1. osa ERCC1 mutatsioonid takistavad DNA kahjustuste parandamist ja põhjustavad maksa- ja neerufunktsiooni häireid patsientidel

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Katja Apelt jt

Click to Cistanche ekstrakti kasulikud omadused neerufunktsioonile

Sissejuhatus

Inimese genoomi kuus miljardit aluspaari puutuvad pidevalt kokku DNA-d kahjustavate ainetega, põhjustades mitmesuguseid genoomse DNA kahjustusi, sealhulgas UV-valgusega indutseeritud fototooteid, ahelasiseseid ja ahelatevahelisi ristsidemeid (ICL) ja DNA topelt- ahela katkestused (DSB). Genoomilise terviklikkuse tagamiseks tuleb need DNA kahjustused spetsiifiliselt ja tõhusalt parandada. Välja on arenenud erinevad DNA parandamise mehhanismid, millest igaüks toimib teatud DNA kahjustuste alamhulgale. Kuigi paljud DNA parandavad valgud osalevad ühes rajas, heterodimeerses endonukleaasisERCC1-XPF on jagatud mitme mehaaniliselt erineva DNA parandamise raja vahel (Manandhar et al., 2015).

XPF on ebastabiilne ja laguneb kiiresti, mida hoiab ära selle heterodimerisatsioonERCC1(Biggerstaff et al., 1993). Nende kahe valgu vahelist interaktsiooni vahendab nende vastavates C-otstes paiknev topeltheeliks-juuksenõelheeliksi (HhH)2 motiiv, samuti valgu keskdomeen.ERCC1ja XPF nukleaasi domeen (de Laat et al., 1998b; Jones jt, 2020; Tripsianes jt, 2005; Tsodikov et al., 2005). Seondumist kaheahelalise DNA-ga hõlbustab ERCC1, samas kui XPF vahendab seost üheahelalise DNA-ga (ssDNA) selle (HhH)2 domeeni kaudu (Tsodikov et al., 2005). Pärast positsioneerimist kasutab XPF oma katalüütilist aktiivsust oma väga konserveerunud nukleaasi motiivi kaudu, et lõhustada erinevaid DNA substraate 59 mullide ja üheahelalise 39 üleulatuva osa kohta, mis ulatuvad DNA kaksikheeliksist (de Laat et al., 1998a; Enzlin ja Sch¨). are, 2002; Matsunaga et al., 1996). ERCC1- XPF võtmerolli demonstreeriti esmakordselt nukleotiidide ekstsisiooni parandamises (NER), kus see lõikab kahjustatud DNA 59 kahjustuse külge (Sijbers et al., 1996a).

NER tunneb ära mitmesugused struktuurselt mitteseotud DNA kahjustused, sealhulgas UV-indutseeritud fotoproduktid, oma kahe alamraja kaudu: globaalse genoomi parandamise (GGR) ja transkriptsiooniga seotud parandamise (TCR) kaudu. Suurem osa NER-i aktiivsusest tugineb GGR-le, kus XPC valk tunneb ära fotoproduktid kogu genoomis ja värbab transkriptsioonifaktori IIH (TFIIH) kompleksi (Sugasawa et al., 1998; Volker et al., 2001). DNA kahjustused, mis põhjustavad RNA polümeraas II (RNAPII) seiskumist transkriptsiooni ajal, käivitavad TCR-spetsiifiliste valkude, nagu CSB, CSA ja UVSSA, värbamise, mis omakorda värbavad TFIIH kompleksi (Nakazawa et al., 2020; van der Weegen et al., 2020). Pärast TFIIH värbamist DNA kahjustusesse loovad GGR ja TCR lehtri ühiseks molekulaarseks mehhanismiks, mis hõlmab XPA ja XPG seost (Marteijn et al., 2014), mis stimuleerivad TFIIH helikaasi aktiivsust ja moodustavad koos RPA-ga stabiilse täppiskompleksi ( Kokic jt, 2019; Riedl jt, 2003; Wakasugi ja Sancar, 1998). TheERCC1-XPF heterodimeer värvatakse NER kompleksi XPA poolt XPA-siduva domeeni kauduERCC1(Tsodikov et al., 2007; Volker et al., 2001). Kahekordne sisselõige endonukleaaside XPF (kahjustusest 59) ja XPG (39 kahjustusest) koordineeritud aktiivsuse tõttu vabastab DNA kahjustust sisaldava ssDNA lõigu (Li et al., 1995; Matsunaga et al., 1995; O 'Donovan et al., 1994; Staresincic et al., 2009), mille järel tekkinud tühimik täidetakse ja ligeeritakse täielikuks parandamiseks.

Lisaks NER-ile näidati, etERCC1-XPF mängib olulist rolli ka ICL-i parandamisel (Klein Douwel et al., 2014). Selle parandusraja algatab replikatsiooni seiskumine ja see hõlmab ICL-i seiskunud replikatsioonikahvli äratundmist mitme valgu tuumaga Fanconi aneemia (FA) kompleksi poolt, mis toimib FANCD2 jaoks E3 ubikvitiini ligaasi kompleksina. FANCD2 mono-ubikvitilatsioon käivitab SLX4 värbamise, mis omakorda on suunatudERCC1-XPF kuni ICL-i (Abdullah et al., 2017; Klein Douwel jt, 2014; Walden ja Deans, 2014; Wood, 2010). Pärast värvamist vahendab ERCC{5}}XPF ICL-i lahtihaakimist, lõigates vanemliku DNA ahela mõlemal pool kahjustust, et võimaldada hilisemat kahjustusest möödasõitu ja paranemist (Kuraoka et al., 2000). Lõpuks on ERCC1-XPF seotud ka DSB parandamisega homoloogse rekombinatsiooni teel (Ahmad et al., 2008), mille käigus saab see tõhusalt lõhustada erinevaid rekombinatsiooni vaheühendeid (Wyatt et al., 2017). Teise võimalusena kasutavad rakud veaohtlikku RAD{11}}sõltuvat üheahelalist anniilimisrada, mis hõlmab mikrohomoloogiaga piirkondade anniilimist ja sellele järgnevat mittehomoloogsete 39 ssDNA sabade eemaldamistERCC1-XPF (Adair et al., 2000; Li et al., 2013, 2019). Siiski ei ole ERCC1-XPF-i täpne roll nendes DSB-parandusteedes täielikult mõistetav.

