1. osa: Akteosiid pärsib RANKL-i vahendatud osteoklastogeneesi, inhibeerides C-Fos induktsiooni ja NF-KB rada ning nõrgendades ROS-i tootmist
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Abstraktne
Paljud uuringud on teatanud, et põletikulised tsütokiinid on olulised osteoklastogeneesi vahendajad, põhjustades seeläbi liigset luu resorptsiooni ja osteoporoosi.Akteosiid cistanche ürdist, Rehmannia glutinosa peamine toimeaine, mida kasutatakse laialdaselt traditsioonilises idamaade meditsiinis, on põletikuvastase ja antioksüdantse toimega. Selles uuringus leidsime, etakteosiidinhibeeris märkimisväärselt osteoklastide diferentseerumist ja moodustumist luuüdi makrofaagidest (BMM) ja RAW264.7 makrofaagidest, mida stimuleeris tuumafaktor-kappaB (NF-kB) ligandi (RANKL) retseptori aktivaator.Akteosiideeltöötlus takistas ka luu resorptsiooni küpsete osteoklastide poolt annusest sõltuval viisil. Akteosiid (10 mM) nõrgendas RANKL-i poolt stimuleeritud p38 kinaasi, ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaasi ja c-Jun N-terminaalse kinaasi aktivatsiooni ning pärssis ka NF-kB aktivatsiooni, pärssides p65 subühiku ja inhibiitori kBa fosforüülimist. Lisaks suurendab RANKL-i vahendatud c-Fos ja aktiveeritud T-rakkude tuumafaktori, tsütoplasma 1 (NFATc1) ekspressiooni ning kasvaja nekroosifaktori-a, interleukiini (IL)-1b tootmist. , ja IL-6 pärssis ilmselt eeltöötlus akteosiidiga. Lisaks suulineakteosiidvähendas ovariektoomiast põhjustatud luukadu ja põletikuliste tsütokiinide tootmist kontrolltasemele. Meie andmed viitavad sellele, et akteosiid pärsib osteoklastide diferentseerumist ja küpsemist osteoklastiliste prekursoritest, pärssides mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaaside ja transkriptsioonifaktorite, nagu NF-KB, c-Fos ja NFATc1, RANKL-indutseeritud aktivatsiooni. Need tulemused näitavad ühiselt, et akteosiid võib toimida resorptsioonivastase ainena, mis vähendab luukadu, blokeerides osteoklastide aktivatsiooni.
Sissejuhatus
Osteoklastide ja osteoblastide tasakaalustatud aktiivsus muudab luud pidevalt ümber [1]. Osteoklastid tekivad monotsüütide/makrofaagide liini hematopoeetilistest prekursorrakkudest, samas kui osteoblastid kuuluvad mesenhümaalsesse liini [2]. Ebanormaalne osteoklastide aktivatsioon või vähenenud osteoblastogenees võib häirida luu homöostaasi, põhjustades lõpuks selliseid haigusi nagu osteoporoos, artriit ja luuvähk [3,4]. Osteoporoos on tavaline luuhaigus, mis suurendab luumurdude riski. Kõige tavalisem osteoporoosi vorm on menopausis naistel põhjustatud östrogeenipuudusest. Ravimid, nagu kortikosteroidid ja epilepsiavastased ravimid, võivad samuti põhjustada tasakaalustamatust luu resorptsiooni ja moodustumise vahel, mis võib põhjustada osteoporoosi [5].
Osteoporoosi raviks on kasutatud paljusid resorptsioonivastaseid inhibiitoreid, sealhulgas bisfosfonaate, kaltsitoniini, östrogeeni ja selektiivseid östrogeeniretseptori modulaatoreid. Need inhibiitorid säilitavad luumassi, pärssides osteoklastide funktsiooni [6]. Östrogeeniasendusravi on menopausijärgse osteoporoosi ennetamiseks ja raviks kõige populaarsem ravi. Pikaajaline östrogeeniasendusravi võib aga suurendada endomeetriumi- ja rinnavähi riski. Seetõttu on paljud uurijad suunanud oma jõupingutused uue resorptsioonivastase aine väljatöötamisele, millel pole kõrvaltoimeid [7–10]. Kuna osteoklastid toimivad luu resorptsioonis, on paljudes uuringutes peetud peamiseks sihtmärgiks osteoklastide spetsiifilist inhibeerimist.
