Phoenix Dactylifera L. seemneekstraktil on antioksüdantne toime ja see nõrgendab melanogeneesi

Huey-Chun Huang1 , Shr-Shiuan Wang2, Tsang-Chi Tsai3, Wang-Ping Ko3 ja Tsong-Min Chang2,*

Abstraktne:Taust: Phoenix dactylifera seemneekstrakti toimemehhanismi nahahoolduses pole kunagi uuritud. Meetodid: P. dactylifera L. seemned ekstraheeriti ultraheli ekstraheerimisega. Ekstrakti antioksüdantsed omadused määrati 2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüüli (DPPH) ja 2,2'-asino-di-(3-etüülbenstiasoliinsulfoonhappe) (ABTS pluss) abil. analüüsid ja puhastusmeetodid. Uuriti ka fenooli kogusisaldust, redutseerimisvõimet, raua (II) ioonide kelaatimist ja rakusiseseid reaktiivseid hapnikuühendeid (ROS) püüdvaid võimeid. P. dactylifera L. seemneekstrakti mõju melanogeneesile hinnati spektrofotomeetriliselt seente türosinaasi aktiivsuse analüüsi, rakusisese türosinaasi aktiivsuse ja melaniini sisalduse määramisega. Melanogeneesiga seotud valkude ekspressioonitasemeid analüüsiti Western blot analüüsiga. Tulemused: tulemused näitasid, et P.dactylifera L.seemneekstrakt avaldas näilist antioksüdantset võimet ja vähendas oluliselt intratsellulaarset ROS-i sisaldust kontsentratsioonidel {{0}},245 ja 0,49 (mg/ml). Lisaks vähendas ekstrakt melanokortiin 1 retseptori (MC1R), mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktori (MITF), türosinaasi, türosinaasiga seotud valgu -1 (TRP1) ja türosinaasiga seotud valgu-2 ekspressiooni ( TRP2) ja inhibeeris melanogeneesi B16F10 rakkudes. Järeldused: Meie tulemused näitasid, et P. dactylifera L. seemneekstrakt nõrgendas melanogeneesi B16F10 rakkudes, vähendades proteiinkinaasi A (PKA) signaaliülekande radu. Seetõttu võib ekstrakti kasutada nahahooldustoodetes nahka valgendava ainena.

Märksõnad: Phoenix dactylifera;türosinaas; melaniin; ROS; PKA

cistanche pharma erilineon teatud tüüpi nahka valgendav aine.

1. Sissejuhatus

Antioksüdante on laialdaselt kasutatud oksüdatiivse stressiga seotud häirete ennetamiseks või raviks kosmeetikas ja dermatoloogias. Viimase paarikümne aasta jooksul on antioksüdante kasutatud ka kosmeetikatööstuses naha vananemise ennetamiseks või edasilükkamiseks. On teatatud, et vabad radikaalid ja reaktiivsed hapniku liigid (ROS) on seotud mitmete haigustega, nagu vananemine ja vanusega seotud haigused [1]. Huvitav on see, et UV-kiirguse stressist ja ROS-ist põhjustatud vabade radikaalide kahjustused nahal mängivad olulist rolli naha fotovananemise protsessis [2,3]. Teatavasti häirivad antioksüdandid oksüdatsiooniprotsessi, eemaldades vabu radikaale ja ROS-i või kelaatides oksüdatsiooni-katalüütilisi metalle [4]. Seetõttu on oksüdatiivse stressi või oksüdatiivsest stressist põhjustatud kehakahjustuste vähendamiseks antioksüdantide või antioksüdantsete toidulisandite kasutusalade arv dramaatiliselt kasvanud [5,6]. Siiski on näidatud, et mõned keemilised antioksüdandid, sealhulgas naatriumaskorbaat, tert-butüülhüdroksüanisool (BHA), naatriumerütorbaat ja tert-butüülhüdroksütolueen (BHT), soodustavad kantserogeenset mõju inimeste tervisele [7]. Seetõttu on viimastel aastakümnetel toimunud taimsete looduslike antioksüdantide uuringute kiire kasv. Oluline on see, et leiti, et ROS-i taseme tõus võib kiirendada naha pigmentatsiooni. Melanotsüütidest ja keratinotsüütidest pärinevate ROS-ide hulgas stimuleerib lämmastikoksiid NO melaniini sünteesi, suurendades türosinaasi ja türosinaasiga seotud valgu 1 (TRP1) valgu ekspressioonitaset [8, 9]. ROS-i mõju melaniini tootmisele on uuritud erinevate antioksüdantide, nagu N-atsetüültsüsteiini, abil, et kaotada UVB-indutseeritud melanotsüüte stimuleeriva hormooni (-MSH) toime [10].

Melaniini toodavad ja sekreteerivad melanotsüüdid, mis jaotuvad naha epidermise basaalkihis [11]. Inimestel toimuva melanogeneesi raja kaks esimest etappi on L-türosiini hüdroksüülimine 3-4-dihüdroksüfenüülalaniiniks (L-DOPA) ja L-DOPA oksüdeerimine o-dopakinooniks. Türosinaas (EC 1.14.18.1) on kiirust piirav ensüüm, mis katalüüsib melanogeneesi käigus kahte esimest reaktsiooni [12]. Melaniin mängib olulist rolli naha kaitsmisel päikesevalguse ultraviolettkiirguse (UV) kahjustuste eest ning vastutab ka juuste, naha ja silmade värvimise eest. On teatatud, et epidermise melaniini liigsest kogunemisest tulenevad mitmesugused dermatoloogilised häired, nagu vanuselaigud, melasma, põletikujärgne melanoderma, tedretäpid ja aktiinikahjustuse kohad [13]. Melaniini sünteesi inhibiitoreid on üha enam kasutatud nahahooldustoodetes naha hüperpigmentatsioonihäirete raviks või ennetamiseks [14,15]. Lisaks on hüperpigmentatsiooni ravis kasutatud antioksüdante, nagu arbutiin või kojhape [16]. Viimasel ajal on suure osa kosmeetikatoodetest moodustanud nahka valgendav kosmeetika. Neid nahka valgendavaid tooteid ei kasuta laialdaselt mitte ainult tumeda nahaga naised, vaid ka need, kes püüavad toime tulla UV-kiirguse, raseduse või kõrgenenud vanuse tõttu tekkinud tumedate laikudega nahal.

