1. osa: uudne lähenemisviis endoteeli eellasrakkude tsirkuleerivate rakkude taastumispotentsiaali suurendamiseks lõppstaadiumis neeruhaigusega patsientidel

Lisateabe saamiseks. kontaktitina.xiang@wecistanche.com

Abstraktne: Tsirkuleerivad luuüdist pärinevad endoteeli eellasrakud (EPC-d) hõlbustavad veresoonte paranemist mitmes elundis, sealhulgas neerudes, kuid lõppstaadiumis vähenevad nende arv järk-järgult.neeruhaigus(ESKD) patsientidel, mis korreleerub kardiovaskulaarsete tulemuste ja sellega seotud suremusega. Seega otsustasime, kas inimese luuüdist pärinevate mesenhümaalsete stroomarakkude (BM-MSC) kudede reparatiivse toime suurendamine inimese rekombinantse relaksiini (RLX) vaskulogeense toimega võib soodustada EPC proliferatsiooni ja funktsiooni. CD34 pluss EPC-d eraldati tervete ja ESKD patsientide verest, kultiveeriti kuni hiliste EPC-de moodustumiseni, seejärel stimuleeriti BM-MSC-st saadud seisundisöötmega (CM; 25 protsenti o), RLX-ga (1 või 10 ng/ml) või mõlemaga. kombineeritud ravi. Kui RLX üksi stimuleeris EPC proliferatsiooni, kapillaartoru moodustumist ja haavade paranemist in vitro, siis BM-MSC-st tuletatud CM ja RLX kombineeritud mõju suurendas neid meetmeid kiiremini ja märkimisväärselt nii tervetelt kui ESKD patsientidelt saadud EPC-des. Nendel leidudel on oluline kliiniline mõju, kuna nad on tuvastanud uudse kombineeritud ravi, mis võib taastada ja parandada EPC arvu ja funktsiooni ESKD patsientidel.

Märksõnad: endoteeli eellasrakud; lõppstaadiumis neeruhaigus; luuüdist pärinevad mesenhümaalsed tüvirakud; relaksiin; haavade paranemist; angiogenees; regenereerimine

Müügil oleva tsistanche kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Krooniline neeruhaigus(CKD) on ülemaailmne terviseprobleem, mida defineeritakse kui glomerulaarfiltratsiooni kiiruse (GFR) vähenemist kuni 60 ml/min/1,73 m², mis sageli põhjustab lõppstaadiumis (V staadium) neeruhaigust (ESKD; määratletud kui GFR väiksem või võrdne 15 ml/min/1,73 m2)[2]. Kroonilise neeruhaiguse patoloogiliste tunnuste hulka kuuluvad tubulaarne atroofia, mis on seotud neerukapillaaride ja podotsüütide arvu vähenemisega, neerude endoteelirakkude hävimine janeerufibroos[3,4]. Nende protsesside käigus kahjustatakse neeru endoteeli, mis põhjustab angiogeneesi ja neerufunktsiooni häireid [5]. Järgnevneerukahjustus, värvatakse luuüdist pärinevad endoteeli eellasrakud (EPC) vigastuskohtadesse, et hõlbustada kudede paranemist [6]. EPC-d mängivad keskset rolli neeru endoteelirakkude küpsemisel ja proliferatsioonil, veresoonte terviklikkuses ja kahjustatud endoteeli parandamisel. Siiski väheneb tsirkuleerivate EPC-de arv ESKD-ga patsientidel [7-9] järk-järgult, mis on korrelatsioonis ebasoodsate kardiovaskulaarsete tagajärgedega [9,10] ja pikaajalise suremusega.

