Fenüületanoidglükosiidid kutsuvad esile apoptoosi Eca-109 rakkudes mitokondritest sõltuva raja kaudu

Sissejuhatus

Söögitoruvähk on üks levinumaid vähitüüpe, mille haigestumuse määr on maailmas 11. ja suremus 6. kohal ning põhjustas 2015. aastal ~439,000 suremust. Söögitoruvähi esinemissagedus on erinevates piirkondades märkimisväärselt erinev, idapoolsetes piirkondades Aasias ning Ida- ja Lõuna-Aafrikas oli 2012. aastal kõrgeim esinemissagedus ning Lääne-Aafrikas madalaim. Hiinas oli söögitoruvähi juhtude ja suremuse hinnanguline arv vastavalt 477,000 ja 375,000 , 2015. Kuigi söögitoruvähi haigestumus on aastatel 2005–2015 langenud keskmise ja kõrge keskmise sotsiaaldemograafilise indeksiga riikides, jääb suremus halva prognoosi tõttu kõrgeks. Söögitoruvähi raviks on kasutatud kirurgilise resektsiooni kombinatsiooni keemia- või kiiritusraviga, kuid on teatatud, et aastatel 2003–2014 püsis 5-aastane elulemus<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studynäitas sedaCistanche tubulosa fenüületanoidglükosiidid(CTPG) võib pärssida melanoomi B16-F10 rakkude kasvu in vitro ja in vivo (24). Varem kasutatud CTPG halb lahustuvus vees piirab aga ravimi väljatöötamist. Seetõttu kasutati vees lahustuvat CTPG-d (CTPG-W) ja uuriti kasvajavastast toimet söögitoru vähirakkudele (Eca-109). Tehti kindlaks, et CTPG-W võib annusest sõltuvalt inhibeerida Eca-109 rakkude elujõulisust, kutsudes esile apoptoosi mitokondriaalsest sõltuva raja kaudu.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materjalid ja meetodid

Loomad.

Emased C57BL/6 hiired (6-8 nädalat, ~25 g) osteti Pekingi Laboratory Animal Research Centerist (Peking, Hiina) ja neid hoiti kontrollitud temperatuuriga (25˚C) valgustsükliga (12/ 12) Xinjiangi ülikooli loomakeskus (Urumqi, Hiina). Kõik loomad said patogeenivaba vett ja toitu.

Rakuliin ja kultuur.

Inimese söögitoru kartsinoomi rakuliini (Eca-109) säilitas Xinjiangi bioloogiliste ressursside ja geenitehnoloogia võtmelabor (Xinjiangi ülikooli bioteaduste ja tehnoloogia kolledž, Urumqi, Hiina) ja kultiveeriti RPMI-s{{1} } sööde (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), millele on lisatud 10% kuumusega inaktiveeritud veise loote seerumit (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Hiina), 1% L -glutamiin (100 mM), 100 U/ml penitsilliini ja 100 µg/ml streptomütsiini temperatuuril 37 ˚C niisutatud atmosfääris, mis sisaldab 5% CO2.

Kõrgefektiivne vedelikkromatograafia (HPLC).

CTPG-W (kat. nr SGJG20170410) osteti ettevõttelt Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, Hiina). CTPG peamised ühendid kvalifitseeriti ja kvantifitseeriti HPLC abil vastavalt meie eelmisele uuringule (24). Lühidalt, HPLC viidi läbi ZORBAX SB-C18 kolonnil (250x4,6 mm; 5 µm) temperatuuril 30 °C ja elueeriti 0,2% sipelghappe lahuse ja metanooli gradiendiga alates 23%, kuna iga minuti järel lisati 1 ml. 45 minutit, kuni saavutate 31%. Kokku süstiti 10 µl proovi ja see tuvastati lainepikkusel 330 nm. Ehhinakosiidi standard osteti ettevõttelt Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Hiina) ja akteosiidi standard osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Saksamaa). Standardeid kasutati CTPG-W komponentide analüüsimiseks.

MTT analüüs.