DNA parandamise radade tähtsust rõhutab pärilike DNA parandamise-puudulikkuse häiretega isikute kliiniline fenotüüp. GGR inaktiveerimise tulemuseks on Xeroderma pigmentosum (XP; MIM 278700, 610651, 278720, 278730, 278740, 278760 ja 278780; DiGiovanna ja Kraemer, 2012), mida iseloomustavad 2-kordne fototundlikkus { ja a}}. nahavähist. Cockayne'i sündroomi (CS; MIM 216400 ja 133540) puhul täheldatakse neurodegeneratsiooni, kasvupeetust ja multisüsteemset haigust ilma nahavähita. CS-patsientidel on TCR-is selektiivne geneetiline defekt, mis takistab DNA kahjustusega seiskunud RNAPII töötlemist (Karikkineth et al., 2017; Nakazawa et al., 2020; Nakazawa jt, 2012; Ribeiro jt, 2018; Tufegdˇzi´zi). c Vidakovi´ c et al., 2020). ICL -i oluliste remondigeenide mutatsioonid põhjustavad FA (MIM 227650, 300514, 227645, 605724, 227646, 600901, 603467, 614082, 609053, 609054, 614083, 614087, 610832, 613390, ja 61390, 614083, 61401, ja 61401, mis on 614087, 61390. , elundite väärarengud ja genoomne ebastabiilsus (Auerbach, 2009). RollERCC1-XPF-i ICL-i parandamisel rõhutab XPF-i mutatsioonide olemasolu, mis põhjustavad FA fenotüübi (Bogliolo et al., 2013; Ceccaldi jt, 2016; Kashiyama et al., 2013). Pärilikud defektid DSB parandamisel põhjustavad mitmesuguseid häireid, mis on seotud radiosensitiivsuse, vähi eelsoodumuse, immuunpuudulikkuse ja neurodegeneratsiooniga (Helfricht et al., 2020; McKinnon ja Caldecott, 2007).

DNA parandamise puudulikkuse häired on haruldased ja esinevad hinnanguliselt umbes 1 200 000 elussünni kohta kogu maailmas XP, CS ja FA puhul. Seni on aga kirjeldatud ainult kahte aruannet bi-alleelse ERCC1 (MIM 126380) mutatsiooniga indiviididest (Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Mõlemal isikul olid CS-ga kooskõlas olevad tunnused ja nad surid 14-kuuselt ja 2,5-aastaselt. Esimesel ja kõige rängemalt mõjutatud isikul (165TOR) oli ühel alleelil enneaegne stoppkoodon (Q158X) ja teisel F231L missense variant (Jaspers et al., 2007). Teine isend (CS20LO) oli F231L missense variandi suhtes homosügootne (Kashiyama et al., 2013). Mõlema isendi rakud näitasid tundlikkust UV-indutseeritud DNA kahjustuste suhtes ja eriti 165TOR oli samuti kergelt tundlik ICL-i indutseerivate ainete suhtes. Mõlemad isikud surid varases lapsepõlves (1–2 aastat; Jaspers et al., 2007; Kashiyama jt, 2013). Kolmandat isikut (XP202DC), kellel on bi-alleelsed ERCC1 mutatsioonid ja kes suri 37-aastaselt, on tsiteeritud koosoleku kokkuvõttes (Imoto, K. et al. 2007. Patsiendid, kellel on interakteeruvate nukleotiidide ekstsisiooni parandavate valkude defektidERCC1või XPF-il on hilise algusega raske neuroloogiline degeneratsioon xeroderma pigmentosum. [Abstract] J. Invest. Dermatol. 127:S92). See isend oli heterosügootne ühend nonsenssmutatsiooni (K226X) ja splaissmutatsiooni suhtesERCC1. Üksikasjalik fenotüübiline kirjeldus pole saadaval ja nende ERCC1 mutatsioonide mõju pole teada.

Kahe ülalnimetatud isiku fenotüüp on raskem, kui eeldati ainult NER-i puudulikkuse tõttu, mis on kooskõlas ERCC{0}}XPF-i kaasamisega mitmesse DNA parandamise radadesse. Kooskõlas sellega ilmnes kas ERCC1 või XPF-KO hiirtel kõrge embrüonaalne letaalsus ja lühenenud eluiga ning nad surid raske maksapuudulikkuse tõttu (McWhir et al., 1993; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997). mida NER-i puudulikkusega XPA-KO hiirtel ei täheldata (de Vries et al., 1995; Nakane et al., 1995).

Käesolevas uuringus kirjeldame kahte bi-alleelse ERCC1 mutatsiooniga õde-venda, kellel on ainulaadne lühikest kasvu, valgustundlikkuse, progresseeruva kolestaatilise maksahaiguse ja neerutuubulopaatia fenotüüp. Mõlemal isikul tekkis progresseeruv maksakahjustus ja nad vajasid maksa siirdamist enne 10-aastaseks saamist. Funktsionaalsed uuringud näitavad, et ERCC1 ja XPF püsiseisundi valgu tase vähenes dramaatiliselt statsionaarsetes rakkudes ja sissetungivates epiteelirakkudes, mis kannavad patsientidel leitud missense varianti. Lisaks interakteeris mutantne ERCC1 valk teiste NER-i ja ICL-i parandavate valkudega ainult nõrgalt. Teatame uuest ERCC1 puudulikkuse juhtumist, mis mõjutab tugevalt NER-i ja millel on märkimisväärne mõju ICL-i paranemisele, mille tulemuseks on ainulaadne fenotüüp, mis ühendab endas lühikest kasvu, valgustundlikkust ning progresseeruvat maksa- janeerufunktsiooni häired.

