidieedi algust (kujundatud kerge kuni mõõdukas krooniline krooniline neeruhaigus) või 25 mg/kg kanagliflosiini neli nädalat pärast ravi alustamist. dieedi alguses igapäevase suukaudse sondiga nelja nädala jooksul. Iga ravirühma võrreldi vehiiklirühmaga. Krooniline adeniini annustamine põhjustas kandjaga ravitud rottidel raske kroonilise kroonilise neeruhaiguse tekke, millele viitas seerumi kreatiniinitaseme märkimisväärne tõus, kreatiniini kliirensi märkimisväärne vähenemine ja häiritud mineraalide metabolism. Metformiin, kuid mitte kanagliflosiin, peatas neerufunktsiooni languse. Lisaks ilmnes metformiiniga ravitud loomade neerudes vähem interstitsiaalset piirkonda ja põletikku võrreldes kandjarühmaga. Proteoomilised analüüsid näitasid, et metformiini neerude kaitsev toime oli seotud Hippo signaaliraja aktiveerimisega. See kõrgelt konserveerunud multiproteiini kinaasi kaskaad kontrollib kudede arengut, elundi suurust, rakkude proliferatsiooni ja apoptoosi. Seega näitas metformiin terapeutilist efektiivsust, peatades väljakujunenud kroonilise neeruhaiguse progresseerumise rotimudelis. Kidney International (2022) 101, 929–944; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2022.01.037

MÄRKSÕNAD:kanagliflosiin; krooniline neeruhaigus; Jõehobu signalisatsioonirada; neerufunktsioon;metformiin; proteoomika

UUS TAIMNE VALMISTUSKROONILINE NEERUHAIGUS (CKD)

Tõlkeavaldus

Ravistrateegiadkrooniline neeruhaigus (CKD)peaks ideaaljuhul (i) olema otse suunatud neerule ja (ii) suutma peatada juba väljakujunenud kroonilise neeruhaiguse edasise progresseerumise. Hiljutised uuringud diabeedivastaste ravimite, nagu metformiin ja kanagliflosiin, kohta viitavad oletatavale kasulikule mõjule neerufunktsiooni langusele. Selles artiklis kirjeldatakse rotiuuringu tulemusi, milles uuriti metformiini ja kanagliflosiini terapeutilist efektiivsust juba väljakujunenud mittediabeetilise kroonilise neeruhaiguse korral. Meie andmed näitavad, et metformiinil on renoprotektiivne potentsiaal ja sellel on perspektiiv kasutada seda ravimina kroonilise neeruhaiguse progresseerumise aeglustamiseks või isegi peatamiseks.

Krooniline neeruhaigus(CKD) iseloomustabneerufunktsiooni languskestusega üle 3 kuu. Seda peetakse praegu ülemaailmseks rahvatervise probleemiks, mille levimus on hinnanguliselt 3–16%.1–3 Peamised kroonilise neeruhaiguse põhjused arenenud riikides on diabeet ja hüpertensioon.1 Lisaks suurendab krooniline neeruhaigus ka südame-veresoonkonna haiguste ülemaailmset koormust. haigused.1,4 Neerukahjustus võib edasi areneda neerupuudulikkuseks, mis paratamatult nõuab dialüüsi või neerusiirdamist, ja järelikult vähendab oluliselt elukvaliteeti.5 Praegused kroonilise neeruhaiguse ravistrateegiad keskenduvad peamiselt riskitegurite kontrollimisele ja sümptomite leevendamisele.

Metformiin, biguaniidravim, on esmavaliku suukaudne diabeedivastane aine, mida kasutab 200 miljonit II tüüpi suhkurtõve all kannatavat patsienti.6,7 Kuigi metformiini on kasutatud juba 6 aastakümmet, on molekulaarsed rajad, mille kaudu metformiin vere glükoosisisaldust langetavad, endiselt. ei ole täielikult välja selgitatud.8,9 Erinevate uurimisrühmade andmed on aga näidanud, et metformiinil on palju healoomulisi pleiotroopseid toimeid peale esialgse ettenähtud kasutuse. Sõltumata patsiendi diabeetilisest seisundist on metformiini kasutamine osutunud paljutõotavaks südame-veresoonkonna haiguste10 ja polütsüstiliste munasarjade sündroomi11 ravis ning on näidanud märkimisväärset efektiivsust erinevate vähitüüpide (eesnäärme12 ja rinnanäärme13) puhul.