On teatatud, et mesenhümaalsed stroomarakud (MSC-d) soodustavad angiogeneesi, stimuleerides EPC programmeerimist. Kuigi MSC-sid on hinnatud erinevates kliinilistes uuringutes [13], ei ole uuritud nende võimet hõlbustada neerude endoteeli regeneratsiooni. Hiljutised meie laboratooriumi uuringud on tuvastanud inimese luuüdist (BM) pärinevate MSC-de kombineerimise fibroosivastase ainega, nimelt rekombinantse inimese (geen-2)relaksiiniga (serelaksiiniga; RLX[14) parema ravipotentsiaali. neerukahjustus,põletikja fibroos haiguse prekliinilistes mudelites. Kuigi RLX üksi võib stimuleerida inimese verest pärinevat EPC proliferatsiooni ja lämmastikoksiidi (NO) tootmist in vitro ning vaskulogeneesi hiirtel in vivo[18], jääb teadmata, kas selle koosmõju BM-MSC-dega võib kiirendada ja/või tugevdada EPC-d. tuletatud angiogenees ja haavade paranemine. Seega hinnati selles uuringus RLX ja BM-MSC-st tuletatud konditsioneeritud söötme (CM) kombineerimise terapeutilist potentsiaali tervetel ja ESKD patsientidelt saadud EPC proliferatsioonil, angiogeneesil ja haavade paranemisel in vitro.

2. Materjalid ja meetodid

2.1. EPC isoleerimine ja kultiveerimine perifeersest verest

Pärast allkirjastatud patsiendi nõusolekuvormi saamist koguti Austraalia Punase Risti vereteenistusest tervetelt meessoost kontrollidelt umbes {{0}} ml verd. Seevastu meessoost ESKD patsientide verd koguti Monashi meditsiinikeskusest nende tervisliku seisundi tõttu ainult ~ 5 ml. Kõiki vereproove töödeldi 24 tunni jooksul pärast kogumist. Kõik vereproovid lahjendati 1 × Hanki tasakaalustatud soolalahusega (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) kogumahuni 20 ml. Seejärel kanti veri ettevaatlikult 15 ml Ficoll-Paque Plusile (GE Healthcare, Uppsala, Rootsi) 50 ml Falconi katsutisse (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ja tsentrifuugiti 400 × g 40 minutit toatemperatuuril, et eraldada kihiline kate teistest komponentidest, kasutades eelnevalt kirjeldatud tihedusgradiendi eraldusmeetodit [19, 20]. Pärast gradiendi eraldamist eemaldati plasmat ja trombotsüüte sisaldav ülemine kiht, sisestades ettevaatlikult seroloogilise pipeti, jättes häirimata perifeerse vere mononukleaarseid rakke (PBMC-d) sisaldav buffy coat, mis koosnes endoteeli eellasrakkudest (EPC). Pellet resuspendeeriti 2 ml endoteelirakkude kasvusöötmes (EGM)-2 Microvascular (MV) Bullet Kit (toode #CC-3162, Lonza, Hayward, CA, USA); millele on lisatud 5 protsenti veise loote seerumit (FBS), 0,04 protsenti hüdrokortisooni, 0,4 protsenti inimese fibroblastide kasvufaktorit (hFGF) ja 0,1 protsenti veresoonte endoteeli kasvufaktorit (VEGF), R3-insuliinitaolist kasvufaktorit (IGF). )-1, askorbiinhape, inimese epidermise kasvufaktor (hEGF) ja gentamütsiinsulfaat/amfoteritsiin (GA-1000), et kasvatada isoleeritud EPC-sid. Rakud loendati CountessM Automated Cell Counter (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) abil, enne kui need külvati fibronektiiniga kaetud kultiveerimisplaatidele/kolbidele.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 rakku/koloonia), kasutades kolooniat moodustava ühiku (CFU) testi.

2.2. Konditsioneeritud söötme (CM) valmistamine kultiveeritud BM-MSC-st

Kuna BM-MSC-de lisamine EPC kultuuridele kahjustaks mõõdetavaid EPC-ga seotud lõpp-punkte, otsustati, et parem on analüüsida BM-MSC-st tuletatud CM-i mõju EPC funktsioonile, nagu analüüsis varem kasutati. muudest näitajatest [19]. Lühidalt, BM-MSC-sid kasvatati Alpha-Minimum Essential Media (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Austraalia), millele oli lisatud 16 protsenti veise loote seerumit (FBS) ja 1 protsenti 200 mM. L-glutamiin ja 1 protsent penitsilliini/streptomütsiini. Kui rakud saavutasid ~80% konfluentsuse, kultiveeriti BM-MSC-sid edasi ja plaaditi 12-süvendiplaadile tihedusega ~0,5 × 10 kraadi süvendi kohta ja hoiti kultuuris 24-48 h. et tagada rakuline side. Konditsioneeritud söötme (CM) valmistamiseks BM-MSC-dest pesti rakke lühidalt kolm korda eelsoojendatud 1 ml 1 × HBSS-ga. Pärast pesemisetappe 500 μL seerumit ja kasvufaktorivaba endoteelirakkude basaalsöödet (EBM); Toode #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA) lisati rakkudele ja hoiti kultuuris 5% CO, 37 kraadi juures veel 24 tundi. Selle inkubeerimisperioodi lõpus koguti CM ja tsentrifuugiti 400 × g juures 10 minutit, et eemaldada rakujäägid. CM-i 500 µl alikvootides säilitati kuni tulevase kasutamiseni -80 kraadi juures.