Rakkude proliferatsiooni mõõdeti MTT testiga. Eca{{0}} rakud inokuleeriti 96-süvendiplaatidele tihedusega 5x103 rakku 100 µl RPMI-s{{5 }} söödet/süvend ja kultiveeriti 37 ˚C juures 24 tundi, seejärel töödeldi erinevate kontsentratsioonidega (0, 200, 400, 600 ja 800 µg/ml) CTPG-W või 0,4% dimetüülsulfoksiidiga (DMSO) 24 tundi, 48 ja 72 h. Lahustikontrollina kasutati DMSO-d (800 ug/ml CTPG-W, mis sisaldas 0,4% DMSO-d). Positiivse kontrollina kasutati tsisplatiini (20 ug/ml). Seejärel visati supernatant pärast tsentrifuugimist kiirusel 225 xg 5 minutit toatemperatuuril ära ja igasse süvendisse lisati 100 µl MTT lahust (0,5 mg/ml RPMI-1640 söötmes ilma FBS-ita) ja inkubeeriti 37 °C juures 3 tundi. h. Moodustunud formatsaani kristallid lahustati 200 µl DMSO-s. Optilise tiheduse (OD) väärtused mõõdeti lainepikkusel 490 nm 96-süvendiga mikroplaadilugejaga (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Rakkude suhteline elujõulisus arvutati järgmise valemi järgi: Rakkude elujõulisus (%)=(OD-töödeldud/OD-töötlemata)x100%. Eca-109 rakkude morfoloogiat jälgiti ümberpööratud fluorestsentsmikroskoobiga (suurendus, x200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokyo, Jaapan).

Splenotsüütide proliferatsiooniks eutaniseeriti C57BL/6 hiired emakakaela dislokatsiooniga ja põrnad eraldati. Valmistati üherakuline suspensioon ja splenotsüüdid külvati 96-süvendiplaatidele tihedusega 1x105 rakku süvendi kohta 100 µl RPMI-1640 söötmes ning seejärel töödeldi erinevate kontsentratsioonidega. (0, 200, 400, 600 ja 800 µg/ml) CTPG-W 24, 48 ja 72 tundi temperatuuril 37 ˚C 5% CO2-ga. Splenotsüütide proliferatsiooni mõõdeti MTT testiga vastavalt ülalnimetatud protokollile. Stimuleeriv indeks=ODtreated/ODuntreated.

Apoptoosi ja rakutsükli mõõtmine. Eca{{0}} rakke kultiveeriti 60 mm tassidel tihedusega 2,5x105 rakku tassi kohta 24 tundi ja töödeldi erinevate kontsentratsioonidega ({{31} }, 200, 400, 600 ja 800 µg/ml) CTPG-W või 0,4% DMSO-d 24 tundi temperatuuril 37 ˚C 5% CO2-ga. Rakud koguti ja värviti anneksiin V-fluorestseiini isotiotsüanaadi (FITC) / propiidiumjodiidi (PI) apoptoosi tuvastamise komplektiga (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Hiina) vastavalt tootja protokollidele. Proovid koguti voolutsütomeetriaga (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) ja analüüsiti FlowJo 7.6-ga (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Et analüüsida CTPG-W mõju rakutsüklile, külvati 2,5 x 105 Eca-109 rakku 60 mm kultuuritassidele ja töödeldi CTPG-W-ga (0, 100, 200 ja 400 µg/ml) või 0,4 % DMSO 24 tundi temperatuuril 37 ˚C 5% CO2-ga. Kõik rakud koguti ja pesti kaks korda jääkülma PBS-ga (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), seejärel fikseeriti 70% jääkülmas etanoolis temperatuuril 4 °C 30 minutit. Pärast kahekordset pesemist jääkülma PBS-ga resuspendeeriti rakud 300 µl PI/RNaasi värvimispuhvris (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 10 minutiks toatemperatuuril. Rakutsükli jaotust analüüsiti ModFit LT 3.0 tarkvaraga voolutsütomeetria (BD FACSCalibur) abil.