Osteoklastid on mitmetuumalised hiidrakud, mille moodustavad monotsüütide/makrofaagide perekonna mononukleaarsed eellasrakud hematopoeetiliste prekursorrakkude järjestikuse proliferatsiooni, diferentseerumise ja liitmise kaudu [11]. Makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor (M-CSF) ja tuumafaktori (NF)-KB (RANK) ligandi (RANKL) retseptori aktivaator on osteoklastide diferentseerumise olulised tegurid [12]. Lisaks osalevad mitmed põletikulised tsütokiinid, nagu tuumori nekroosifaktor (TNF) ja interleukiin (IL)-1b, osteoklastogeneesi, moduleerides RANKL-i, osteoprotegeriini ja M-CSF-i indutseerimist [7,13]. RANKL-i seondumine rakupinna RANK-retseptoriga põhjustab RANKL/RANK/TNFR-iga seotud faktorite (TRAF) komplekse, mis aktiveerivad järjestikku NF-kB ja mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasid (MAPK-d), sealhulgas c-Jun N-terminaalne kinaas (JNK), p38 kinaas ja ekstratsellulaarne signaaliga seotud kinaas (ERK) [14]. See aktiveerimine mängib võtmerolli osteoklastide diferentseerumise, aktivatsiooni ja ellujäämise vahendamisel. RANKL aktiveerib ka selliste transkriptsioonifaktorite ekspressiooni nagu aktiveeritud T-rakkude tuumafaktor, tsütoplasmaatiline 1 (NFATc1) ja c-Fos, mis on olulised osteoklastide arenguks [7,9]. Seetõttu peetakse RANKL-i signaaliülekannet osteoklastide aktivatsiooni ja luukadu pärssivate resorptsioonivastaste ainete peamiseks sihtmärgiks.
Akteosiidon Rehmannia glutinosa peamine aktiivne ühend, mida kasutatakse laialdaselt traditsioonilises idamaade meditsiinis [15,16]. Akteosiid on tugev antioksüdant ning sellel on hepatotoksiline, põletikuvastane ja notsitseptiivne toime [17–20]. Varem avastasime, et akteosiid vähendab türosinaasi aktiivsust ja melaniini biosünteesi, reguleerides ERK signaaliülekannet [21], kaitseb reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) vahendatud igemekahjustuste eest [22] ja pärsib mükotoksiinide poolt vahendatud rakukahjustusi [23]. Need mõjud on tihedalt seotud nukleosiidide võimega eemaldada ROS-i ja reguleerida MAPK-vahendatud signaaliülekannet. Eelkõige soovitatakse ROS-i vahendada RANKL-i indutseeritud signaaliradade ja rakuliste sündmuste vahendamiseks osteoklastides. Eeltöötlemine antioksüdantidega pärssis RANKL-i poolt indutseeritud NF-kB, ERK ja IkBa aktivatsiooni, pärssides seeläbi osteoklastogeneesi [24]. Need leiud viitasid tugevalt sellele, et lisaks põletikuvastasele toimele on antioksüdantne aktiivsus resorptsioonivastase aine jaoks ülioluline, seega võib akteosiid pärssida RANKL-i põhjustatud osteoklastogeneesi.
Käesolevas uuringus uurisime, kas akteosiidil on luukadu terapeutiline toime. Uurisime akteosiidi mõju osteoklastide diferentseerumisele ja luu resorptsioonile ning sellega seotud rakulisi mehhanisme, kasutades in vitro ja in vivo katsesüsteeme.
Cistanche akteosiid pärsib RANKL-i põhjustatud osteoklastogeneesi
Materjalid ja meetodid
Eetikaavaldus
Loomade hooldamise ja kasutamise tavad kiitis heaks Chonbuki riikliku ülikooli laboriloomade hooldamise ja kasutamise eetikakomitee (loa nr CBU 2010-0007). Kõik selle uuringu katsed viidi läbi vastavalt ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee juhistele.