Melanogeneesi reguleerivad mitmed tegurid. Näiteks teatati, et türosinaasiga seotud valk -1 (TRP1), mikroftalmiaga seotud transkriptsioonifaktor (MITF) ja türosinaasiga seotud valk-2 (TRP2) reguleerivad melaniini tootmist [18–20 ]. Melanokortiin 1 retseptor (MC1R) on samuti oluline -MSH-indutseeritud melaniini sünteesis [21]. Melaniini tootmisel on mitu signaaliülekande teed. Erinevate melaniini tootmist reguleerivate signaaliradade hulgas mängib melanogeneesi reguleerimisel olulist rolli tsükliline AMP (cAMP) vahendatud proteiinkinaasi A (PKA) aktivatsioon [22]. cAM-PKA signaaliülekande rajal indutseerib cAMP PKA [23] aktivatsiooni, millele järgneb cAMP vastuselementi siduva valgu (CREB) fosforüülimine. CREB on intratsellulaarne transkriptsioonifaktor, mis stimuleerib melanogeneesis olulise mikroftalmiafaktori (MITF) geeni ekspressiooni. MITF on transkriptsioonifaktor, mis seondub melanogeensete geenide türosinaasi, TRP1 ja TRP2 promootorpiirkondadega, reguleerides nende ekspressiooni [24,25]. Seejärel suureneb rakusisene melaniini sisaldus [26]. On teatatud, et -MSH suurendab cAMP taset ja seda kasutatakse tavaliselt CREB fosforüülimise aktiveerimiseks ja seejärel MITF valgu taseme tõstmiseks [27].

MITF-i ekspressiooni reguleerivad mitmed signaalirajad. c-Jun N-terminaalne kinaas (JNK) ja p38 mitogeeniga aktiveeritud proteiinkinaas (MAPK) osalevad MITF-i ekspressiooni aktiveerimises ja sellest tulenevas suurenenud türosinaasi ekspressioonis. Ekstratsellulaarse reageeriva kinaasi (ERK) aktiveerimissignaalid suurendavad ka CREB-i fosforüülimist ja sellele järgnevat MITF-i ekspressiooni, mis moduleerib melaniini sünteesi [28,29]. Seega teatati, et mitmed nahka valgendavad ained inhibeerivad MITF-i transkriptsiooni aktiivsust, vähendades türosinaasi, TRP1 ja TRP2 valgu ekspressioonitasemeid p38MAPK-vahendatud MITF-i fosforüülimise allareguleerimise kaudu. Lisaks on kirjeldatud, et ERK rada osaleb melanogeneesi ajal MITF-i regulatsioonis [30, 31]. ERK aktiveerimine fosforüleerib MITF-i, mis viib MITF-i lagunemiseni, mille tulemuseks on melaniini sisalduse vähenemine [32, 33].

Oksüdatiivne stress võib olla kas ROS-i ületootmise või vähenenud antioksüdantide kaitse tagajärg [1]. Looduslike antioksüdantide otsimine ja rakendused on jätkuvalt paljude uurimisrühmade fookuses üle kogu maailma. Viimasel ajal on kasvanud huvi fütokemikaalide, nagu looduslikud antioksüdandid ja erinevatest looduslikest allikatest pärit fenoolühendid, uurimis- ja arendustegevuse vastu, mida saaks kasutada toitainetena, vananemisvastase kosmeetika ja ravimitena [34]. Phoenix dactylifera L. on üks peamisi Lähis-Idas ja Põhja-Aafrikas kasvatatavaid puuviljakultuure [35,36]. Varasemad uuringud on teatanud, et P. dactylifera L. viljadel on antioksüdantne, vabu radikaale püüdev, antimikroobne ja põletikuvastane toime [37,38]. P. dactylifera L. funktsionaalne toime ei piirdu ainult viljade endiga, vaid ka nende seemnetega, mis on omamoodi viljade kõrvalsaadus [39,40]. Tänu oma antioksüdantsetele omadustele võivad P. dactylifera L. seemneekstraktid olla antioksüdantsete ainete allikaks, mis toimivad oksüdatiivse stressi vastu [41–43]. Siiski on P. dactylifera L. seemnete kasutamise kohta kosmeetikatoodete väljatöötamiseks tehtud vähe uuringuid. Need seemned visatakse tavaliselt ära jäätmetena, kuid siin on rõhutatud nende tähtsust funktsionaalse kosmeetilise koostisainena. Siiani ei ole P. dactylifera L. seemneekstrakti toimemehhanismi kohta nahahoolduskosmeetika valdkonnas teateid ega seemneekstrakti mõju kohta melaniini tootmisele. Käesoleva uuringu keskmes oli P. dactylifera L. seemneekstrakti potentsiaali määramine melanogeneesi inhibiitorina kosmeetikatööstuses.

P. dactylifera L. seemneekstrakti melanogeneesi inhibeeriva toime aluseks olevaid mehhanisme ei ole veel uuritud. Käesoleva uuringu eesmärk oli uurida P. dactylifera L. seemneekstrakti antioksüdantseid omadusi ja võimalikke toimemehhanisme melanogeneesil, uurides MAPK ja PKA signaaliradade MITF transkriptsiooni regulaatoreid ning regulaatorite fosforüülimist.

värske tsitanche

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Kemikaalid ja reaktiivid

Uuringus kasutatud keemilised reaktiivid osteti firmalt Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MS, USA). Antikehad pärinesid ettevõttest Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA) ja ECL reaktiiv pärines Milliporest (Billerica, MA, USA).