2.3. Funktsionaalsed testid

2.3.1. Kultiveeritud hiliste EPC-de käsitlemine

Kui hilised EPC-d olid kogutud, viidi läbi funktsionaalsed testid. Kõik katsed viidi läbi lõikudes 3-6. Funktsionaalsed testid viidi läbi, et uurida (i) 25% BM-MSC-st tuletatud konditsioneeritud söötme (25% CM)[20]; (ii) 1 [RLX-1] või 10 [RLX-10 mõju. ]ng/mL [18] RLX (esindab rasedatel leitud H2 relaksiini taset vereringes [21]); või(i) 25% CM ja 1 või 10 ng/mL RLX kombineeritud mõju; (iv) 20% FBS-i kasutati kontrollpatsientidelt saadud hiliste EPC-de proliferatsiooni ja tuubide moodustumise (angiogeense) potentsiaali positiivse kontrollina. . Ravirühmi võrreldi töötlemata rakkudega.

2.3.2.Elujõulisuse ja leviku analüüs

Hilisemate EPC-de elujõulisuse ja proliferatsioonipotentsiaali määramiseks kasutati {{0}}(4,5-dimetüütiasool-2-üül)-2,5- difenüültetrasooliumbromiidi (MTT) analüüs vastavalt tootja juhistele (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Austraalia). Lühidalt, umbes 5 × 103 rakku süvendi kohta külvati 96- süvendiplaatidele (BD Falcon, North Ryde, NSW, Austraalia), misjärel töödeldi rakke BM-MSC-st saadud CM-ga, RLX (10 ng/ ml) või CM-i ja RLX-i kombinatsiooni 1 või 10 ng/ml 24 tunni jooksul. Inkubatsiooniperioodi lõpus lisati 10 μl MTT märgistusreaktiivi (0,5 mg/ml, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Austraalia) ja inkubeeriti 37 kraadi juures 5% CO2 juures veel 4 tundi. Rakud solubiliseeriti, lisades 100 μl Solubiliseerimislahust (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia) ja hiliste EPC-de proliferatsioonipotentsiaal määrati, mõõtes iga proovi neeldumist lainepikkusel 590 nm mikroplaadi abil. lugeja (Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Austraalia) ja analüüsiti SoftMax Pro tarkvaraga Windows OS-i jaoks (versioon 7.3, Molecular Devices LLC, CA, USA). Iga ravirühm viidi läbi ja analüüsiti kuues korduses.

2.3.3. Toru moodustumise analüüs

Erinevate ravimeetodite mõju hiliste EPC-de angiogeense potentsiaali edendamiseks, kasutades toru moodustumise testi, määrati μ-angiogeneesi testiga (Abidi, Fitchburg, WI, USA). Lühidalt, 10 μl vähendatud kasvufaktoriga (GFR) Matrigeli (toode nr 356231, Corning, Tewksbury, MA, USA) lisati angiogeneesi analüüsi komplekti μ-slaidi sisemisse süvendisse (Abidi, Fitchburg, WI, WI, USA). ). Hiliste EPC-de konfluentsed kultuurid külvati kaetud rakkudele ja töödeldi BM-MSC-st saadud CM-ga, RLX-ga (10 ng/ml) või CM-i ja RLX-i kombinatsiooniga kontsentratsioonis 10 ng/ml. Igasse süvendisse kanti kogumaht 50 μl rakususpensiooni, mis sisaldas ~ 1 × 104 rakku. Pildid jäädvustati kohe ja märgiti 0-tunni ajapunktiks. Rakkude võime erinevatel töötlustel

vaadeldi vormitorusid ja pildid jäädvustati valgusmikroskoobiga 2-24 h pärast raku külvamist. Torude arv, toru pikkus ja hargnemispunktide arv määrati ImageJ tarkvara abil.