LOODUSLIK CISTANCHE TUBULOSAVäsimusevastaneKaitske maksa PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mitokondriaalse membraanipotentsiaali (Δψm) ja reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) analüüs.Δψm analüüsimiseks töödeldi Eca{{0}} rakke CTPG-W-ga (0, 400, 600 ja 800 µg/ml) või 0,4% DMSO-ga. 24 tundi 37 °C juures 5% CO2-ga ja värvitud mitokondriaalse membraani potentsiaali analüüsi komplektiga JC-1 (Beyotime Biotechnology Institute, Shanghai, Hiina), vastavalt tootja protokollile, 20 minutit 37 °C juures. C. Pärast kahekordset pesemist JC-1 pesupuhvriga (Beyotime Institute of Biotechnology) resuspendeeriti proovid 300 µl JC-1 pesupuhvriga ja analüüsiti voolutsütomeetria (BD FACSCalibur) abil. Värvaine JC-1 fluorestsentsi Eca-109 rakkudes täheldati ka pöördfluorestsentsmikroskoobiga (suurendus, x200; Nikon Eclipse Ti-E). ROS-i analüüsimiseks töödeldi Eca-109 rakke CTPG-W-ga (0, 400, 600 ja 800 µg/ml) 2, 4, 6, 12 ja 24 tundi ning värviti reaktiivsete hapnikuliikide analüüsiga. komplekt (Beyotime Institute of Biotechnology), vastavalt tootja protokollile, 20 minutit temperatuuril 37 ˚C. Pärast kolmekordset pesemist jääkülma PBS-ga koguti proovid voolutsütomeetriaga (BD FACSCalibur) ja analüüsiti FlowJo 7.6 tarkvaraga.

Joonis 1. CTPG-W kvalifitseeritud kontroll. CTPG-W komponente analüüsiti kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt kõrgsurvevedelikkromatograafiaga ning võrreldi ehhinakosiidi ja akteosiidi standarditega. CTPG-W, vees lahustuvad fenüületanoidglükosiididC. tubulosa.

2,2-difenüül-1-pikrüülhüdrasüüli (DPPH) radikaali püüdev toime. CTPG-W vabade radikaalide püüdmise aktiivsus määrati DPPH vabade radikaalide testiga vastavalt avaldatud protokollile, vähese muudatusega, kuna metanool asendati DPPH lahustamiseks etanooliga (25, 26). Püsiseisundi mõõtmiseks segati 150 µl DPPH-d (100 mmol/l) etanoolis erinevate CTPG-W kontsentratsioonidega (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 ja 600 µg/ml) 50 µl PBS-is ja inkubeeriti pimedas 30 minutit toatemperatuuril. Neelduvus lainepikkusel 517 nm tuvastati CTPG-W juuresolekul ja puudumisel. Positiivse kontrollina kasutati kokku 50 µl C-vitamiini. DPPH radikaali eemaldamise aktiivsus arvutati järgmise valemi abil: eemaldamine (%) =[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, kus Ablank on kontrolli neeldumine (ilma DPPH-ta), Asample on proovi neeldumine ja A0 on PBS-i neeldumine DPPH-ga.

Western blot analüüs. Eca{{0}} rakke töödeldi CTPG-W-ga (0, 200, 600 µg/ml) või 0,4% DMSO-ga 24 tundi 37 °C juures 5% CO2-ga. Järgnev pesemine kaks korda PBS-ga, rakud 

Joonis 2. CTPG-W mõju Eca-109 rakkude ja splenotsüütide kasvule. (A) Eca-109 rakke töödeldi erinevate kontsentratsioonidega CTPG-W 24, 48 ja 72 tundi ning seejärel tuvastati rakkude elujõulisus MTT testiga. (B) Eca-109 rakkude morfoloogilised muutused CTPG-W-ga töötlemisel 24 tunni pärast. (C) C57BL/6 hiirte splenotsüüte töödeldi erinevate kontsentratsioonidega CTPG-W 24, 48 ja 72 tundi ning seejärel analüüsiti proliferatsiooni MTT testiga.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Torune.