2.2. P. dactylifera seemneekstrakti valmistamine ja ekstraheerimine

Kuivatatud P. dactylifera L. viljad koguti 2019. aastal Saudi Araabias Medina Citys asuvatest traditsioonilistest kauplustest. P. dactylifera L. seemned pesti täielikult, pandi päikesevalguse kätte, kuivatati õhu käes üks päev ja seejärel kuivatati ahjus 80 ◦C juures 2 tundi. Dehüdreeritud seemned jahvatati peeneks pulbriks (silma nr 50) spetsiaalse veskiga (Retsch Ultra Centrifugal Mill and Sieving Machine, tüüp ZM1, Haan, Saksamaa). Pulber koguti suletud klaaspudelisse ja hoiti kuni kasutamiseni temperatuuril 25 ◦C. Pulveriseeritud kuivatatud P. dactylifera L. seemnepulber (2 g) pandi ekstraheerimiskeeduklaasi, mis sisaldas 10 ml destilleeritud vett. Järgmisena viidi ultraheli ekstraheerimine läbi mudeliga ULTRAsonikTM 57H (250 W, C ja A Sales Industrial Supplies, Yucaipa, CA, USA). Töösagedus oli 45 kHz 30 minuti jooksul. Pärast ekstraheerimist tsentrifuugiti proove kiirusel 4500 pööret minutis 50 minutit temperatuuril 25 °C Eppendorf Centrifuge 5810 R-ga (Hamburg, Saksamaa). Supernatandid koguti ja filtriti nailonfiltriga (pooride suurus: 0,45 μm) ja filtraat kontsentreeriti kontsentratsioonini 9,8 mg/ml.

2.3. P. dactylifera seemneekstrakti ja feruulhappe üliefektiivne vedelikkromatograafia (UPLC) analüüs

P. dactylifera seemneekstrakti analüüsiti ACQUITY UPLC H klassi fotodioodide massiividetektoriga (Waters, Milford, MA, USA). Kolonn oli ACQUITY UPLC BEH C18 kolonn, 130 Å, 1,7 μm, 2,1 mm × 100 mm. Liikuv faas A oli 0,5 protsenti äädikhapet ja liikuv faas B oli atsetonitriil. Ajapunktide 0 ja 5 min puhul oli A/B protsentuaalne suhe 95/5; 20 minuti jooksul oli A/B protsentuaalne suhe 5/95; ajapunktide 21 ja 25 min puhul oli A/B protsentuaalne suhe 95/5. Positiivse standardina kasutati feruulhapet (1 ppm).

2.4. DPPH eemaldamisaktiivsuse analüüs

Selles testis kasutati antioksüdantide standarditena C-vitamiini ({0}},5 mg/ml) ja BHA-d (0,1 mg/mL). P. dactylifera L. seemneekstrakt erinevates kontsentratsioonides (0.0049, 0,0245 ja 0,049 mg/mL) lisati 2,9 ml DPPH (60 μM) lahusele. Seemneekstrakti antioksüdantsed komponendid võivad anda vesinikku DPPH-le ja muuta DPPH redutseeritud vormiks. Sellest tulenev neeldumise vähenemine 517 nm juures registreeriti UV-Vis spektrofotomeetriga [44].

2.5. ABTS pluss puhastusvõimsuse test

P. dactylifera L. seemneekstrakti ABTS pluss puhastusvõimet võrreldi C-vitamiini ({{0}},9 mg/ml) ja BHA ({{10}}) omaga. 9 mg/ml). Selle analüüsi jaoks kasutati ABTS plus. Katioon valmistati kõigepealt ABTS-i lahuse (7 mM) reageerimisel kaaliumpersulfaadiga (2,45 mM) ja segul lasti enne kasutamist vähemalt 6 tundi pimedas seista. Neeldumist 734 nm juures mõõdeti 1 0 min pärast seemneekstrakti erinevate kontsentratsioonide (0,0098, 0,049 ja 0,098 mg/ml) segamist 1 ml ABTS pluss lahusega [45].

2.6. Üldfenoolisisalduse määramine

Fenooli üldsisaldus määrati Folin-Ciocalteu reagendiga [46] ja positiivse standardina kasutati gallushapet (2 ug/ml). P. dactylifera L. seemneekstrakti (0.0196, 0.098 ja 0,196 mg/ml) erinevad kontsentratsioonid valmistati 80% metanoolis; 100 μL ekstrakti viidi katseklaasi ja lisati 0,5 ml Folin-Ciocalteu reaktiivi (eelnevalt 10--kordselt lahjendatud deioniseeritud veega) ja segati. Segul lasti 5 minutit toatemperatuuril seista; Lisati 1,5 ml 20% naatriumkarbonaati. Pärast 2-tunnist toatemperatuuril seismist loeti neelduvus lainepikkusel 760 nm, kasutades UV-Vis spektrofotomeetrit.

2.7. Vähendamisvõimsuse määramine

Selles testis kasutati positiivsete standarditena C-vitamiini ({0}}.008 mg/mL) või BHA-d (4,8 mg/ml). Seemneekstrakti redutseerimisvõime määrati Oyaizu [47] kirjeldatud meetodil. Erinevates kontsentratsioonides P. dactylifera L. seemneekstrakti (0.0073, 0,036, 0,073 mg/mL) segati fosfaatpuhvriga (2,5 ml, 0,2 M, pH 6,6). ) ja kaaliumferritsüaniid [K3Fe (CN)6] (2,5 ml, 1 massiprotsent). Segu inkubeeriti temperatuuril 50 °C 20 minutit. Segule lisati trikloroäädikhape (2,5 ml, 10 massiprotsenti) ja seejärel tsentrifuugiti 10 minutit 1000 × g juures. Lahuse ülemine kiht (2,5 ml) segati destilleeritud vee (2,5 ml) ja FeCl3-ga (0,5 ml, 0,1 massiprotsenti) ning mõõdeti neeldumine lainepikkusel 700 nm.