Hiired, kemikaalid ja laboritarbed
Neljanädalased emased ICR-hiired osteti ettevõttest Orient Bio Inc. (Soul, Korea) ja neid hoiti temperatuuril 2261 °C ja niiskuse juures 5565 protsenti 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga, kus oli vaba juurdepääs toidule ja veele. Akteosiid (3,4-dihüdroksü-bfenetüül-Oa-ramnopüranosüül-(1R3)-4-O-kofeoüül-bD-glükopüranosiid; C29H36O15) (joonis S1) eraldati Rehmannia glutinosa lehtedest. Akteosiid lahustati enne kasutamist fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 ja M-CSF osteti ettevõttelt R & D Systems (Minneapolis, MN, USA). C-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa ja b-aktiini spetsiifilised antikehad saadi ettevõttest Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) ). Antikehad p-p38 ja p38 jaoks osteti ettevõttest Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Seerumi biokeemiliste parameetrite määramiseks osteti kaltsiumanalüüsi ja osteokaltsiini (OC) EIA komplektid ettevõttest BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) ja Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA). Seerumi TRAP5b taseme mõõtmiseks kasutati ka hiire tartraadiresistentset happefosfataasi (TRAP) testikomplekti (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA). Kui pole teisiti täpsustatud, saadi täiendavaid kemikaale ettevõttelt Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) ja laboritarbed olid ettevõttest SPL Life Sciences (Pochun, Lõuna-Korea).
Rakukultuurid
Luuüdi rakud saadi 6 nädala vanuste emaste ICR-hiirte sääreluust ja reieluust vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetoditele [25]. Luuüdi suspensiooni inkubeeriti 100- mm kultuuritassis 50 ng/ml M-CSF juuresolekul. 3 päeva pärast kasutati kleepuvaid rakke luuüdi makrofaagidena (BMM), et kutsuda esile osteoklastide diferentseerumist. Mõnda luuüdi rakke inkubeeriti ka 48 tundi ilma M-CSF-ita ja kleepuvaid rakke kultiveeriti osteoblastide diferentseerivas söötmes, nagu on kirjeldatud mujal [25]. RAW264.7 makrofaagirakke kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (FBS), 2 mM L-glutamiini ja antibiootikume. Neid rakke kasutati BMM-i vaste rakuliinina, et uurida akteosiidi mõju osteoklastogeneesile.
Osteoklastiline diferentseerumine ja TRAP-värvimine
BMM-e töödeldi eelnevalt erinevate kontsentratsioonidega (0–50 mM).akteosiid2 tundi enne stimuleerimist 100 ng/ml RANKL-iga. Kultuurisööde asendati 2. ja 5. päeval värske söötmega. Pärast 7-päevast inkubeerimist fikseeriti kultuurid 4% PBS-puhverdatud paraformaldehüüdis ja värviti TRAP-iga, kasutades Sigma Aldrichi komplekti vastavalt tootja juhistele. TRAP-positiivsed rakud loendati optilise mikroskoopia abil ja 3 või enamat tuuma sisaldavaid rakke peeti osteoklastideks. RAW 264.7 rakke eksponeeriti ka 100 ng/ml RANKL-iga pärast 2-tunnist eeltöötlemist akteosiidiga ja pärast 7-päevast inkubeerimist töödeldi rakke TRAP-värvimiseks.
Rakkude elujõulisuse mõõtmine
Rakkude elujõulisus määrati vees lahustuva tetrasooliumsoola (WST)-8 reagendiga. Lühidalt, BMM-e või RAW264.7 rakke, mida kasvatati 10 protsenti FBS-i ja antibiootikume sisaldavas kasvusöötmes, töödeldi 10 mM akteosiidi või fenoolse ühendiga, nagu kvertsetiin, luteoliin, apigeniin või epigallokatehhiin{6}-gallaat (EGCG). WST-8 reaktiiv lisati kultuuridele pärast 48-tunnist inkubeerimist. Pärast täiendavat 4-tunnist inkubeerimist mõõdeti WST{10}} spetsiifiline neeldumine 450 nm juures, kasutades mikroplaadilugejat (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).
Luu resorptsiooni test
BMM-id (16105 rakku/ml) suspendeeriti a-MEM-is, mis sisaldas 50 ng/ml M-CSF-i ja 100 ng/ml RANKL-i, seejärel jaotati 24-süvendi plaadile, mis oli kaetud kaltsiumfosfaadi nanokristallidega (OAAS{{6}). Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Lõuna-Korea) tihedusega 26104 rakku/cm2 koos akteosiidiga ja ilma. Pärast 7-päevast inkubeerimist eemaldati rakud plaatidelt 5-protsendilise naatriumhüpokloritiga ja optilise mikroskoobi all jälgiti süvendite moodustumist. Resorbeeritud ala mõõdeti ka pildianalüsaatoriga ja väljendati protsendina kontrollväärtusest.