lüüsiti radioimmunosadestamise analüüsi lüüsipuhvris (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Peking, Hiina) 20 minutit jääl. Pärast tsentrifuugimist 10, 000 xg 10 minutit temperatuuril 4 °C koguti supernatandid ja valgu kontsentratsioonid tuvastati bicinhoniinhappe komplektiga (Thermo Fisher Scientific, Inc.) vastavalt tootja protokollidele. Western blot analüüs viidi läbi vastavalt meie eelmisele kirjeldusele (24). Antikehad kaspaasi-7 (kat. nr D120077), kaspaasi-8 (kat. nr D155240), kaspaasi-9 (kat. nr D220078), B-rakulise lümfoomi{ {13}} (Bcl-2)-seotud X (Bax) (kat. nr D220073) ja Bcl-2 (kat. nr D260117) ning hiire IgG-vastane mädarõika peroksüdaas (HRP) ) (kat. nr D111050) ja küülikuvastane IgG-HRP (kat. nr D110058) osteti ettevõttelt BBI Life Sciences (Shanghai, Hiina). Kaspaasi -3 (kat. nr E-AB-10050) ja aktiivse kaspaasi-3 (kat. nr E-AB-22115) vastased antikehad osteti ettevõttest Elabscience ( Wuhan, Hiina). Muud antikehad kaspaasi -7 (kat. nr 9492), polü (ADP-riboosi) polümeraasi (PARP) (kat. nr 9542), tsütokroom c (kat. nr AC909), c-Jun NH{ vastu {37}}terminaalne kinaas (JNK) (kat. nr. 9252S) ja -aktiin (kat. nr. 58169) saadi ettevõttest Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Kõik primaarsed ja sekundaarsed antikehad lahjendati vahekorras 1:1,000. Primaarseid antikehi inkubeeriti temperatuuril 4 °C üleöö ja sekundaarseid antikehi inkubeeriti temperatuuril 37 °C 1 tund.

Joonis 3. CTPG-W poolt indutseeritud Eca-109 rakkude apoptoos. Rakke töödeldi erinevate kontsentratsioonidega CTPG-W 24 tundi. (A) Apoptootilisi ja nekrootilisi Eca-109 rakke analüüsiti voolutsütomeetria abil. Ülemine paneel kujutab üksikuid punktigraafikuid ja alumine paneel kokkuvõtlikke andmeid. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Torune.

Sihtvalgud tuvastati täiustatud kemiluminestsentsanalüüsi komplekti (Beyotime Institute of Biotechnology) abil vastavalt tootja protokollile.

Statistiline analüüs. Statistiline olulisus arvutati ühesuunalise dispersioonanalüüsi abil Tukey post hoc testiga ja tulemusi analüüsiti GraphPad Prism 5.{2}} tarkvaraga (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) ravi- ja kontrollrühmade hulgas. Kõik andmed esitati kui keskmine ± standardhälve. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKT NEERUTUNGI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Tulemused

CTPG-W pärsib Eca-109 rakkude kasvu.

CTPG-W komponendid kvalifitseeriti ja kvantifitseeriti HPLC abil (joonis 1), mida võrreldi ehhinakosiidi ja akteosiidi standarditega. Vastavalt piikide retentsiooniaegadele ja piikide pindaladele sisaldas CTPG-W 39,16% ehhinakosiidi ja 2,44% akteosiidi. Esiteks määrati MTT testiga CTPG-W mõju Eca-109 rakkude elujõulisusele. CTPG-W lahustati DMSO-s 200 mg/ml ja lahjendati RPMI -1640 söötmega, mis sisaldas 10% kuumusega inaktiveeritud FBS-i, kuni näidatud kontsentratsioonini. Eca-109 rakke töödeldi CTPG-W-ga ja rakkude elujõulisust analüüsiti näidatud ajahetkedel MTT testiga. CTPG-W-ravi vähendas oluliselt Eca-109-rakkude elujõulisust annusest ja ajast sõltuval viisil (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Joonis 4. CTPG-W mõju rakutsükli jaotusele Eca-109 rakkudes. Eca-109 rakkude töötlemiseks 24 tunni jooksul kasutati erinevaid CTPG-W kontsentratsioone ja rakutsükli jaotust analüüsiti voolutsütomeetria abil. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Torune.