2.8. Raua (II) ioonide kelaatimise võime mõõtmine

P. dactylifera L. seemneekstrakti, EDTA (0.02, 0.04 ja {) Fe2 pluss-ioonide kelaatimise võime mõõtmiseks Positiivse standardina kasutati {10}.08 mg/ml). FeCl2 lahusele (0,05 ml, 1 mM) lisati seemneekstrakti erinevad kontsentratsioonid (0,0196, 0,098 ja 0,196 mg/ml). Reaktsioonisegu pandi reageerima ferrosiiniga (0,1 ml, 1 mM), seejärel kvantifitseeriti segu metanooliga mahuni 1 ml ja inkubeeriti 25 °C juures 10 minutit. Reaktsioonisegu neeldumist mõõdeti lainepikkusel 562 nm [48].

2.9. Rakkude elujõulisuse test

Rakkude elujõulisuse test viidi läbi MTT meetodil [49]. Rakke eksponeeriti erineva kontsentratsiooniga P. dactylifera L. seemneekstraktiga (0.049, 0,245 ja 0,49 mg/ml) 24 tundi temperatuuril 37 ◦C ja 5% CO2 niisutatud inkubaatoris ja MTT lahus lisati süvenditesse. MTT lahustumatu derivaat lahustati etanooli-DMSO-ga (1:1 segulahus). Süvendite neeldumist 570 nm juures mõõdeti mikroplaadilugejaga. B16F10 rakud (BCRC60031) saadi Bioresource Collection and Research Centerist (BCRC), Hsinchu linn, Taiwan. Rakke hoiti DMEM-is (Hyclone, Logan, UT, USA), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit ja 1 protsenti antibiootikume. Lisaks hinnati trüpaansinise välistamistesti meetodil ka P. dactylifera L. seemne mõju B16F10 rakkude elujõulisusele. Pärast töötlemist seemneekstraktiga rakud trüpsiiniti ja tsentrifuugiti, et koguda pellet. Rakupellet suspendeeriti uuesti 300 µl DMEM rakukultuuri söötmes. Väike rakususpensiooni alikvoot (20 μL) segati õrnalt 10 μL trüpaansinisega (4 protsenti PBS-is). Rakkude arv loendati (mitteelujõulised rakud olid sinised ja elujõulised rakud värvimata), kasutades mikroskoobi all hemotsütomeetrit.

2.10. Seene türosinaasi aktiivsuse mõõtmine

Seene türosinaasi lahus (10 μL, 200 ühikut) lisati 96-süvendiga mikroplaadile. Reaktsioonisegu sisaldas 5 mM L-DOPA-d, mis oli lahustatud fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS) (50 mM, pH 6,8) ja P. dactylifera L. seemneekstrakti (0.049, 0,245). ja 0,49 mg/ml), kojhapet (200 mM; 0,03 mg/ml) või arbutiini (2 mM; 0,54 mg/ml). Analüüsisegu inkubeeriti 37 °C juures 30 minutit ja tekkinud dopakroomi neeldumist mõõdeti 490 nm juures. Seene türosinaasi aktiivsuse mõõtmine viidi läbi nagu eelnevalt kirjeldatud [50].

2.11. Melaniini sisalduse määramine

B16F10 rakke töödeldi -MSH-ga (100 nM) 24 tundi ja seejärel kas P. dactylifera L. seemneekstraktiga (0,0245–0,147 mg/ml). või arbutiini (0,54 mg/ml) veel 24 tundi. Pärast töötlemist solubiliseeriti rakupelletid NaOH lahuses (1 N) temperatuuril 60 °C 60 minutit. Melaniini sisaldus tuvastati 405 nm juures, nagu Tsuboi [51] varem kirjeldas.

Cistanche pärsib melaniini tootmist.

2.12. Intratsellulaarse türosinaasi aktiivsuse mõõtmine

Intratsellulaarne türosinaasi aktiivsus määrati eelnevalt kirjeldatud viisil [52]. Rakke töödeldi 24 tundi -MSH-ga (100 nM) ja seejärel P. dactylifera L. seemneekstraktiga (0.0245–0,147 mg). /mL) või arbutiini (0,54 mg/ml) 24 tunni jooksul. Pärast töötlemist segati rakuekstraktid (100 µl) värskelt valmistatud L-DOPA lahusega (0,1 protsenti PBS-is) ja inkubeeriti temperatuuril 37 °C ning mõõdeti neeldumine 490 nm juures.

2.13. Western blottimise katse

Rakke töödeldi P. dactylifera L. seemneekstraktiga ({{0}}.0245, 0.0368, 0). {14}}49 ja 0.147 mg/mL) või arbutiini (0,54 mg/ml) ja seejärel lüüsiti PBS-is, mis sisaldab mittedieetilist P-40 (1 protsenti), naatriumdesoksükolaati (0,5 protsenti), naatriumdodetsüüli sulfaat (SDS, 0,1 protsenti), aprotiniin (5 ug/ml), fenüülmetüülsulfonüülfluoriid (100 ug/ml), pepstatiin A (1 ug/mL) ja EDTA (1 mM) temperatuuril 4 °C 20 minutit. Lüsaatide koguhulk kvantifitseeriti, kasutades mikro-BCA komplekti (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Valgud (30 ug) lahutati SDS-polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga ja kanti elektroforeetiliselt polüvinülideenfluoriidmembraanile. Membraan blokeeriti 5% rasvavaba piimaga PBST-s (PBS koos 0,05% Tween{28}}) ja inkubeeriti öö läbi temperatuuril 4 ◦C järgmiste PBST-s lahjendatud primaarsete antikehadega: MITF Ab (1:1000), TRP1 Ab (1:6000), TRP2 Ab (1:1000), MC1R Ab (1:500), GAPDH Ab (1:1500), türosinaas Ab (1:2000), p-p38 Ab (1:500), p38 Ab (1:500), p-JNK Ab (1:500), JNK Ab (1:500), p-ERK Ab (1:500), ERK Ab (1:500), p-CERB Ab (1: 500) ja CERB Ab (1:200), kõik firmalt Santa Cruz Biotech (Dallas, TX, USA)). Seondunud antikehad tuvastati mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud sekundaarse antikehaga (Amersham Corp.), millele järgnes ECL tuvastamise süsteem (Amersham) vastavalt tootja juhistele.