Lisaks on hiljutised andmed erinevate neeruhaiguste mudelite prekliinilistest uuringutest osutanud ka metformiini oletatavale neerude kaitsvale toimele.14–19 Eelmises eksperimentaalses uuringus näitasime, et ennetav metformiinravi suutis oluliselt nõrgendada neeruhaiguse arengut. raske krooniline neeruhaigus.14 Selles stsenaariumis leidsime, et metformiin säilitas neerufunktsiooni, vähendas neerupõletikku ja hoidis ära liigse fibroosi.14 Kahjuks diagnoositakse enamikul kroonilise neeruhaigusega patsientidest GFR juba vähenenud (GFR kategooria G2–G3a või isegi G3b–G4) Seetõttu on juba väljakujunenud kroonilise neeruhaiguse ravi kliiniliselt olulisem uuritav paradigma. Metformiini kliinilise kasutamise võimalikku selgitamist kroonilise kroonilise neeruhaiguse ajal on aga takistanud ajalooline hirm laktatsidoosi tekke ees.20,21 Läbivaadatud juhistes märgitakse, et metformiini võib nüüd kasutada kerge kuni mõõduka neerupuudulikkusega patsientidel. Lalau jt hiljutine kliiniline uuring23 näitas, et metformiinravi näis olevat ohutu ja endiselt farmakoloogiliselt efektiivne mõõduka kuni raske kroonilise kroonilise neeruhaiguse korral (GFR kategooriad G3a–b kuni G4), tingimusel et annust kohandatakse vastavalt neerukahjustuse astmele. ebaõnnestumine.

On näidatud, et naatriumglükoosi kaastransporter-2 (SGLT2) inhibiitorid vähendavad diabeediga patsientide neerukahjustuse riski ja on seetõttu heaks kiidetud diabeetilise nefropaatia raviks.24 SGLT2 inhibiitorid on uudne suukaudsete diabeedivastaste ravimite klass mis on suunatud neerutuubulite glükoosi reabsorptsioonile.25,26 Lisaks näitas hiljutises randomiseeritud kontrollitud uuringus (Dapagliflosiini ja kroonilise neeruhaiguse kahjulike tagajärgede ennetamise [DAPA-CKD] uuring) SGLT2 inhibiitor dapagliflosiin aeglustavat kroonilise neeruhaiguse progresseerumist. sõltumata II tüüpi diabeedi olemasolust.27

Sel põhjusel kiitis USA Toidu- ja Ravimiamet hiljuti heaks dapagliflosiini kasutamise kroonilise neeruhaigusega patsientidel, olenemata diabeedi staatusest.28,29 Et aidata selgitada väljakujunenud kroonilise neeruhaigusega seotud sekkumisi puudutavaid andmeid, oli meie käesoleva uuringu eesmärk hinnata kroonilise neeruhaiguse ravi efektiivsust. metformiin ja kanagliflosiin väljakujunenud kroonilise neeruhaiguse progresseerumise kohta mittediabeetiliste rottide mudelis adeniinist põhjustatud kroonilise neeruhaigusega.

MEETODID

Ravimi ettevalmistamine

Metformiin (Merck KGaA) ja kanagliflosiin (Janssen) lahustati enne igapäevast suukaudset sondimist 1% karboksümetüültselluloosis kontsentratsiooniga vastavalt 20 ja 2,5 mg/ml. Kasutati annuse mahtu 10 ml/kg.

Uuringu ülesehitus Üheksakümmend neli (94) isast Wistari rotti (Iffa, Credo) peeti 2 puuri kohta, allutati 12-12-tunnisele valguse-pimeduse tsüklile ning neile võimaldati ad libitum juurdepääs veele ja neile määratud dieedile. Krooniline neeruhaigus kutsuti esile adeniiniga rikastatud dieedi manustamisega (madala K-vitamiini sisaldusega, 0,25% adeniini, 0,2 mg/kg K, 1% Ca, 1% P, 1 RÜ /g D-vitamiini ja 6% valku), nagu on kirjeldatud mujal,30 kogu 8- ja 9-nädalase uuringuperioodi jooksul.