CTPG-W kutsub esile apoptoosi Eca-109 rakkudes. Et uurida, kas CTPG-W pärssis Eca-109 rakkude kasvu apoptoosi või nekroosi esilekutsumise kaudu, töödeldi rakke erineva kontsentratsiooniga CTPG-W-ga. 24 tunni pärast tuvastati anneksiin V/PI värvimisega Eca-109 rakkude apoptoos ja nekroos. Nagu on kujutatud joonisel fig 3A, blokeeriti anneksiin V-/PI+ rakud nekrootiliste rakkudena ning anneksiin V+/PI+ ja anneksiin V+/PI- rakud apoptootiliste rakkudena. CTPG-W indutseeris peamiselt Eca-109 rakkude apoptoosi annusest sõltuval viisil, kuigi ka nekrootiliste Eca-109 rakkude arv suurenes märkimisväärselt 600 ja 800 µg/ml CTPG-W töötlemisel (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG-W indutseerib rakutsükli seiskumise Eca-109 rakkudes S-faasis. Vähirakkude tsükli rikkumine pärsib rakkude kasvu ja soodustab apoptoosi (27). Rakutsükli jaotus Eca-109 rakkudes tuvastati PI värvimisega pärast 24-tunnist CTPG-W-ga töötlemist. Täheldati, et rakud S-faasis suurenesid ja rakud G0/G1-faasis näitasid üldist olulist langust CTPG-W-ga töötlemisel (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG-W vähendab Δψm ja kutsub esile tsütokroom c vabanemise. Apoptoosi võib esile kutsuda mitokondritest sõltuv rada (28, 29). BCL-2 valguperekonna pro- ja anti-apoptootilised liikmed mängivad olulist rolli mitokondriaalse membraani terviklikkuse reguleerimisel (30, 31). Pärast 24-tunnist töötlemist CTPG-W-ga hinnati Δψm, kasutades JC-1 värvimist. JC-1 agregaat (punane fluorestsents tuvastatud FL-2-s) laguneb monomeeriks (roheline fluorestsents tuvastati FL-1), kui Δψm väheneb (32). Nagu on kujutatud joonisel 5A, suurenesid FL-1+ FL-2-/+ rakkude sagedus annusest sõltuval viisil, mis näitab, et Eca-109 rakkude Δψm vähenes. Fluorestsentsi muutusi Eca-109 rakkudes täheldati ka pöördfluorestsentsmikroskoobiga (joonis 5B). CTPG-W kontsentratsioonide suurenemisega vähenes punane fluorestsents ja roheline fluorestsents suurenes, mis on kooskõlas voolutsütomeetria andmetega. Samuti täheldati, et tsütokroom c tase tsütosoolis tõusis märgatavalt (joonis 5C), mis on Δψm vähenemise tulemus. See kinnitab FL-1+ FL-2-/+ rakkude arvu suurenemise põhjal tehtud järeldust, et Δψm vähenes CTPG-W-ravi tulemusena. On teatatud, et JNK võib reguleerida BCL-2 valguperekonna aktivatsiooni, põhjustades tsütokroom c (33-35) vabanemist. Samuti tehti kindlaks, et JNK tase oli pärast CTPG-W-ravi märkimisväärselt ülesreguleeritud (joonis 5C). Tulemused näitasid, et CTPG-W võib indutseerida Eca-109 rakkude apoptoosi mitokondriaalsest sõltuva raja kaudu.

Joonis 5. Δψm vähendamine ning tsütokroom c ja JNK ülesreguleerimine. Eca-109 rakke töödeldi erinevate kontsentratsioonidega CTPG-W-ga 24 tundi. (A) Δψm tuvastati JC-1 värvimisega ja proove analüüsiti voolutsütomeetria abil. Üksikud punktgraafikud kujutavad muutusi JC-1 fluorestsentsis. Lahtrite FL-1+ FL-2-/+ sagedused on kujutatud alumisel paneelil. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Joonis 6. ROS tasemed Eca-109 rakkudes CTPG-W töötlemisel ja CTPG-W antioksüdantne aktiivsus. (A) Eca-109 rakke töödeldi erinevate kontsentratsioonidega CTPG-W ja ROS-i taset analüüsiti voolutsütomeetria abil näidatud ajahetkedel. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