Tulemused

Kaks õde-venda, kellel on valgustundlikkus, lühike kasv ning progresseeruv maksa- ja neerufunktsiooni häire

Õde-vend 1 (PV50LD; joon. 1 A) on 13-aastane, vanim kolmest õest-vennast, kes on tervete ja mitte suguluses olevate vanemate segarahvusest, sealhulgas põlisrahvaste austraalia, malta ja anglokeldi pärand. Raseduse ajal oli tema emal mööduv laienenud kardiomüopaatia, mis möödus pärast sünnitust. Ta sündis 39. rasedusnädalal ja tema sünnikaal oli 1,9 kg (Z=−3,8), pikkus 44 cm (Z=−2,44) ja peaümbermõõt 29,5 cm (Z {{ 17}} −3,8). Imikueas oli tal kehv kasv ja 18 kuu vanuselt täheldati tal maksafunktsiooni häireid, mis esinesid peamiselt kolestaatilisel kujul. Maksa ultraheli ja magnetresonantskolangiopankreatograafia olid normaalsed. Maksafunktsioon vähenes järk-järgult, nagu ilmneb glutamüültransferaasi (GGT), alaniini transaminaaside (ALT) ja bilirubiini taseme järkjärgulisest tõusust (joonis S1, A-C). Kell maksa biopsia (vanuses 3,5 aastat), lobulaarne parenhüüm näitas varieeruvus hepatotsüütide tuuma morfoloogia, mõned palju suuremad tuumad ja rakud topelttuumad (joonis S1 D) piirkondadesse, kus rakud on väikesed, unremarkable tuumad. Seal oli kerge portaalfibroos ja kerge kiuline portaali laienemine ja kerge fookuskauguse põletik ilma duktopeenia või periduktaalse fibroosita (joonis S1 E).

Ta koges suurt hulka korduvaid infektsioone, sealhulgas tonsilliit, tuulerõuged, suu- ja sõrataudi, kopsupõletik, bronhiit ja korduvad palaviku episoodid, kõhuvalu ja kahvatu väljaheide, mille põhjust ei leitud. Immunoloogilised uuringud ei tuvastanud immuunpuudulikkust. Tal tekkisid silma ja naha valgustundlikkuse episoodid. 6-aastaselt avastati neerufunktsiooni häire, mille tunnused viitasid proksimaalsele tubulaarsele düsfunktsioonile, mida iseloomustasid albuminuuria (subnefrootiline vahemik) ja hüperkaltsiuuria. Tema neerufunktsioon kõikus, koos perioodiliste episoodidegaäge neerukahjustus, progressiivneneerukahjustussuureneva kreatiniini tasemega (joonis S1 F) ja minimaalse vastusega atsetüülkoliinesteraasi inhibeerimisele. Neerude ultraheli näitas väikestneerudsuurenenud ehhogeensusega ja vähenenud kortikomedullaarse diferentseerumisega. Kopsufunktsiooni testid näitasid kerget kuni mõõdukat piiravat kopsuhaigust.

Arengu verstapostid olid normaalsed, kuid mõned õpiraskused ilmnesid koolieas, ilma taandarengu märgita. Nägemine ja kuulmine olid normaalsed. Kasv jäi lisasöötmisest hoolimata väga aeglaseks. Ta oli suhteliselt stabiilne kuni 9,5-aastaseks saamiseni, kui tal ilmnesid maksa dekompensatsiooni tunnused koos järk-järgult tõusva bilirubiini tasemega (joonis S1 C) ja rahvusvahelise normaliseeritud suhtega. Talle tehti ortotoopiline maksasiirdamine 9-aastaselt ja 10-kuuselt. Pärast maksasiirdamist on tema tubulopaatia stabiliseerunud, kuigi tema seerumi kreatiniinisisaldus tõuseb jätkuvalt aeglasemalt (joonis S1 F). Ta on kliiniliselt stabiilne. 12-aastaselt diagnoositi munasarjade puudulikkus. Aju magnetresonantstomograafia (MRI) näitas 12-aastaselt kerget aju atroofiat koos mõõduka väikeaju atroofia ja kerge aju tüve atroofiaga. Viimasel hinnangul (vanuses 13,5 aastat) oli kasv aeglane (kaal 22,4 kg [Z=−6,08] ja pikkus 134,7 cm [Z=−3,72]). Ta oli väga saleda kehaehitusega, vähese lihasmassiga ja vähese nahaaluse rasvaga. Päikese käes olevatel aladel tekkisid tedretähnid (joonis 1 A). Tal olid kergelt sügavale asetsevad silmad ja peanaha juuksed olid õhukesed. Radiaalsete kiirte kõrvalekaldeid ei esinenud. Neuroloogiline uuring näitas kerget nõrkust, minimaalset ataksiat ja depressiivseid reflekse.

Õde-vend 2 (PV46LD; joon. 1 A) on 11-aastane, õe-venna 1 noorem õde. Raseduse komplitseerisid platsenta previa ja mööduv ema kardiomüopaatia ning õde-vend 2 sündis 35. rasedusnädalal sünnikaaluga 1,79 kg (kolmas sentiil), pikkus 45 cm (50. sentiil) ja ümbermõõt ees 29 cm (vähem kui kolmas sentiil). Tal oli vähe nahaalust rasva ja tema vanema õe-vennaga sarnased näojooned. Ta eksponeeritud suutmatus areneda esimesel eluaastal ja maksakahjustus alates vanusest 2 aastat, oluliselt suurenenud GGT, ALT ja bilirubiini taset (joonis S1, A-C). Maksa biopsia 6-aastaselt näitas intrahepaatiliste sapiteede kahjustust, mille tulemuseks oli periduktaalne fibroos. Nagu ka tema õe maksa biopsia puhul, täheldati mõõdukat arvu kahetuumalisi hepatotsüüte, millest mõned olid suurte tuumade ja suurte tuumadega.