Kroonilise neeruhaigusega rotid jaotati juhuslikult 6 erinevasse rühma, et saada 4-nädalast ravi 200 mg/kg metformiini, 25 mg/kg kanagliflosiini või vehiikuliga (1% karboksümetüültselluloosi), mis algas kas 4 või 4. 5 nädalat adeniinist põhjustatud kroonilise neeruhaiguse raviskeemi. Kaasati 4- ja 5-nädalane ravi alguspunktid, et hinnata, kas terapeutiline efektiivsus sõltus kroonilise neeruhaiguse esialgsest raskusastmest. Neerude histoloogia ja funktsiooni hindamiseks nendes lähtepunktides manustati kahele täiendavale rühmale 0, 25% adeniini dieeti vastavalt 4 ja 5 nädala jooksul, misjärel nad ohverdati. Uuringu võrdlusalusena kaasati ka normaalse neerufunktsiooniga kontrollrottide rühm (joonis 1). Loomi hoiti 24 tundi metaboolsetes puurides uriiniproovide kogumiseks, millele järgnes vereproovide võtmine sabaveeni kaudu vaoshoitud ja teadvusel olekus. Juhistes soovitatakse metformiini annust vähendada patsientidel, kellel onneerufunktsiooni kahjustuset vältida laktatsidoosi.23,31,32 Seetõttu põhines annuse kohandamine seerumi laktaaditaseme ja pH kui laktatsidoosi näitajate hindamisel (täiendav tabel S1). Rühmas, kes sai pärast 4-nädalast adeniinist põhjustatud kroonilise neeruhaiguse ravi 1 minuti jooksul, vähendati annust 150 mg/kg-ni 7. nädalal kuni uuringu lõpuni. Kui ravi alustati pärast 5-nädalast adeniinist põhjustatud kroonilist neeruhaigust, vähendati metformiini annust 7. nädala alguses 150 mg/kg-ni ja 8. nädala lõpus 100 mg/kg-ni. Pärast 4-nädalast ravi metformiini või kanagliflosiiniga (8 ja 9 nädala adeniinist põhjustatud kroonilise neeruhaigusega) loomad tapeti veretustamise teel retroorbitaalse põimiku kaudu pärast anesteesiat 80 mg/kg ketamiini (Ketalar; Pfizer) ja 16 mg/kg ksülasiini (Rompun; Bayer) ip. ). Katseprotseduurid viidi läbi vastavalt National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals 85-23 (1996) ja Antwerpeni ülikooli eetikakomitee poolt (loa number 2017-56) heaks kiidetud.

Biokeemilised analüüsid

Deparafineeritud koelõigud värviti põletiku hindamiseks (CD45, pan leukotsüütide marker), kasutades avidiini-biotiini kompleksmeetodit. Pärast blokeerimist kitse seerumiga ja üleöö inkubeerimist küüliku polüklonaalse anti-CD45 (1:1000, ab10558, Abcam) primaarse antikehaga, järgnevat inkubeerimist biotinüülitud kitse küülikuvastase IgG antikehaga (PK-

4001, Vector Laboratories), millele järgnes avidiin-biotiinperoksidaasi kompleks (AB-kompleks, Vector Laboratories), võimaldas diaminobensidiini lisamisel visuaalselt tuvastada tumepruuni värvi. CD45 positiivsus (pindala protsent) kvantifitseeriti pimendatud viisil (algne suurendus 100), kasutades Axiovision pildianalüüsi tarkvara (Carl Zeiss).