CTPG-W mõju intratsellulaarsele ROS-i tekkele.ROS võib apoptoosi esilekutsumiseks vähendada Δψm (36). Uurimaks, kas CTPG-W võib suurendada ROS-i tootmist, töödeldi Eca-109 rakke erinevate CTPG-W kontsentratsioonidega. Rakud koguti näidatud ajahetkedel ja värviti DCFH-DA-ga. Intratsellulaarse ROS-i tootmine Eca-109 rakkudes määrati voolutsütomeetria abil. Nagu on kujutatud joonisel 6A, suurendas 800 µg/ml CTPG-W oluliselt ROS-i tootmist alates 2-6 h ja vähenes alates 12-24 h. Lisaks suurendas 400 µg/ml CTPG-W oluliselt ROS-i tootmist alates 12-24 tunnist. Lisaks ei muutnud 200 µg/ml CTPG-W märkimisväärselt ROS-i tootmist. Dünaamilised muutused ROS-i tootmises võivad olla seotud Eca{15}}-rakkude apoptoosiga. Samuti tehti kindlaks, et CTPG-W-l oli vabu radikaale püüdev aktiivsus (joonis 6B), mis võib olla seotud ROS-i tootmise vähenemisega Eca-109 rakkudes, mida töödeldi 800 µg/ml CTPG-W-ga 12 tunni pärast.

Joonis 7. Lõhustatud kaspaaside ja lõhustatud PARP tasemed pärast CTPG-W töötlemist. Valgud eraldati 24 tundi CTPG-W-ga töödeldud Eca-109 rakkudest ning lõhustatud kaspaaside ja lõhustatud PARP tasemed tuvastati Western blot analüüsiga. DMSO, dimetüülsulfoksiid; CTPG-W, vees lahustuvad fenüületanoidglükosiididC. Torune; PARP, polü (ADP-riboos) polümeraas.

CTPG-W reguleerib üles kaspaas-3, kaspaas-7, kaspaas-9 ja PARP aktiivsust. Tsütokroom c vabanemine Δψm vähenemise tõttu võib aktiveerida kaspaasproteaase, et kutsuda esile apoptoos (29, 30, 37). Pärast 24-tunnist töötlemist CTPG-W-ga tuvastati Western blot analüüsiga kaspaasi -3, 7, 8, 9 ja PARP aktivatsioon. Võrreldes kontrollrühmaga on lõhustatud kaspaasi -9, lõhustatud kaspaasi-7, lõhustatud kaspaasi-3 ja lõhustatud PARP tasemed, kuid mitte lõhustatud kaspaasi tasemed{{20 }}, reguleeriti CTPG-raviga annusest sõltuval viisil üles (joonis 7). Need tulemused näitasid, et CTPG-W vähendas Δψm ja soodustas tsütokroom c vabanemist, et aktiveerida kaspaasid, mis kutsuvad esile Eca-109 rakkude apoptoosi.