Tal esinesid silmade ja naha valgustundlikkuse episoodid. Tal leiti kerge neerukahjustusega neerutuubulopaatia, mille kreatiniini tase tõusis järk-järgult (joonis S1 F). Neerude ultraheli näitas väikestneerudnefrokaltsinoosiga. Arengu verstapostid olid normaalsed, kuid kerge intellektipuue (IQ 66) diagnoositi koolieas. Neuroarengu verstapostidega on toimunud aeglane edasiminek ja kindlat taandarengut pole. Nägemine ja kuulmine olid normaalsed. Maksakahjustus oli progresseeruv ja 8-aastaselt tehti talle maksasiirdamine. Aju MRI 5-aastaselt oli normaalne, kuid korduv MRI 10-aastaselt näitas mõõdukat väikeaju atroofiat ja kerget ajuatroofiat. 11-aastaselt näitas östrogeeni, folliikuleid stimuleeriva hormooni ja luteiniseeriva hormooni mõõtmine mustrit, mis viitab munasarjade puudulikkusele. Viimasel hindamisel 11-aastaselt oli kasv aeglane (kaal 20 kg [Z=−3,89] ja pikkus 120,7 cm [Z=−3,17]). Tal oli väga kõhn kehaehitus, nahaalune rasvkude oli minimaalne ja lihasmass oli nõrk, ta oli perekondlike näojoontega, kergelt sügavale asetsevad silmad ja tedretähnid päikesele avatud aladel (joonis 1 A). Tal ei olnud radiaalkiirguse kõrvalekaldeid. Neuroloogiline uuring näitas kerget nõrkust koos kerge ataksia ja reflekside puudumisega.

Molekulaaranalüüs tuvastab uudsed bi-alleelsed ERCC1 mutatsioonid

Exome sequencing revealed that both siblings harbor a novel missense variant in exon 4 of the ERCC1 gene (p.R156W; c.466C>T) on the paternal allele (Fig. S2 A). The presence of the c.466C>T missense varianti kinnitas Sangeri sekveneerimine mõlemas mõjutatud õe-venna puhul (joonis 1 B). Terve genoomi järjestamine näitas deletsiooni 4. eksonis ema alleelil (hg19: chr19:45 922, 224- 45, 924 375; joonis S2 B), mida kinnitas eksoni 4 ja eksoni võrdlev kvantitatiivne PCR (qPCR). 5 ERCC1 nii õdedel-vendadel kui ka emal (joonis 1, C ja D). Deletsiooni, mis eeldatavasti on nullalleel, ei tuvastatud ei isas ega neljas negatiivses kontrollproovis (joonis 1 D).

While a previously described pathogenic ERCC1 missense variant (p.F231L; c.693C>G) asub (HhH)2 domeenis (joonis 1 E), missense variant (p.R156W) asub ERCC1 keskses domeenis ja on XPA sidumistasku (110–154 aa) vahetus läheduses. ERCC1 (joonis 1 E). ERCC1 tsentraalse domeeni struktuurianalüüs näitas kitsa V-kujulise hüdrofoobse tasku, mis seob XPA-s esineva lühikese motiivi (67–80 aa) (joonis 1 F; Tsodikov et al., 2007). Aminohapped, mis ääristavad ERCC1 XPA-d siduvat taskut (joonis 1 F), on NER-i jaoks olulised, kuid asendamatud muude ERCC{17}}sõltuvate parandusradade jaoks (Orelli et al., 2010). Patsientidel asendatud R156 jääk asub vahetult XPA-d siduva tasku all ja moodustab soolasilla vastandliku aminohappega D129 (joonis 1 F). Seetõttu mõjutab R156W asendus tõenäoliselt XPA-d siduva tasku stabiilsust. Võimalik, et see asendus nõrgendab ka interaktsiooni ERCC1 tsentraalse domeeni ja XPF nukleaasi domeeni vahel (Jones et al., 2020) ning ennustame, et see võib viia heterodimeeri liidese kerge kuni mõõduka destabiliseerumiseni. mille tulemusena väheneb valgu stabiilsus.

PV46LD ja PV50LD fibroblastidel on tõsine NER-defekt. NER-i puudulikkuse tunnuseks on tugev tundlikkus UV-C-kiirguse suhtes. Et käsitleda ERCC1 puudulikkuse mõju NER funktsioonile, saime mõlema kahjustatud õe-venna naha biopsiatest primaarsed fibroblastid. Klonogeensete ellujäämisanalüüside võimaldamiseks immortaliseerisime PV50LD rakud, lisades hTERT (joonis S3 A). Kontrollina genereerisime CRISPR-Cas9 abil RPE1-hTERT rakkudes täielikud ERCC1-KO rakud (joonis 2 A). Klonogeenne UV-C ellujäämise test näitas, et PV50LD-hTERT rakud on ülitundlikud UV-C kiirguse suhtes, kuigi mitte samal määral kui täielikud ERCC1-KO rakud (joonis 2 B), mis viitab tõsisele defektile NER-is.

Transkriptsiooni käigus tekkinud UV-indutseeritud DNA kahjustused parandatakse TCR-iga, mida saab mõõta RNA sünteesi (RRS) taastumise testiga (Nakazawa et al., 2010). Mõõtsime RRS-i 48BR fibroblastides (WT), patsientide fibroblastides ja kaasasime kontrolliks XPA-puudulikud (XP1PD) primaarsed fibroblastid. Tekkivate transkriptide märgistamine 5-etünüüluridiini inkorporeerimisega näitas 3 tundi pärast UV-C-d kõigis rakuliinides tekkivate transkriptide tugevat UV-indutseeritud vähenemist. Kuigi 48BR taastus täielikult transkriptsiooni 18 tunni jooksul pärast UV-C kiiritamist, taastusid mõlemad patsiendi fibroblastid isegi vähem kui NER-puudulikud XP-A patsiendirakud (joonis 2, C ja D), mis viitab sellele, et TCR nendes tingimustes praktiliselt puudub.