Western blot analüüs
Terved valgulüsaadid valmistati lüüsipuhvris, nagu on kirjeldatud mujal [26]. Tsütosoolsed ja tuumavalgud valmistati eelnevalt kirjeldatud viisil [25]. Võrdsed kogused valguekstrakti eraldati 12–15% SDS-PAGE-ga ja blotiti polüvinüüldifluoriidmembraanidele. Blotte sondeeriti primaarsete antikehadega üleöö temperatuuril 4 °C, enne kui inkubeeriti sekundaarse antikehaga blokeerimispuhvris 1 tund. Blotid olid
töötati välja täiustatud kemoluminestsentsiga (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) ja eksponeeriti röntgenkiirtega (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).
MAPK aktiivsuse test
Rakke töödeldi eelnevaltakteosiid2 tundi ja seejärel stimuleeriti RANKL-iga veel -30 min. MAPK aktiivsuse määramiseks kasutati immunomeetrilisi analüüsikomplekte, nagu p-p38 kinaasi testikomplekt (Assay Designs, Inc., MI, USA), p-ERK ensüümi analüüsikomplekt (Assay Designs) ja p-SAPK/JNK sandwich ELISA komplekt. (Cell Signaling Technology, MA, USA). Kõik protseduurid järgisid tootja juhiseid ja neeldumist mõõdeti mikroplaadilugejaga.
Elektroforeetilise liikuvuse nihke test (EMSA)
DNA-valgu sidumisreaktsioonid viidi läbi 3 0 min toatemperatuuril, 10–15 mg valku 20 ml puhvris, mis sisaldas 1 mg/ml BSA-d, 0,5 mg/ml polü(dI-dC), 5 protsenti glütserooli. , 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 30, 000 cpm [a-32P] dCTP-ga märgistatud oligonukleotiide ja Klenowi fragmenti DNA polümeraasist. Proovid eraldati 6-protsendilistel polüakrüülamiidgeelidel, mis kuivatati ja eksponeeriti röntgenkiirtega (Eastman Kodak Co.) 12–24 tundi temperatuuril 270 uC. NF-kB spetsiifilised oligonukleotiidpraimeri järjestused olid 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 ja 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.
NF-kB lutsiferaasi test
RAW264.7 makrofaagid 24-süvendiplaatidel transfekteeriti 0,8 mg kB-lutsiferaasi reportervektoriga, kasutades 2 ml Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. 24 tundi pärast transfektsiooni stimuleeriti rakke RANKL-iga akteosiidi juuresolekul ja puudumisel 24 tundi. Rakud resuspendeeriti 100 ml reporterlüüsipuhvris
(Promega, Madison, WI, USA). Võrdsed kogused valguproove asetati 96-süvendiga mikroplaatidele ja segati lutsiferaasi substraadiga. Luminestsentsi mõõdeti mikroplaadi luminomeetriga (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksamaa). Selles katses kasutati positiivse kB inhibiitorina läbilaskvat NF-kB inhibiitorpeptiidi (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA).
Tsütokiinide mõõtmine
BMM-e või RAW264.7 rakke stimuleeriti RANKL-iga akteosiidi juuresolekul 24-augukultuuriplaatidel. Pärast 48-tunnist inkubeerimist koguti kultuuri supernatandid ja hinnati ELISA meetodil, kasutades TNF-a-, IL-1b- ja IL-6--spetsiifilisi OptEIATM komplekte vastavalt tootja juhistele.