Arutelu

Traditsiooniline CHM võib esile kutsuda söögitoru vähirakkude apoptoosi erinevate radade kaudu, sealhulgas välise surma retseptori ning sisemise mitokondriaalse ja endoplasmaatilise retikulumi stressiradade kaudu (29). Meie eelmine uuring näitas, et CTPG kui C. tubulosa põhikomponent inhibeeris melanoomi B16-F10 rakkude kasvu, kutsudes esile apoptoosi mitokondriaalsest sõltuva raja kaudu (24). Käesolevas uuringus uuriti CTPG-W kasvajavastast toimet Eca-109 rakkudele ja tehti kindlaks, et CTPG-W pärssis Eca-109 rakkude kasvu, kutsus esile apoptoosi ja seiskus rakutsükli. vähendas Δψm, suurendas tsütokroom c vabanemist ja aktiveeris kaspaase. CTPG ja CTPG-W võivad vähirakkudes esile kutsuda apoptoosi ja rakutsükli peatamise. Täpsed mehhanismid on aga CTPG (26,64% ehhinakosiid, 10,19% akteosiid ja 1,71% isoakteosiid) ja CTPG-W (39,16% ehhinakosiid ja 2,44% akteosiid) erinevate komponentide tõttu erinevad. CTPG peatas B16-F10 rakud G0/G1 faasis, kuid CTPG-W peatas Eca-109 rakud S-faasis (24). CTPG suurendas annusest sõltuvalt ROS-i tootmist, kuid see näitas ajast sõltuvat muutust CTPG-W suure annuse tõttu, mis suurenes oluliselt CTPG-W-ravi alguses (2-6 h) ja vähenes oluliselt 12 tunni pärast, võrreldes kontrolliga. Võimalik põhjus on see, et CTPG-W põhikomponent on ehhinakosiid. Mitmed uuringud teatasid, et ehhinakosiid võib pärssida ROS-i tootmist ja ROS-i indutseeritud apoptoosi, avaldades neuroprotektiivset ja vananemisvastast toimet (38-40). Samamoodi täheldati käesolevas uuringus vabade radikaalide eemaldamise aktiivsust. Seetõttu oletati, et mõned komponendid, sealhulgas verbaskosiid, iso-verbaskosiid ja salidrosiid suures CTPG-W annuses, võivad viivitamatult esile kutsuda ROS-i tekke, mis põhjustab Eca-109 rakkude apoptoosi (41,42) ja seejärel ROS-i hävitas echiNakosiid. Teine võimalik põhjus CTPG ja CTPG-W ROS-i tootmise erinevustele on see, et selles uuringus ja eelmises uuringus kasutati erinevaid rakuliine (24). Dong jt (43) teatasid, et ehhinakosiid võib indutseerida inimese SW480 kolorektaalse vähi rakkude apoptoosi oksüdatiivse DNA kahjustuse tekitamise kaudu ilma ROS-i taseme suurenemiseta.

CTPG-W-ravi vähendas Δψm ja põhjustas tsütokroom c vabanemise, mis soodustab kaspaasi -9 lõhustumist (28). Järjepidevalt reguleeriti CTPG-W-ravi abil lõhustatud kaspaasi-9 taset üles. Seejärel võib aktiivne kaspaas -9 aktiveerida kaspaasi-3, et kutsuda esile apoptoos (44). Lõhustatud kaspaasi{10}} taset reguleeris ka CTPG-W-ravi. Kuid CTPG-W ei aktiveerinud kaspaas-8, mis näitab, et välise surmaretseptori rada ei osalenud CTPG-W poolt indutseeritud apoptoosis. Need tähelepanekud näitavad, et CTPG-W kutsub esile Eca-109 rakkude apoptoosi mitokondriaalsest sõltuva raja aktiveerimise kaudu.

PARP mängib olulist rolli genoomse stabiilsuse tagamisel ja seda võivad lõhustada aktiivsed kaspaasid, eriti kaspaas-3 ja -7 (45). Tehti kindlaks, et CTPG-W-ravi aktiveeris kaspaasi -3 ja -7, mis võivad lõhustada PARP-i, et pärssida DNA paranemist ja põhjustada apoptoosi.

CTPG-W pärsib ka annusest ja ajast sõltuvalt inimese hepatotsellulaarse kartsinoomi BEL-7404 rakkude kasvu (avaldamata andmed). Kuigi CTPG-W inhibeerib Eca-109 ja BEL-7404 rakkude kasvu, soodustab see splenotsüütide proliferatsiooni, mis võib olla tingitud polüsahhariidide sisaldusest (~50%) CTPG-W-s (46 ). Samamoodi on mitmed uuringud teatanud, et polüsahhariidid võivad soodustada splenotsüütide proliferatsiooni (46-49). Hiiremudelis tehti kindlaks, et CTPG-W suurendas märkimisväärselt põrna indeksit võrreldes kontrollrühmaga, kuid ei mõjutanud kehakaalu ega teiste organite indekseid, sealhulgas südame, maksa, neerude ja kopsude indekseid (avaldamata andmed), mis näitab, et CTPG-W ei oma tsütotoksilist toimet normaalsetele rakkudele.

Kokkuvõttes näitasid andmed, et CTPG-W inhibeerib Eca-109 rakkude kasvu, kutsudes esile apoptoosi mitokondriaalsest sõltuva raja kaudu.

LOODUSLIK TUBULOOS SUGUFUNKTSIOONI PARANDAMISEKS PHGS75% ECH 30% ACT 12%