GGR aktiivsuse uurimiseks mõõtsime mittejagunevates rakkudes planeerimata DNA sünteesi (UDS) (Nakazawa et al., 2010). Selleks kiiritati primaarseid fibroblaste lokaalselt UV-C valgusega, millele järgnes impulssmärgistamine tümidiini analoogiga 5-etünüüldeoksüuridiiniga (EdU), et mõõta paranemist. Selge EdU inkorporatsioon tuvastati 48BR rakkudes kohalike UV-indutseeritud DNA kahjustuste kohtades. Siiski oli patsiendi fibroblastides tuvastatav ainult väga madal EdU inkorporeerimise tase samadel tasemetel nagu XPA-puudulike fibroblastide puhul (XP1PD; joonis 2, E ja F). UDS-i tasemed PV46LD ja PV50LD rakkudes olid võrreldavad või isegi madalamad kui varem kirjeldatud ERCC-defitsiitsete 165TOR (Jaspers et al., 2007) ja CS20LO (Kashiyama et al., 2013) tasemetega. rakke, mille lisasime paralleelselt (joonis 2 G ja joon. S3 B). Oluline on see, et menüüdega märgistatud ERCC1 reekspressioon mõlemas fibroblastis päästis täielikult EdU liitumise (joonis 2, E ja F; ja joonis S3 C), kinnitades, et tugev UDS-defekt on tingitud ERCC1 puudulikkusest. Samuti saime vanematelt primaarsed fibroblastid, mis näitasid normaalset UDS-i kohalike UV-kahjustuste kohtades (joonis 2 H), mis viitab sellele, et vastav heterosügootne ERCC1 defekt vanematel on täielikult kompenseeritud WT alleeliga.

PV46LD ja PV50LD fibroblastidel on väga madal ERCC1 ja XPF valgu tase

NER hõlmab DNA paranduskomplekside väga koordineeritud ja järjestikust kokkupanekut, mille käigus XPA värbamine toimub TFIIH-st allavoolu, kuid ERCC{0}}XPF-ist ülesvoolu (Volker et al., 2001). Et tegeleda, mil määral patsiendi fibroblastid endiselt toetavad NER kompleksi kokkupanekut, kiiritasime fibroblaste lokaalselt UV-C-ga ja jälgisime immunofluorestsentsmärgistuse abil mitme tuuma NER-valkude värbamist (joonis 3 A, kvantifitseerimine ja joonis S3 D). 48BR rakkudes tuvastati selge TFIIH, XPA ja ERCC1 värbamine kohalike UV-indutseeritud DNA kahjustuste kohtades, samas kui XPA-puudulikud XP1PD rakud ei suutnud ERCC1 värvata, nagu eelnevalt kirjeldatud (joonis 3 A ja joonis S3 D; Volker et al., 2001). Nii PV46LD kui ka PV50LD rakud näitasid normaalset TFIIH ja XPA värbamist, samas kui ERCC1 värbamine kohalike UV-indutseeritud DNA kahjustuste kohtadesse oli tuvastamatu (joonis 3 A ja joonis S3 D).

ERCC1 lokaliseerimise kaotus võib olla tingitud ERCC1 värbamise ebaõnnestumisest, ERCC1 valgu taseme üldisest vähenemisest või nende kahe kombinatsioonist. Western blot analüüs näitas tõepoolest, et nii ERCC1 kui ka XPF püsiseisundi tasemed olid PV46LD ja PV50LD rakkudes dramaatiliselt langenud (joonis 3 B). ERCC1 jääk-ekspressioon tuvastati siiski, võrreldes täielike ERCC1-KO rakkudega (joonis 3 B). ERCC1 ja XPF valgu tasemete vähenemine PV46LD rakkudes oli väga sarnane kas CS20LO või 165TOR rakkudes tuvastatud vähenenud tasemega (joonis 3 C ja joonis S3, E ja F), mis viitab sellele, et raskem fenotüüp indiviidil mis need rakud pärinevad, ei ole tingitud tugevamast mõjust valgu stabiilsusele. Kooskõlas meie UDS-i tulemustega tuvastasime vanemate rakkudes normaalse ERCC1 ja XPF ekspressiooni, mis näitab kompensatsiooni WT alleeli poolt (joonis 3 D). Immunofluorestsentsmärgistus kinnitas, et ERCC1 ja XPF valgu tase oli oluliselt vähenenud, samas kui vanemate rakud olid WT-rakkudest eristamatud (joonis 3 E). Western blot andmete kvantifitseerimine näitab, et ERCC1 valgu tase vähenes ∼ 20 protsendini statsionaarsetes fibroblastides, mille tulemuseks oli ka XPF taseme langus (~20 protsenti; joonis 3 F).

R156W missense-variandi sisselöömine põhjustab ERCC1-XPF-valgu ebastabiilsuse ja tõsise NER-defekti

On ahvatlev oletada, et ERCC1-XPF madal püsiseisundi valgusisaldus ja patsiendi fibroblastide tugev NER-defekt on põhjustatud R156W aminohappe asendusest ERCC1-s. Arvestades aga, et mõjutatud isikud on õed-vennad, ei saa me välistada, et sellele fenotüübile võivad kaasa aidata ka muud nende vahel jagatud geneetilised tunnused.

To directly assess this, we decided to generate knock-in lines (KIs) carrying the R156W amino acid substitution in RPE1- hTERT cells using CRISPR-Cas9 technology. We obtained homozygous KI clones carrying the patient mutation in ERCC1 (p.R156W; c.466C>T), mida kinnitas Sangeri sekveneerimine kahes individuaalses kloonis (joonis 4 A). Missense mutatsioon põhjustas tõsist vähenemist ERCC1 ja XPF valgu taset nii KI kloonid (kloonid 2-17 ja 2-51; Joon. 4 B ja S4, A ja B). Western blot andmete kvantifitseerimine näitas, et ERCC1 ja XPF valgu tase oli peaaegu sama madal kui ERCC1-KO rakkudes (joonis 4 C). Need leiud näitavad, et R156W aminohappe asendusel on tugev mõju ERCC1 stabiilsusele.