2.14. PKA inhibiitorite analüüs

Rakke töödeldi -MSH-ga (100 nM) 24 tundi, millele järgnes 1 tunni jooksul 10 µM PKA regulaatori H89 lisamine. Pärast töötlemist lisati rakkudele P. dactylifera L. seemneekstrakt (0,147 mg/ml) ja H89 ning inkubeeriti veel 23 tundi. Melaniini sisaldus määrati ülalkirjeldatud viisil.

2.15. Statistiline analüüs

Statistiline analüüs viidi läbi Tukey post hoc testiga, mida kasutati mõõdetud andmete võrdlemiseks, kasutades sotsiaalteaduste statistilise paketi (SPSS) versiooni 22.0 statistikatarkvara (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). * p < 0.05="" peeti="" oluliseks,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p=""><>

3. Tulemused

3.1. P. dactylifera L. seemneekstrakti UPLC analüüs

UPLC analüüsi tulemused on näidatud joonistel 1A ja B. Joonisel 1A on kujutatud P. dactylifera L. seemneekstrakti ja feruulhappe kattunud piigid lainepikkusel 330 nm. Joonisel fig 1B on P. dactylifera L. seemneekstrakti ja feruulhappe sarnased skaneerimisspektrid vahemikus 220 kuni 500 nm.

3.2. P. dactylifera L. seemneekstrakti antioksüdantsed omadused

P. dactylifera L. seemneekstrakti antioksüdantne toime in vitro näitas antioksüdantse potentsiaali olemasolu. DPPH testis C-vitamiini ({0}}.05 mM; 0,53 mg/mL) ja tert-butüülhüdroksüanisooli (BHA) (0 0,1 mg/mL) kasutati positiivsete antioksüdantide standarditena. Ekstrakti DPPH eemaldamisvõime oli 49,97 ± 2,9 protsenti, 81,36 ± 0,56 protsenti ja 78,53 ± 3,83 protsenti kontrollist ekstrakti kontsentratsioonide 0 puhul.0{{ 31}} vastavalt 49, 0,0245 ja 0,049 (mg/mL). Võrdluseks, C-vitamiini ja BHA eemaldamisvõime oli vastavalt 90,12 ± 0,31 protsenti ja 90,44 ± 0,49 protsenti (joonis 2A).

See ABTS-i radikaalkatioon on sinist värvi ja reageerib enamikule antioksüdantidele. Selle reaktsiooni käigus muudetakse sinine ABTS-i radikaalkatioon tagasi oma värvituks neutraalseks vormiks. Reaktsiooni jälgiti spektrofotomeetriliselt. Ekstrakti ABTS pluss puhastusvõime oli 5,69 ± 1,36 protsenti, 18,81 ± 0,68 protsenti ja 66,82 ± 8,51 protsenti kontrollist kontsentratsioonidel 0.0{{16 }}98, 0.{{20}}49 ja 0,098 mg/ml. Seevastu ABTS pluss C-vitamiini (0,9 mg/ml) ja BHA (0,9 mg/ml) eemaldamisvõime oli vastavalt 95,52 ± 0,12 protsenti ja 40,3 ± 0,83 protsenti. Tulemused joonisel 2B näitavad, et seemneekstrakt eemaldab märkimisväärse koguse ABTS pluss radikaali.

P. dactylifera L. seemneekstrakti fenooli üldsisalduse määramiseks kasutati positiivse standardina gallushapet (2 ug/ml). Tulemused joonisel 2C näitavad, et kogu fenoolisisaldus ühikutes 0.0196, 0.{{20}}98 ja 0. 196 (mg/mL) ekstrakti oli vastavalt 33,43 ± 2,33 protsenti, 117,22 ± 7,81 protsenti ja 195,4 ± 10,91 protsenti. Ülalnimetatud seemneekstraktide kontsentratsioonide gallushappe ekvivalendid (GAE) olid vastavalt 0.068 ± 0,01, 0,365 ± 0,01 ja 0,642 ± 0,03 (joonis 2C).

3.3. P. dactylifera L. seemneekstrakti pärssiv toime melanogeneesile

Joonisel 4A näidatud tulemused näitavad, et 0,049 mg/ml P. dactylifera L. seemneekstraktiei avaldanud seene türosinaasi aktiivsust pärssivat toimet. Teisest küljest olid ensüümi inhibeerimise protsendid 8,34 ± 2,67 protsenti ja 33 ± 2,36 protsenti kontrollist 0,245 ja 0,49 mg/mlP. dactylifera L. seemneekstraktiga töötlemine. Lisaks koojihappe (200 μM; 0.03 mg/mL) ja arbutiini (2 mM; 0,54 mg/mL) türosinaasi inhibeerimise protsendid ) olid vastavalt 56,26 ± 5,06 protsenti ja 64,56 ± 2,88 protsenti kontrollist (joonis 4A). Seega võivad P. dactylifera L. seemneekstrakti kõrgemad kontsentratsioonid (0,245 ja 0,49 mg/ml) esindada seene türosinaasi inhibeerivat taset.