Kvantitatiivne reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon Kiirelt külmutatud neeruosa kogu mRNA ekstraheeriti PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen) abil ja pöördtranskribeeriti cDNA-ks suure mahutavusega cDNA arhiivikomplekti (Applied Biosystems) abil. Kvantitatiivne reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon viidi läbi programmi QuantStudio 3 (Thermo Fisher Scientific) abil. TaqMani sond ja praimerid osteti ettevõttest Thermo Fisher Scientific (täiendavad meetodid). Iga testitud geeni ekspressioonitaset analüüsiti iga proovi puhul kolmes eksemplaris ja normaliseeriti majapidamise võrdlusgeeni Gapdh ekspressiooniga. Proteoomilised analüüsid Metformiini või kandjaga ravitud CKD rottide vasak neer pärast 5-nädalast adeniini dieeti koguti ja valmistati ette massispektromeetria ja kvantitatiivse proteoomika jaoks, nagu on kirjeldatud lisameetodites. Bioinformaatilised analüüsid Omandatud andmekogumite oluliselt muudetud valgud märgiti funktsionaalselt, kasutades Kyoto geenide ja genoomide entsüklopeediat (KEGG) ja WikiPathwaysi rajaanalüüsi, kasutades Enrichri komplekti (https://maayanlab.cloud/Enrichr/).33,34 kasutati nende valkude funktsionaalset tõlgendust, annotatsiooni, visualiseerimise ja integreeritud avastamise andmebaasi (DAVID Bio informatic Recourses 6.8: https://david.ncifcrf.gov/). Täiendavate bioinformaatiliste analüüside üksikasjad on kirjeldatud täiendavates meetodites. Statistika Tulemused on väljendatud keskmise SEM-ina. Mitteparameetrilised statistilised analüüsid viidi läbi kasutades Prism (tarkvara GraphPad). P < 0,05 loeti statistiliselt oluliseks.

TULEMUSED

Adeniini poolt indutseeritud CKD roti mudel Üksikasjad kõigi uuringurühmade kehakaalu, toidutarbimise ja uriinierituse kohta on esitatud lisajoonistel S1 ja S2. Selle mittediabeetilise kroonilise neeruhaiguse mudeli veresuhkru taset ei muutnud metformiin ega kanagliflosiin võrreldes kandjaraviga (tabel 1). Metformiin peatab neerufunktsiooni languse Krooniline adeniini annustamine põhjustas kandjaga ravitud rottidel raske kroonilise kroonilise neeruhaiguse tekke, mida näitab seerumi kreatiniinitaseme tõus (joonised 2a ja b). See tõus oli oluliselt erinev pärast 4- ja 5-nädalast adeniinist põhjustatud kroonilise neeruhaiguse ravi, mis viitab kahele erineva kroonilise neeruhaiguse raskusastmega ravi alguspunktile (P < {{10}}.0001 Täiendav joonis S3). Neerufunktsiooni progresseeruv langus peatas peaaegu täielikult metformiini manustamisega alates 4. ja 5. nädalast, nagu näitas seerumi kreatiniinitaseme stabiliseerumine vastavalt 8. ja 9. nädalal (P < 0,0001 vs. vehiikul) (joonis 2a ja b). Kreatiniini kliirens kui glomerulaarfiltratsiooni kiiruse mõõt, näitas aja jooksul vehiikuliga ravitud kroonilise neeruhaigusega rottidel vähenemist, samas kui metformiini annustamine vähendas seda langust (P < 0,05 vs. vehiikul; joonised 2c ja d). Ka siin näitas CKD raskuse erinevust kahes lähtepunktis oluliselt vähenenud kreatiniini kliirens pärast 5 nädalat võrreldes 4-nädalase CKD indutseerimisega (P <0, 001; täiendav joonis S3). Kooskõlas neerufunktsiooni häirega ilmnes vehiikuliga ravitud CKD rottidel häiritud mineraalide metabolism. Seerumi fosforisisaldus tõusis märkimisväärselt alates 6. ja 7. nädalast, samas kui kaltsium langes, eriti hilisematel ajahetkedel. Metformiinravi tühistas ka need häired (tabel 2).