Et täiendavalt kindlaks teha, et NER-i defekt patsiendi fibroblastides on põhjustatud R156W aminohappe asendusest ERCC1-s, mõõtsime TCR-i aktiivsust, jälgides transkriptsiooni taaskäivitamist pärast UV-kiirgust. Kui vanemlikud RPE1-hTERT-rakud näitasid normaalset taaskäivitust 18 tundi pärast UV-kiirgust, ilmnes mõlemal R156W-KI kloonil tugev TCR-defekt, mis oli võrreldav täis-ERCC1-KO-rakkudega (joonis 4, D ja E). Samamoodi näitasid UDS-i katsed normaalset GGR-i aktiivsust vanemate RPE1-hTERT-rakkudes, mis vähenes oluliselt alla 10 protsendi nii R156W-KI kloonides kui ka ERCC1-KO rakkudes (joonis 4, F ja G). . Lõpuks mõõtsime ühe R156W-KI klooni (2–51) UV-tundlikkust võrreldes hTERT-immortaliseeritud patsiendi fibroblastiga PV50LD. R156W-KI rakkudel oli tugev UV-tundlik fenotüüp, kuigi mitte nii tundlikud kui täielikud ERCC1-KO rakud (joonis 4 H). Huvitaval kombel oli R156W-KI UV-tundlik fenotüüp väga sarnane PV50LD-hTERT patsientide fibroblastide omaga. Need leiud näitavad, et madal ERCC{30}}XPF valgu tase ja tugev NER-defekt on ERCC1 aminohappe R156W asendamise otsene tagajärg.

ERCC1R156W asendus põhjustab osalise tsütoplasmaatilise lokaliseerimise

Patsiendi fibroblastidel ja KI-rakkudel on dramaatiliselt vähenenud valgu tase ja tugevalt vähenenud NER aktiivsus. Järgmisena soovisime uurida, kas NER-i defekti põhjustab ainult ERCC1-XPF valgu vähenemine või kas ERCC1R156W-mutantvalgul on vähenenud aktiivsus endonukleaasina või NER-is.

Selle probleemi lahendamiseks genereerisime Flp-In/T-Rex süsteemiga varustatud U2OS-i rakkudes CRISPR Cas9 abil ERCC1-KO rakud. Kasutades Flp-põhist saidile suunatud rekombinatsiooni, sihtisime GFP-märgisega ERCC1WT või ERCC1R156W kodeerivad cDNA-d genoomse Flp äratundmise sihtmärgi (FRT) saidile, et võimaldada tugeva viiruse promootori poolt indutseeritavat ekspressiooni. Western blot analüüs näitas, et ERCC1WT ja ERCC1R156W ekspresseerusid sarnasel tasemel ning kummagi valgu ekspressioon päästis ERCC1-KO rakkudes täheldatud XPF vähenenud valgutaseme (joonis 5 A). Seetõttu on need rakud suurepärane mudelsüsteem, et lahutada ERCC1R156W asenduse spetsiifiline mõju, kui seda ekspresseeritakse WT tasemel, madalama ERCC1 ekspressiooni mõjust patsiendi fibroblastides ja KI epiteelirakkudes.

Varasemad uuringud on näidanud, et XPF-i missense-mutatsioonid võivad põhjustada ERCC1-XPF vale lokaliseerumist tsütoplasmas (Ahmad et al., 2010). Kooskõlas sellega tuvastasime ka, et ~40 protsenti ERCC1R156W valgukogumist paiknes valesti tsütoplasmas, mis oli ERCC1WT-d ekspresseerivates rakkudes vaid ~15 protsenti (joonis 5, B ja C). See ERCC1 vale lokaliseerimine suurendas ka tsütoplasmaatilise XPF fraktsiooni (joonis 5, B ja C), mis näitab, et ERCC1R156W võib olla osaliselt valesti voltitud.

Selle võimaluse testimiseks teostasime ERCC1WT-GFP ja ERCC1R156W-GFP immunosadestamise katsed, millele järgnes kvantitatiivne märgisevaba massispektromeetria (MS), et kaardistada kahe ERCC1 valgu erinevad interaktsioonid. Oluline on see, et kvantitatiivne MS kinnitas, et ERCC1WT-GFP ja ERCC1R156W-GFP valku tõmmati alla võrdsetes kogustes (joonis 5 D). Hämmastav on see, et ERCC1R156W interaktsiooni rikastati kuumašokivalkude (HSP), eriti HSPA perekonna suhtes, samas kui interaktsioon XPF-iga oli kvantitatiivselt vähenenud võrreldes ERCC1WT-ga (joonis 5 D). HSPA valgud on valke voltivad chaperonid, mis takistavad valesti volditud valkude agregatsiooni (Stetler et al., 2010). Kaasimmunosadestamise (Co-IP) katsed kinnitasid tõepoolest, et ERCC1R156W-GFP interakteerub tugevalt HSPA4-ga võrreldes ERCC1WT-ga (joonis 5 E), mis viitab ERCC1R156W osalisele valele voltimisele.