Joonisel 4B on tulemused näidanud, et ainult 0,147 mg/ml P. dactylifera L. seemneekstrakt võib oluliselt vähendada melaniini sisaldust B16F10 melanoomirakkudes. Pärast töötlemist oli melaniini sisaldus B16F10 rakkudes 80,66 ± 5,43 protsenti kontrollrühma omast. Positiivse standardi, arbutiini (0,54 mg/ml) puhul oli järelejäänud rakusisene melaniini sisaldus 61,19 ± 8,17 protsenti kontrollrühma omast. Tulemused näitasid, et 0,147 mg/ml P. dactylifera L. seemneekstraktil oli väiksem toime kui arbutiinil. Ülejäänud intratsellulaarse türosinaasi aktiivsuse väärtused olid P. dactylifera L. seemneekstrakti 0,098 ja 0,147 mg/ml puhul vastavalt 85,1 ± 8,1 protsenti ja 73,7 ± 11,9 protsenti. Järelejäänud intratsellulaarne türosinaasi aktiivsus oli 64,3 ± 14,9 protsenti kontrollist pärast rakkude töötlemist arbutiiniga (joonis 4C). Tulemused näitasid, et P. dactylifera L. seemneekstrakti kõrgematel kontsentratsioonidel oli siiski väiksem inhibeeriv toime -MSH-indutseeritud türosinaasi aktiivsusele B16F10 rakkudes kui arbutiinil.

3.4. P. dactylifera L. seemneekstrakt pärsib melaninogeneesis osalevate valkude ekspressioonitaset

Western blot analüüsi kasutati melanogeneesiga seotud valkude ekspressioonitasemete uurimiseks B16F10 rakkudes (joonis 5A). Tulemused näitavad, et töötlemine erinevate kontsentratsioonidega P. dactylifera L. seemneekstraktiga vähendas MC1R, MITF, türosinaasi, TRP1 ja TRP2 taset. Ekstrakti inhibeeriv toime valgu ekspressioonile ilmnes kontsentratsioonil {{10}},147 mg/ml. MC1R valgu ekspressioonitaseme korduv muutus oli 0,74 ± 0.02; MITF-i puhul oli see {{20}},51 ± 0.03; türosinaasi puhul oli see 0,54 ± 0,26; TRP-1 puhul oli see 0,57 ± 0,15; ja TRP-2 puhul oli see 0,49 ± 0,1 (joonis 5B).

Melanogeneesiga seotud signaalvalkude ekspressioonitasemeid uuriti Western blot'i abil (joonis 5C). Tulemused näitavad, et 0,147 mg/ml P. dactylifera L. seemneekstraktiga töötlemine viis ilmselt p-p38, p-JNK, p-ERK ja p-CREB taseme languseni. P-p38 valgu ekspressioonitaseme korduv muutus oli 0,88 ± 0,15; p-JNK puhul oli see 0,68 ± 0,39; p-ERK puhul oli see 0,65 ± 0,23; ja p-CREB puhul oli see 0,44 ± 0,07 (joonis 5D).

3.5. P. dactylifera L. seemneekstrakt ei mõjuta türosinaasi, TRP1, TRP2 ega MITF geeniekspressiooni

Melanogeneesiga seotud valkude, nagu türosinaas, TRP1, TRP2 ja MITF, geeniekspressioonitasemeid uuriti kvantitatiivse reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-PCR) abil. Türosinaasi/GAPDH suhtelised normaliseeritud ekspressioonitasemed P jaoks 0.0367, 0.049 ja 0.147 mg/ml. dactylifera L. seemneekstraktiga töötlemine oli vastavalt 3,51 ± 0,52, 2,38 ± 0,24 ja 1,64 ± 0,55. TRP-1/GAPDH puhul suhtelised normaliseeritud avaldisetasemed väärtustele 0.0367, 0.049 ja {{4{{43} }}}.147 mg/mL P. dactylifera L. seemneekstraktiga töötlemisel olid 1,64 ± 0,2, 1,15 ± 0.02 ja 0. 89 ± 0.07. TRP-2/GAPDH suhtelised normaliseeritud ekspressioonitasemed: 0.0367, 0.049 ja 0,147 mg /mL P. dactylifera L. seemneekstraktis olid vastavalt 1.08 ± 0,13, 0,85 ± 0,01 ja 0,7 ± 0,05. MITF/GAPDH puhul olid suhtelised normaliseeritud ekspressioonitasemed P. dactylifera L. seemneekstraktiga töötlemisel 0,0367, 0,049 ja 0,147 mg/ml vastavalt 1,48 ± 0,19, 1,03 ± 0,02 ja 0,74 ± 6 (Figure 0,05).

4. Arutelu

On teatatud, et melanogenees suurendab raku oksüdatiivset stressi. Lisaks võivad mitmed antioksüdandid, ROS-i püüdjad, inhibiitorite püüdjad ja inhibiitorid pärssida UV-vahendatud melaniini sünteesi [54]. Seetõttu on antioksüdante, ROS-i püüdjaid ja melanogeneesi inhibiitoreid üha enam kasutatud nahka valgendavas kosmeetikas, et vältida soovimatut naha hüperpigmentatsiooni [14]. Samuti leiti, et endogeense antioksüdandi metallotioneiini stimuleerimine võib pärssida melanogeneesi melanotsüütides [55]. Inimese nahk puutub sageli kokku oksüdeerivate saasteainete või UV-kiirgusega ning seda kahjustavad välised keskkonnategurid. Eelkõige on teatatud, et UV-kiirgus kutsub esile ROS-i tekke nahas ja soodustab rakumembraani lipiidide peroksüdatsiooni [56]. Oksüdatiivse stressi vastu võitlemiseks on nahk varustatud spetsiaalsete antioksüdantide süsteemidega [57].