Tabel 1|Vere glükoosisisaldus adeniinist põhjustatud kroonilise neeruhaiguse mittediabeetiliste rottide mudelis, keda raviti metformiini, kanagliflosiini või kandjaga, 4 või 5 nädalat pärast kroonilise neeruhaiguse esilekutsumist 4 nädala jooksul

Metformiin peatab CKD histoloogilise progresseerumise Adeniiniga toidetud kroonilise neeruhaigusega rottidel esines torukujulise harja piiride kadu, basaalmembraani paksenemine ja tubulite laienemine, mis kõik nõrgenesid metformiinravi korral (joonis 3a). Võrreldes normaalse neerufunktsiooniga kontrollloomadega suurenes interstitsiaalse pindala protsent 4. ja 5. nädalal pärast kroonilise neeruhaiguse esilekutsumist vastavalt 2- ja 23- korda (joonis 3b ja 3c). Nende leidude põhjal suurenes fibrootilise markeri Col1a1 mRNA ekspressioon viimastel ajahetkedel märkimisväärselt (joonis 3d ja e). Erinevalt vehiikuliga ravist ei täheldatud metformiinravi alguse (vastavalt 4. ja 5. nädal) ja uuringu lõpu (vastavalt 8. ja 9. nädal) vahel interstitsiaalse pindala protsendi olulist suurenemist, mis tõendab metformiini võimet nõrgendada edasist interstitsiaalset laienemist ja histopatoloogilist lagunemist. Neid leide tugevdas profibrootilise võtmetsütokiini TGFb ekspressiooni mõõtmine, mis oli metformiiniga ravitud loomadel oluliselt madalam kui kandjaga ravitud loomadel (joonis 3f ja g).

Mis puudutab põletikku, siis 4-nädalane vehiikuliga ravi põhjustas uuringu lõpus (st 8. ja 9. nädalal) oluliselt suurenenud Cd45 ekspressiooni võrreldes normaalse neerufunktsiooniga kontrollrottidega (joonis 4a). See Cd45 ekspressiooni suurenemine peatus märkimisväärselt (P < 0.01), kui metformiini manustati pärast 5-nädalast adeniinist põhjustatud kroonilise neeruhaiguse kestust (joonis 4c). Samamoodi põhjustas metformiinravi, mida alustati pärast 5-nädalast adeniinist indutseeritud kroonilise neeruhaiguse kestust, põletikulise tsütokiini Tnfa oluliselt madalamat ekspressiooni uuringu lõpus võrreldes kandjaga ravitud loomadega samal ajahetkel (P < 0,01; joonis). 4d ja e). Sarnaseid tulemusi nähti ka Cd68 ekspressiooniga, mis viitas makrofaagide infiltratsiooni pärssimisele (joonis 4f ja g).

Tabel 2|Mineraalide metabolismi seerumi parameetrid adeniinist põhjustatud kroonilise neeruhaiguse mittediabeetilise roti mudelis, keda raviti metformiini või vehiikuliga, 4 või 5 nädalat pärast kroonilise neeruhaiguse esilekutsumist 4 nädala jooksul

Mis puudutab põletikku, siis 4-nädalane vehiikuliga ravi põhjustas uuringu lõpus (st 8. ja 9. nädalal) oluliselt suurenenud Cd45 ekspressiooni võrreldes normaalse neerufunktsiooniga kontrollrottidega (joonis 4a). See Cd45 ekspressiooni suurenemine peatus märkimisväärselt (P < 0.01), kui metformiini manustati pärast 5-nädalast adeniinist põhjustatud kroonilise neeruhaiguse kestust (joonis 4c). Samamoodi põhjustas metformiinravi, mida alustati pärast 5-nädalast adeniinist indutseeritud kroonilise neeruhaiguse kestust, põletikulise tsütokiini Tnfa oluliselt madalamat ekspressiooni uuringu lõpus võrreldes kandjaga ravitud loomadega samal ajahetkel (P < 0,01; joonis). 4d ja e). Sarnaseid tulemusi nähti ka Cd68 ekspressiooniga, mis viitas makrofaagide infiltratsiooni pärssimisele (joonis 4f ja g). Laktatsidoosi risk on väljakujunenud kroonilise neeruhaiguse korral metformiinravi ajal juhitav Kuigi metformiinravi näitas võimet aeglustada juba väljakujunenud kroonilise neeruhaiguse progresseerumist, tuleb märkida, et metformiiniga ravitud loomadel leiti suurem suremus (joonis 5). Sellegipoolest kohandati laktatsidoosi ehk laktaaditaseme tõusuga võitlemiseks ja selle leevendamiseks metformiini annust (vt Meetodid), mille tulemuseks oli väärtuste vähenemine uuringu lõpus (joonis 6).