Et käsitleda, mil määral ERCC1R156W-XPF on endiselt aktiivne endonukleaasina, puhastasime rekombinantse kompleksi Sf9 putukarakkudest (joonis S4 C). Meie varem kehtestatud protseduur hõlmab geelfiltrimisetappi, mis võimaldab meil hinnata, kas ERCC1-XPF on dimeerses või agregeeritud olekus (joonis 5 F, vastavalt fraktsioonid 2 ja 1). Rekombinantse ERCC1R156W XPF kompleksi saagis oli madalam ja näitas kõrgemat agregeeritud valgu taset. Lisaks märkasime ka heterodimeerse valgu fraktsiooni vähenemist võrreldes ERCC1WT-XPF-ga (joonis 5 F). Sellegipoolest oli 2. fraktsioonis olev heterodimeerne rekombinantne ERCC1R156W-XPF täielikult aktiivne, kui seda inkubeeriti tüviahela mudel-DNA substraadiga, samas kui negatiivse kontrollina kaasatud katalüütiliselt inaktiivsel ERCC1-XPFD687A-l puudus sisselõike aktiivsus (joonis fig. . 5 G). Need leiud viitavad sellele, et ERCC1R156W-XPF on osaliselt valesti volditud ja valesti lokaliseeritud, kuid korralikult voltitav valgufraktsioon on endiselt aktiivne endonukleaasina.

ERCC1R156W mutantvalk ei suuda tõhusalt suhelda põhiliste NER-faktoritega

Järgmisena käsitlesime, kuidas ERCC1R156W asendus mõjutas NER-i, kasutades taastatud ERCC1-KO rakke. Kuna R156W asendus asub ERCC1 XPA-siduva tasku all (joonis 1 F), küsisime, kas ERCC1R156W võib UV-kiirgusele reageerides ikkagi NER-valkudega suhelda. Selle testimiseks immunosadestasime ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP või GFP, mis liideti tuuma lokaliseerimissignaaliga (GFP-NLS), kontrollina UV-kiirgusega kiiritatud rakkudest ja teostasime seejärel märgisevaba MS. Võrreldes ERCC{17}}GFP-d GPF-NLS-iga, tuvastasime nii ERCC1 konstitutiivsed kui ka UV-indutseeritud interaktorid. Meie analüüs näitas, et nii ERCC1WT kui ka ERCC1R156W interakteerusid XPF-i ja ICL-i remondispetsiifiliste karkassvalkudega SLX4 ja SLX4IP, kuigi kvantitatiivselt vähenesid ERCC1R156W ekspresseerivates rakkudes (joonis 6, A ja B). Hämmastav on see, et UV-indutseeritud interaktsioon TFIIH subühikuga XPB ERCC1WT rakkudes kadus täielikult ERCC1R156W rakkudes (joonis 6, A ja B). Co-IP katsed kinnitasid, et ERCC1R156W ei seostunud vastusena UV-kiirgusele TFIIH ega XPA-ga, samas kui pärast ERCC1WT eemaldamist tuvastati tugev koostoime (joonis 6 C ja joonis S4, D ja E).

ERCC{0}}XPF-i värbamine NER-kompleksidesse sõltub täielikult XPA-st (Volker et al., 2001), mis tõstatab küsimuse, kas ERCC1R156W värvatakse ikka veel UV-indutseeritud DNA kahjustuste kohtadesse. Selle probleemi lahendamiseks jälgisime elusrakkude kujutise abil ERCC{5}}GFP värbamist UV-indutseeritud DNA kahjustustesse. Selleks kiiritati rakke UV-C (266- nm) laseriga, mis käivitas kiiritamisjärgse esimese 60 sekundi jooksul ERCC1WT-GFP kiire värbamise, saavutades platoo umbes 120 sekundiga (joonis 6, D ja E). Seevastu identsetes tingimustes UV-C kiiritamisel tuvastati ainult väga nõrk ERCC1R156W-GFP värbamine (joonis 6, D ja E). Need leiud viitavad sellele, et ERCC1R156W võimetus XPA-ga suhelda piirab tõsiselt selle seost NER-kompleksiga.

Meie leiud taastatud ERCC{0}}KO rakkudes viitavad sellele, et ERCC1R156W toetab endiselt jääkparandusaktiivsust (~40 protsenti), kui seda väljendatakse ERCC1WT-ga sarnasel tasemel. Et püüda mõõta jääkparandust PV46LD ja PV50LD primaarsetes fibroblastides, mis näitasid ERCC1R156W mutantse valgu tugevalt vähenenud ekspressiooni, viisime läbi UDS-katsed, milles lubasime rakkudel lisada EdU-d pikema aja jooksul (4 tundi), et jäädvustada jääkparandust. . Kui XPA-puudulike XP1PD rakkude UDS oli endiselt alla ~10 protsendi, siis PV46LD ja PV50LD rakkudes suurenes UDS nendes tingimustes ~10 protsendilt ~20 protsendini (joonis 6 J ja joonis S5 A). Need leiud näitavad, et patsiendi rakkudes madalal tasemel ekspresseeritud mutantvalk ERCC1R156W toetab NER-i jääkaktiivsust, mis tõenäoliselt selgitab mõlema õe-venna puhul täheldatud kergeid XP-sarnaseid kliinilisi tunnuseid. Nendes tingimustes tuvastasime ka jääk-UDS-i varem kirjeldatud ERCC1- puudulikes 165TOR (Jaspers et al., 2007) ja CS20LO (Kashiyama et al., 2013) rakkudes isegi kõrgemal tasemel, kui tuvastati PV46LD ja PV50LD rakkudes. (Joon. 6 J ja joon. S5 A).