P. dactylifera L. seemneekstrakti antioksüdantse aktiivsuse selgitamiseks määrati DPPH ja ABTS pluss radikaale püüdev aktiivsus, ekstrakti fenooli üldsisaldus, redutseerimisvõime ja metalliioonide kelaatimise võime, nagu eelnevalt kirjeldatud [47,48]. P. dactylifera L. seemneekstrakt avaldas kõigis ülalnimetatud analüütilistes uuringutes märkimisväärset antioksüdantset toimet. Tulemused näitasid P. dactylifera L. seemneekstrakti antioksüdantset potentsiaali erinevates vahemikes, millel on erinev tõhusus. Seemneekstrakti DPPH-d püüdev aktiivsus oli näidatud joonisel fig 2A, mis erines joonisel 2B näidatud ABTS plussist, mis võis tuleneda antioksüdantide ja radikaalide interaktsioonide erinevatest mehhanismidest. Lisaks võib seemneekstraktis olevate antioksüdantsete komponentide vaheliste reaktsioonide stöhhiomeetria varieeruda, mille tulemuseks on erinev vabade radikaalide püüdmisvõime [58]. Potentsiaalsed antioksüdandid P. dactylifera L. seemneekstraktis võivad muuta Fe3 pluss/ferritsüaniidi kompleksi raudvormiks ja redutseerimisvõime oli joonisel 2D näidatud seemneekstrakti antioksüdantse aktiivsuse indikaator. Leiti, et kojiinhape [59] toimib türosinaasi inhibiitorina, kuna kojichape toimib metalli kelaatijana, moodustades kelaadi vase ioone ja inhibeerides nende ioonide sisenemist türosinaasi aktiivsesse kohta. Seega võivad seemneekstraktis sisalduvad antioksüdandid moodustada raudioonidega lahustumatuid metallikomplekse ja seejärel pärssida metalliioonide ja lipiidide vahelist koostoimet. Seemneekstrakti suurem metalliioonide kelaatimise võime näitas selle potentsiaalset antioksüdantset aktiivsust ja võimalikku pärssivat toimet türosinaasi aktiivsusele (joonis 2E).

Intratsellulaarse ROS-i analüüsi põhimõte seisneb selles, et DCFH-DA difundeerub läbi rakumembraani ja hüdrolüüsitakse esteraasi toimel ensümaatiliselt DCFH-ks; seejärel reageerib DCFH ROS-iga (nagu H2O2), et saada DCF. DCF kiire tõus näitas DCFH oksüdeerumist rakusiseste radikaalide poolt [60]. Uute antioksüdantide otsimise idee naha valgendamiseks seisneb hüpoteesis, et UV-kiirgusest tulenev oksüdatiivne stress võib kaasa aidata melaniini sünteesi stimuleerimisele. On teatatud, et UV-kiirgus tekitab nahakudedes ROS-i, mis võib türosinaasi aktiveerides indutseerida melaniini tootmist [61]. Lisaks teatati, et mitmed nahka valgendavad ained võivad inhibeerida melanogeneesi, toimides türosinaasi aktiivses kohas vaseoonidega või o-kinoonidega, et blokeerida melaniini sünteesiraja vaheühendite polümerisatsiooni [62]. Lisaks võivad C- või E-vitamiin vähendada juba olemasolevate melaniiniosakeste oksüdatsiooni. Seetõttu on neid vitamiine laialdaselt kasutatud nahka valgendavates toodetes [63]. Huvitaval kombel näitasid meie tulemused P. dactylifera L. seemneekstrakti antioksüdantseid omadusi, mis näitab, et P. dactylifera L. seemneekstrakt võib toimida kosmeetikatoodetes nahka valgendava koostisosana.

MTT test on hästi tuntud kolorimeetriline test, mis mõõdab rakuliste NADH/NADPH-sõltuvate oksidoreduktaasi ensüümide aktiivsust, mis redutseerivad MTT lillavärvilisteks formazaanvärvideks. Seda analüüsi saab kasutada ravimite ja toksiliste materjalide võimaliku tsütotoksilisuse uurimiseks, kuna need ained suurendavad või inhibeerivad rakkude elujõulisust. Joonisel 3A näidatud tulemused olid kooskõlas joonisel fig 3B näidatud trüpaansinise välistamistesti tulemustega, mis näitab, et P. dactylifera L. seemneekstraktil ei olnud tsütotoksilist toimet B16F10 melanoomirakkude elujõulisusele.

Seene türosinaasi kasutatakse tavaliselt sihtensüümina melanogeneesi potentsiaalsete inhibiitorite skriinimiseks. Esmalt leiti, et P. dactylifera L. seemneekstrakti annustamisvahemik ({0}}.049–0,49 mg/ml) võib pärssida seente türosinaasi aktiivsust. Joonisel 4A näidatud tulemused näitavad, et seemneekstraktil oli väiksem inhibeeriv toime seente türosinaasi aktiivsusele kui kojhape. Türosinaas mängib olulist rolli melanogeneesi raja kahes esimeses etapis. Et selgitada välja P. dactylifera L. seemneekstrakti tegelik inhibeeriv toime melaniini tootmisele, määrati B16F10 melaniini sisaldus ja rakusisene türosinaasi aktiivsus. Joonisel fig 4B esitatud tulemused näitavad, et P. dactylifera L. seemneekstrakti kõrgem kontsentratsioon avaldas melaniini moodustumist ilmselt inhibeerivat toimet. Andmed näitasid, et P. dactylifera L. seemneekstrakt blokeerib tõeliselt melanogeneesi melanoomirakkudes. Sellega olid joonisel 4C esitatud tulemused kooskõlas joonisel 4B näidatud tulemustega. Eespool nimetatud rakukatsetes kasutati -MSH-d indutseerijana melaniini sünteesi stimuleerimiseks. Teatati, et -MSH seob melanokortiin 1 retseptorit (MC1R) ja aktiveerib rakusisese adenülaattsüklaasi, mis omakorda katalüüsib ATP cAMP-ks ja aktiveerib cAMP-sõltuva PKA. Tulemused joonisel 5A näitasid, et P. dactylifera L. seemneekstrakt inhibeeris MC1R ekspressiooni, blokeerides seeläbi melaniini tootmist, mis on indutseeritud -MSH-vahendatud intratsellulaarse cAMP ülesreguleerimisega. Lisaks inaktiveeriti cAMP-vahendatud PKA signaalirada ja melanogenees inhibeeriti. Järelduste kinnitamiseks oleme läbi viinud PKA inhibiitori katsed ja joonisel 4D näidatud andmed näitasid, et P. dactylifera L. seemneekstrakti (0,147 mg/ml) pärssiv toime melanogeneesile B16F10 rakkudes oli H{{ alla surutud. 24}}ravi. H89 (N-[2-p-bromotsinnamüülaminoetüül]-5-isokinoliinsulfoonamiid) on selektiivne ja tugev PKA inhibiitor. Tulemused näitavad, et P. dactylifera L. seemneekstrakt mõjutas cAMP-vahendatud PKA signaaliülekannet.