2.3.4.Haavaparanemise test

Erinevate ravimeetodite mõju hiliste EPC-de regeneratiivsele potentsiaalile määrati haavade paranemise testi abil. Testi läbiviimiseks suspendeeriti ~ 1 × 10 rakku 50 µl kasvusöötmes ja külvati haava paranemise testiks 35 mm tassi kahe süvendiga silikooni (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA). Nõude sees olevad kunsthaavad tekitati silikoonist süvendite õrna eemaldamisega steriilse pintsetiga (vahekaugus =500±100 μm）). Nõusid täiendati 2 ml 50% EGM-iga-2, lisades erinevaid aineid. ravi, sealhulgas BM-MSC-st tuletatud CM, RLX (10 ng/mL) või CM ja RLX kombinatsioon 1 või 10 ng/ml. Haava sulgemiseks migreerunud rakkude arvu hinnati valgusmikroskoopia abil. migreerunud rakud püüti kinni 0-24 h pärast töötlemist. Lõhe sulgemise ala protsent määrati Image] tarkvara abil.

2.3.5.Pildi analüüsid

Kõik funktsionaalsete testide pildianalüüsid viidi läbi, kasutades ImageJ for MacOS-i (ver. 1.8, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). Hilisemate EPC-de torude moodustumise potentsiaali jaoks analüüsiti pilte angiogeneesi analüüsi pistikprogrammi abil ja registreeriti neli erinevat parameetrit, sealhulgas kogupikkus, võrgusilmade arv, ristmike arv ja harude arv. Haava paranemise testi jaoks analüüsiti haava sulgumispiirkonda, märkides käsitsi rakuvaba ala igal ajahetkel. Kõik mõõtmised viidi läbi vähemalt 3 korda, et kontrollida varieerumist.

2.3.6. Immunofluorestsents

Relaxin Family peptiidiretseptori 1 (RXFP1; sugulasretseptor RLX) valgu lokaliseerimine kultiveeritud hilistes EPC-des määrati immunofluorestsentsvärvimise abil. Esiteks fikseeriti 13 mm klaasist katteklaasil (kaetud polü-D-lüsiiniga) 12-süvendiga plaadil kasvatatud ~1 × 1{{20}} kraadised rakud 4-protsendilises PFA-s. 15 min toatemperatuuril. Fikseeritud rakud blokeeriti mittespetsiifilise valgu sidumise jaoks, kasutades 1 protsenti veise seerumi albumiini (BSA) 60 minutit toatemperatuuril. Inkubatsiooniperioodi lõpus pesti rakke PBS-is 5 minutit (3 korda) ja inkubeeriti küüliku polüklonaalse RXFP1 antikehaga (aa 609-624; A 9227; 1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Saksamaa ) 0,01 protsenti BSA-s üleöö 4 kraadi juures. Rakke pesti PBS-ga ja inkubeeriti kitse küülikuvastase Alexa-fluor 594 sekundaarse antikehaga (1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Austraalia) 0,01% BSA-s 2 tundi toatemperatuuril. Tuumavastane värvimine viidi läbi, lisades 40 µl DAPI-d Vectashieldi kinnituskeskkonnas (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) ja kaeti katteklaas. Immunoreaktiivne RXFP1 valk visualiseeriti fluorestsentsmikroskoobi abil × 40 suurendusega (Olympus BX51) ja pildid liideti ImageJ tarkvara abil.

2.4. Statistilised analüüsid

Kõik andmed on näidatud kui keskmine ± SEM ja kõik statistilised analüüsid viidi läbi kasutades GraphPad Prism'M (ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Erinevate ravimeetodite mõju võrdlemiseks hiliste EPC-de proliferatsioonile (MTT test) ja angiogeensele (toru moodustumise test) potentsiaalile kasutati viis-ANOVA-d, millele järgnes Tukey post-hoc test, et võimaldada ravirühmade vahel palju võrdlusi. Kasutati korduvat kahesuunalist ANOVA-d, et võrrelda erinevate ravimeetodite mõju haava sulgemisele hiliste EPC-de poolt aja jooksul, millele järgnes Tukey post-hoc test, et võrrelda iga ravirühma. Statistiliselt oluliseks peeti p-väärtust alla 0,05.