Reaalajas pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsioon (RT-PCR)
Osteoklastiliste markerite, nagu c-Fos, NFATc1 ja TNF-a, mRNA ekspressioon määrati reaalajas RT-PCR abil. Lühidalt, kogu RNA ekstraheeriti makrofaagidest Trizoli reagendiga vastavalt tootja juhistele (Invitrogen). cDNA sünteesiti 1 mg kogu RNA-ga, kasutades SuperScript pöördtranskriptaasi II ja praimereid (Invitrogen). Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) kasutati PCR-i produkti akumuleerumise tuvastamiseks tsükli ajal järjestuse tuvastamise süsteemiga ABI 7500 (Applied Biosystems). Pärast denatureerimist 95 uC juures 10 minutit tehti PCR
viidi läbi neljakümne 3-sammulise denaturatsioonitsükliga 95 uC juures 15 sekundit, lõõmutamist 60 uC juures 1 s ja pikendamist 72 uC juures 30 sekundit. Kõik PCR reaktsioonid viidi läbi vähemalt kolmes eksemplaris ja ekspressioonitasemed normaliseeriti majapidamisgeeni HPRT suhtes samas reaktsioonis. Selles uuringus kasutati samu praimerijärjestusi, mida on kirjeldatud mujal [7].
Intratsellulaarse ROS-i mõõtmine
29,79-diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaadi (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Saksamaa) põhilahus valmistati DMSO-s ja seda säilitati temperatuuril 220 uC pimedas. Lühidalt, BMM-e (106 rakku/ml 6-süvendiplaatidel) kultiveeriti 50 ng/ml M-CSF-ga 24 tundi ja seejärel töödeldi erinevate kontsentratsioonidega (0–10 mM)akteosiid2 tundi enne stimuleerimist 100 ng/ml RANKL-iga. Pärast 1-tunnist koosinkubeerimist inkubeeriti neid rakke 30 minutit 25 mM DCFH-DA-ga. 29,79-diklorofluorestseiini (DCF) roheline fluorestsents registreeriti lainepikkusel 515 nm (FL 1), kasutades FACS VantageH süsteemi (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) ja 10,000 sündmusi loendati proovi kohta.
Munasarjade eemaldamisest põhjustatud osteoporoosi esilekutsumine
Selles uuringus kasutati emaseid ICR-hiiri (6 nädala vanused). Hiirtele tehti anesteesia all võltsoperatsioon (Sham, n =10) või tehti kirurgiline munasarjade eemaldamine (OVX, n=20). Nädal pärast operatsiooni jagati OVX hiired juhuslikult kahte rühma, igaühes 10 hiirt: kahepoolne OVX ja kahepoolne OVX, millele oli lisatud 200 ml.
Suukaudselt 1 mM akteosiidi sisaldav PBS (AC rühm). Suukaudset akteosiidi manustati üks kord iga 3 päeva järel 8 nädala jooksul pärast operatsiooni ja
sama kogus PBS-i manustati võlts- ja OVX-rühmadele. Pärast 1-päevast viimast manustamist hiired surmati ja seejärel analüüsiti seerumi biokeemilisi parameetreid ja 3-mõõtmelist luustruktuuri.
Seerumi biokeemiliste parameetrite määramine
Vereproovid koguti südame punktsiooniga ja seerum koguti tsentrifuugimisega. Biokeemiliste parameetrite analüüsimiseks säilitati seerumiproove temperatuuril 280 uC. IL-1b ja IL-6 seerumitasemeid hinnati ELISA komplekti abil, nagu ülalpool kirjeldatud, samas kui aluselise fosfataasi (ALP) aktiivsus määrati biokeemilise kolorimeetrilise testiga, mis mõõdab p kogust. -nitrofenool, mis on toodetud p-nitrofenoolfosfaadi substraadist, nagu on kirjeldatud mujal [27]. Luu moodustumise ja resorptsiooni biomarkerite hindamiseks määrati vastavalt tootja juhistele ka seerumi OC, kaltsiumi ja TRAP5b tase.
Luu struktuuri ja morfomeetriliste parameetrite analüüsid
Hiirte (Sham, OVX ja AC rühmad) reieluud lõigati lahti ja täideti füsioloogilise soolalahusega mehaaniliseks testimiseks. Reieluu mehaanilist tugevust mõõdeti nii, nagu on kirjeldatud mujal [28]. Murdekoormus registreeriti tippjõuna njuutonites kohas, kus parema reieluu keskosa murdub. Lisaks analüüsiti iga looma kerget reieluu histomorfomeetriliselt, kasutades mikrokompuutertomograafia (mikro-CT) süsteemi (SkyScan 1076 mikrofookusega röntgenisüsteem, Kontich, Belgia). Lühidalt öeldes kuivatati 4-protsendilises formaldehüüdihoidlas olevad luud pindmiselt paberrätikul, enne kui need pakkiti plastkilesse või parakilesse, et vältida kuivamist skaneerimise ajal. Iga plastikuga mähitud luu asetati vahtplastist/polüstüreenist torudesse, mis paigaldati skanneri 1076 proovikambrisse vertikaalselt horisontaalselt.
mikro-CT pildistamine. Skaneerimine viidi läbi 100 kV allika pinge ja 140 mA allika vooluga 35 mm eraldusvõimega.