ERCC1R156W mõju ICL-i remondile

ICL-i parandamise ajal värbab SLX4 karkassi valk ERCC1-XPF-i, et teha lahtihaakimislõikeid, mis võimaldavad hilisemat parandamist. Meie MS analüüs näitas, et ERCC1R156W suhtles endiselt SLX4-ga, kuigi ERCC1WT-ga võrreldes madalamal tasemel (joonis 6, A ja B). Co-IP katsed kinnitasid tõepoolest ERCC1WT tugevat koostoimet SLX4-ga, mida UV-kiirgus ei mõjutanud, samas kui interaktsioon ERCC1R156W-ga oli tugevalt vähenenud (joonis 7 A). Et lahendada, kas see vähenenud interaktsioon mõjutas ERCC1 värbamist ICL-idesse, kiiritasime rakke lokaalselt UV-A laseriga (365 nm) trioksaleeni juuresolekul, mis on psoraleeni derivaat, mis moodustab UV-kiirguse korral ICL-e (Velimezi et al. , 2018). Kohalik kiiritamine UV-A laseriga vallandas endogeense FANCD2 värbamise ainult trioksaleeniga sensibiliseeritud rakkudes, mis näitab, et meie tingimustes indutseeriti ICL-e (joonis S5 B). Võime tuvastada GFP-ERCC1WT-GFP tugevat värbamist kohalikesse ICL-idesse, samas kui ERCC1R156W värbamine oli palju nõrgem (joonis 7, B ja C), mis viitab sellele, et vähenenud interaktsioon SLX4-ga vähendab ka ERCC1R156W värbamise tõhusust. ICL-id. Siiski näitasid klonogeense ellujäämise testid pärast kokkupuudet ICL-i indutseeriva aine mitomütsiin C-ga (MMC), et ERCC1R156W päästis ERCC1-KO rakkude ülitundlikkuse MMC suhtes, kuigi veidi vähem kui ERCC1WT (joonis 7 D). Need katsed näitavad, et ERCC1R156W mutantvalk toetab ICL-i paranemist WT taseme lähedal, kui mutantset valku ekspresseeritakse peaaegu normaalsel tasemel.

Et teha kindlaks, kas PV46LD ja PV50LD patsientide fibroblastid, mis näitasid oluliselt vähenenud ERCC1R156W ekspressiooni, toetasid endiselt tõhusat ICL-i parandamist, teostasime MMC-indutseeritud kromosoomi purunemise testi. See meetod mõõdab MMC-indutseeritud kromosoomikatkesi metafaasirakkudes, mis on põhjustatud ICL-i parandamise puudulikkusest. Kui 48BR (WT) rakkudel kogunes pärast MMC-d väga vähe katkestusi, mõõdeti Fanconi patsiendilt saadud WK8103 rakkudes MMC-indutseeritud kromosoomide olulist katkemist (Poll et al., 1984; joonis 7 E). Nii PV46LD kui ka PV50LD näitasid MMC-le vastuseks suurenenud katkestuse moodustumist vahepealset fenotüüpi, kuigi mitte samal määral kui Fanconi rakud (joonis 7 E). Kooskõlas sellega olid PV50LD-hTERT rakud ja RPE1-hTERT R156W-KI rakud klonogeensetes ellujäämistestides tundlikud MMC suhtes, samas kui FANCF-puudulikud VU121F-hTERT rakud (Joenje et al., 1997) ja eriti ERCC{ {24}}KO rakud olid MMC suhtes ülitundlikud (joonis 7 F). Kokkuvõtteks võib öelda, et ERCC1R156W madalam ekspressioon ja vähenenud interaktsioon SLX4-ga mõjutavad ICL-i paranemist märkimisväärselt, kuigi patsiendirakud ei ole peaaegu nii tundlikud kui Fanconi või täielikud ERCC1-KO rakud. Tõenäoliselt seletab see, miks kahel õel-vennal FA-laadseid omadusi ei ilmne.

ERCC1R156W mõju DSB remondile

Arvestades ERCC{0}}XPF rolli DSB remondis, käsitlesime ka seda, mil määral ERCC1R156W seda parandusprotsessi endiselt toetab. Sel eesmärgil teostasime BrdU-ga sensibiliseeritud rakkudes elusrakkude pildistamise pärast UV-A laserkiirgust, et tekitada lokaalseid DSB-sid (Lukas et al., 2003). Värbamine endogeense XRCC4 võiks tuvastada saite kohaliku UV-A laserkiirguse alles pärast BrdU sensibiliseerimine (joonis S5 C), mis näitab, et DSBs indutseeriti meie tingimustes. Selgelt tuvastati ERCC1WT-GFP värbamine DSB saitidele, samas kui ERCC1R156W puhul oli see palju nõrgem (joonis 8, A ja B). Siiski ei näidanud klonogeense ellujäämise testid pärast ioniseerivat kiirgust (IR) mingit erinevust ERCC1-KO rakkude vahel, mis olid taastatud kas ERCC1WT või ERCC1R156W (joonis 8 C), mis viitab sellele, et mutantne ERCC1 valk toetab DSB paranemist.

Selle probleemi lahendamiseks patsientide rakkudes teostasime pärast IR-i suurenevate annustega kokkupuudet hTERT-immortaliseeritud fibroblastides klonogeenseid ellujäämisanalüüse. XRCC4 puudulikkusega fibroblastid (CS16NG-hTERT; Guo et al., 2015) olid infrapunakiirguse suhtes selgelt tundlikud juba väikseima annuse (2 Gy) korral. Kuid PV50LD-hTERT rakud ei olnud 2 Gy juures eriti tundlikud ja näitasid tundlikkuse suurenemist ainult suuremate annuste korral (joonis 8 D). Tegelikult näitasid täielikud ERCC{10}}KO rakud ja R156W-KI rakud infrapunakiirguse suhtes vaid marginaalset tundlikkust (joonis S5 D), mis viitab ERCC1-XPF vähesele panusele rakkude kaitsmisel infrapunakiirguse eest. Teine meetod DSB remondivõime hindamiseks on IR-indutseeritud H2AX fookuste eraldusvõime jälgimine õigeaegselt. Nii 48BR kui ka patsiendi fibroblastid näitasid H2AX fookuste normaalset kliirensit 24 tunni jooksul pärast kiiritamist füsioloogilise annusega 2 Gy (joonis 8, E ja F; ja joonis S5 E). 48BR rakkude töötlemine DNA-sõltuva proteiinkinaasi (DNA-PK) inhibiitoriga pärssis aga täielikult H2AX fookuste eraldusvõimet kõigil analüüsitud ajahetkedel (joonis 8, E ja F). Need leiud viitavad sellele, et PV46LD ja PV50LD rakud on madala kahjustuskoormuse korral DSB parandamises täielikult valdavad.