Türosinaas, TRP1 ja TRP2 on kolm peamist ensüümi, mis reguleerivad melaniini sünteesi imetajarakkudes [64]. Lisaks on MITF türosinaasi, TRP1 ja TRP2 peamine transkriptsiooniregulaator ning melanotsüütide pigmentatsiooni kõige olulisem regulaator [65]. Tulemused joonisel fig 5A näitavad, et P. dactylifera L. seemneekstrakt vähendas nende melanogeneesiga seotud valkude valgu ekspressioonitaset, inhibeeris türosinaasi aktiivsust ja vähendas melaniini sisaldust B16F10 rakkudes.

Selles uuringus pärssis P. dactylifera L. seemneekstrakt CREB fosforüülimist ja PKA aktivatsiooni. Need andmed viitavad sellele, et cAMP-PKA rada võib olla vastutav P. dactylifera L. seemneekstrakti poolt indutseeritud melanogeneesivastases protsessis (joonis 5C).

On teatatud, et MAPK-d moduleerivad melanogeneesi [66]. MAPK perekond sisaldab kolme tüüpi proteiinkinaase, sealhulgas ekstratsellulaarne reageeriv kinaas (ERK), c-Jun N-terminaalne kinaas (JNK) ja p38 MAPK. p38 MAPK võib aktiveerida cAMP vastuseelemente siduva valgu (CREB ja CREB aktiveerivad MITF-i ekspressiooni, mis aitab positiivselt kaasa melaniini sünteesile [67]. Joonisel 5C toodud tulemused näitavad, et P. dactylifera L. seemneekstrakt võib inaktiveerida CREB-i, JNK ja p38 inhibeerivad omakorda MITF-i ekspressiooni (joonis 5A). Need tulemused viitavad sellele, et . dactylifera L. seemneekstrakti indutseeritud antimelanogeenset toimet võib vahendada PKA radade allareguleerimine. Lisaks on teatatud, et UV-kiirguse mõju on on silmapaistev mitmete nahahaiguste, sealhulgas ketenduse, kortsude ja hüperpigmentatsiooni esilekutsumisel [68]. Tulemused näitasid, et P. dactylifera L. seemneekstrakt vähendas melaniini tootmist, mida võib seostada rakusisese ROS-i ammendumisega.

Et hinnata P. dactylifera L. seemneekstrakti mõju rakulise melaniini tootmisele, määrasime mRNA tasemed B16F10 rakkudes, mida töödeldi -MSH ja P. dactylifera L. seemneekstraktiga. -MSH-ga töödeldud rakkudes ilmnes ootuspäraselt suurenenud MITF, türosinaasi, TRP-1 ja TRP-2 tase. Huvitaval kombel näitasid P. dactylifera L. seemneekstraktiga töödeldud rakud nende melanogeneesiga seotud geenide mRNA ekspressiooni vähenemist. Siiski ei esinenud veergude vahel statistiliselt olulist erinevust, mis näitas, et P. dactylifera L. seemneekstrakt ei mõjuta MITF-i, türosinaasi, TRP1 ja TRP2 geeniekspressiooni taset.

See on meie toode.

Lisateabe saamiseks klõpsake siin.

On teatatud, et peamine P. dactylifera L. seemnetest leitud fenoolhape on feruulhape [69]. On näidatud, et feruulhape pärsib tõhusalt melaniini sünteesi B16 melanoomirakkudes, inhibeerides annusest sõltuval viisil kaseiinkinaasi 2-indutseeritud türosinaasi fosforüülimist [70]. Need aruanded toetavad meie tulemusi, mis on näidatud joonisel 1 – feruulhape P. dactylifera L. seemne vesiekstraktis aitas kaasa melanogeneesi pärssimisele B16F10 rakkudes. Kindlasti tuleks lähiajal uurida ka teisi seemneekstrakti funktsionaalseid komponente.

Meie tulemused näitasid, et P. dactylifera L. seemneekstrakt inhibeeris melanogeneesi B16F10 rakkudes, vähendades PKA signaaliülekande radu. Seega võib P. dactylifera L. seemneekstrakti kasutada tõhusa nahka valgendava ainena.

5. Kokkuvõtted

See on esimene aruanne P. dactylifera L. seemnevee ekstrakti toimemehhanismi kohta melaniini sünteesis. Käesolev uuring näitas cAMP/PKA/CREB raja osalust P. dactylifera L. seemneekstrakti depigmenteerivas toimes. Meie tulemused näitasid, et P. dactylifera L. seemneekstrakt inhibeeris melanogeneesi B16F10 rakkudes, vähendades PKA signaaliülekande radu. Seega võib P. dactylifera L. seemneekstrakti kasutada uudse dermatoloogilise melanogeneesivastase ainena ja tõhusa nahka valgendava ainena.