Reieluu trabekulaarsete luude kolmemõõtmelised mudelid rekonstrueeriti SkyScan CT Analyzeri versiooni 1.11 abil. Struktuuriparameetrid, nagu trabekulaarne luu mineraalne tihedus (BMD, g/cm3), luumahu protsent (luumaht (BV)/koe maht (TV), protsent ), paksus (Tb.Th, mm), eraldumine (Tb.Sp , mm) ja arv (Tb.N, 1/mm) mõõdeti seejärel.
Osteogeense diferentseerumise ja mineralisatsiooni test {{{{10}}}}-süvendiga kultiveerimisplaatidel kasvatatud luuüdi rakke töödeldi DAG-ga (10 nM deksametasoon, 50 mM askorbiinhape ja 20 mM b-glütserofosfaat). 10 mM akteosiidi olemasolu. Pärast 2-nädalast diferentseerumist fikseeriti rakud 1 tund jääkülma 70-protsendilise (maht/maht) etanooliga ja värviti 0,2-protsendilise alisariinpunase S-ga destilleeritud vees 30 minutit toatemperatuuril. Pärast rakkude eemaldamist ja õhu käes kuivatamist hinnati rakukultuuri plaate valgusmikroskoopia abil, kasutades pöördmikroskoobi (Nikon TS100, Jaapan). Punase värvaine koguse määramiseks elueeriti plekki 10% atsetüülpüridiiniumkloriidiga, loksutades 20 minutit ja neeldumist mõõdeti lainepikkusel 560 nm. Rakukihtidesse ladestunud kaltsiumi kogust mõõdeti ka Calcium C komplekti (Wako Chemical Inc. Osaka, Jaapan) abil vastavalt tootja juhistele. Lisaks määrati reaalajas RT-PCR abil luu-spetsiifiliste mRNA markerite, nagu runt-seotud transkriptsioonifaktor -2 (Runx2), osterix, luu sialoproteiin (BSP) ja OC ekspressioon. Nende markerite oligonukleotiidpraimerid kavandati toote suurusega alla 200 bp, kasutades Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems), nagu on kirjeldatud mujal [27].
cistanche akteosiid suurendab luu moodustumist
Tulemused
Akteosiid inhibeerib annusest sõltuval viisil makrofaagide poolt osteoklastide moodustumist
Et kontrollida akteosiidi mõju BMM-i diferentseerumisele osteoklastideks, kultiveeriti rakke erinevates kontsentratsioonides (0–20 mM) akteosiidiga 7 päeva 50 ng/ml M-CSF ja 100 ng/ml juuresolekul. RANKL. Akteosiid vähendas osteoklastide arvu annusest sõltuval viisil. Kui rakke töödeldi 2 tundi 10 mM akteosiidiga, vähenes osteoklastide arv 43 protsenti võrreldes M-CSF-i ja RANKL-iga täiendatud rakkudega (joonis 1A). Joonis fig 1B näitab RANKL-i vahendatud osteoklastide diferentseerumist ja selle inhibeerimist kombineeritud ravi korral akteosiidiga. Kooskõlas selle tulemusega vähendas akteosiidi eeltöötlus RAW264.7 rakkude RANKL-i poolt stimuleeritud diferentseerumist ja osteoklastide moodustumist (joonised 1C ja D). Kui akteosiidi osteoklastidevastast potentsiaali BMM-idel võrreldi mitme fenoolühendi osteoklastide vastaste potentsiaalidega samal kontsentratsioonil (10 mM), oli luteoliin kõrgeim aktiivsus (joonis 2A). Kuid luteoliin, kvertsetiin või apigeniin ise vähendas rakkude elujõulisust (joonis 2B). Kõik ühendid inhibeerisid osteoklastilist diferentseerumist RAW264.7 makrofaagide poolt järgmiste suhteliste aktiivsustega: luteoliin. kvertsetiin=apigeniin .
Tistanche akteosiid inhibeerib osteoklasti