1. OSA A Tistanches Herba fraktsioon/𝛽-sitosterool põhjustab mitokondriaalse lahtihaardumise redoks-tundliku esilekutsumise ja adenosiinmonofosfaadist sõltuva proteiinkinaasi/peroksisoomi proliferaatoriga aktiveeritud retseptori aktiveerimise Vähendamise efekt

Hoi Shan Wong, Jihang Chen, Pou Kuan Leong, Hoi Yan Leung, Wing Man Chan ja Kam Ming Ko

Hongkongi teadus- ja tehnoloogiaülikooli bioteaduste osakond, Kowloon, Hongkong

Correspondence should be addressed to Kam Ming Ko; bcrko@ust.hk

Saabunud 29. augustil 2014; Vastu võetud 14. jaanuaril 2015 Akadeemiline toimetaja: Man Li Autoriõigus © 2015

Hoi Shan Wong et al. See on avatud juurdepääsuga artikkel, mida levitatakse Creative Commonsi omistamislitsentsi alusel, mis lubab piiramatut kasutamist, levitamist ja reprodutseerimist mis tahes kandjatel, eeldusel, et originaalteosele on õigesti tsiteeritud. Varasemad uuringud on näidanud, et HCF1, poolpuhastatud fraktsioonCistanches Herba, põhjustab normaalse dieediga ja kõrge rasvasisaldusega dieediga toidetud hiirte kehakaalu langust. Kaalu vähenemine oli seotud mitokondriaalse lahtihaakumise esilekutsumisega ja metaboolsete ensüümide aktiivsuse muutustega hiire skeletilihastes. HCF1- indutseeritud kaalulanguse aluseks oleva biokeemilise mehhanismi edasiseks uurimiseks uuriti HCF1 ja selle aktiivse komponendi, 𝛽-sitosterooli (BSS) mõju C2C12 müotorudele. Inkubeerimine HCF1 / BSS-ga põhjustas mitokondriaalse membraani potentsiaali (MMP) mööduva suurenemise, võib-olla mitokondriaalse sisemembraani vedeldamise tõttu. MMP suurenemine oli paralleelne mitokondriaalsete reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmise suurenemisega. Mitokondriaalne ROS omakorda vallandas valgu 3 (UCP3) lahtiühendamise teel mitokondriaalse lahtiühendamise redoks-tundliku indutseerimise. Biokeemiline analüüs näitas, et HCF1 oli võimeline aktiveerima adenosiinmonofosfaadist sõltuva proteiinkinaasi/peroksisoomi proliferaatori poolt aktiveeritud retseptori  koaktivaatori-1 rada ja suurendas seeläbi tsütokroom c oksüdaasi ja UCP3 ekspressiooni. Mitokondriaalset sidurit kasutanud loomkatsed kinnitasid ka mitokondriaalse lahtisidumise rolli HCF{16}}indutseeritud kehakaalu vähenemises. Kokkuvõtteks võib öelda, et HCF1/BSS põhjustab mitokondriaalse lahtiühendamise redoks-tundliku indutseerimise ja AMPK/PGC -1 aktiveerimise C2C12 müotorudes, mille tulemuseks on kehamassi ja rasvumise vähenemine energiatarbimise suurenemise tõttu.

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

1. Sissejuhatus

Rasvumine, mida määratletakse kui keharasva ebanormaalset kogunemist, on muutunud rahvatervise ohuks. Olenemata metaboolselt tervetest või metaboolse häirega seisunditest on leitud, et rasvumine on seotud kaasuvate haiguste ja suremuse suurenenud riskiga [1]. Tsentraalne rasvumine, kolesterooliprofiilide kõrvalekalded ja plasma triglütseriidide taseme tõus, mis kõik on rasvunud inimeste ühised tunnused, soodustavad II tüüpi diabeedi, südame-veresoonkonna haiguste, mittekardiovaskulaarsete surmajuhtumite ja rasvumisega seotud vähijuhtumite suurt esinemissagedust rasvunud inimestel. 2]. Seetõttu on kehakaalu ja rasvumise vähendamist peetud võtmetähtsusega rasvumisega seotud tervisemõjude ennetamisel. Ülekaalulisuse ravis rõhutatakse peamiselt optimaalse energiabilansi loomist energiakulu suurendamise ja/või energiatarbimise vähendamise kaudu. Elustiili muutmist, sealhulgas kehalise aktiivsuse suurendamist ja tervislike toitumisharjumuste kujundamist, peetakse üldiselt ohutuks kaalukaotuse meetodiks. Sellised lähenemisviisid on aga üldiselt osutunud ebaefektiivseks Hindawi Publishing Corporation tõenditel põhineva täiendava ja alternatiivse meditsiini köide 2015, artikli ID 142059, 12 lehekülge http://dx.doi.org/10.1155/2015/1420592 Täiendavad tõendid ja Based Alternatiivmeditsiin energiakulu suurendamiseks või energiatarbimise vähendamiseks [3]. Seetõttu uuritakse praegu aktiivselt farmakoloogiliste ainete kasutamisel põhinevaid strateegiaid. Sellega seoses on meie eelmine leid näidanud, et HCF1, poolpuhastatud fraktsioonCistanchesHerba(kuivatatud terve taimCistanche deserticolaYC Ma, mida traditsioonilises hiina meditsiinis iseloomustati kui "Yangi turgutavat" toonikut), osutus tõhusaks dieedist põhjustatud rasvumise ja sellega seotud metaboolsete häirete ennetamisel [4]. HCF1 suukaudne manustamine põhjustas normaalse dieedi (ND-) ja kõrge rasvasisaldusega dieediga (HFD-) toidetud hiirte kehakaalu languse, mis võib olla tingitud mitokondriaalsest lahtiühendamisest skeletilihastes, mille tulemusena suurenes energiakulu [4] ]. Kuid sellise HCF{10}}indutseeritud mitokondriaalse lahtiühendamise (ja seega ka kaalu vähendamise) mehhanism jääb ebaselgeks. Mitokondriaalne lahtiühendamine hajutab prootonite gradiente, viies läbi sisemise mitokondriaalse membraani (IMM) alternatiivse prootoni juhtivuse raja, mille tulemusena väheneb mitokondriaalse membraani potentsiaal ja mitokondriaalne ATP teke. See mõttetu prootonitranspordi tsükkel kulutab erinevates kudedes suure osa metaboolsest energiast ja vastutab olulise osa igapäevasest energiakulust, millele järgneb kütusemolekulide (nt rasvhapete) kasutamise suurenemine, põhjustades seeläbi kaalulangust ja rasvumise vähenemine [5, 6]. HCF1 tekitatud mitokondriaalse lahtisidumise efekti kinnitamiseks uuriti HCF1 mõju MMP ja UCP3 ekspressioonile C2C12 müotorudes, mis on C3H hiirte reielihasest pärinevad diferentseeritud lihasrakud. Meie eesmärk oli uurida HCF1 pakutava kaalulanguse aluseks olevat biokeemilist mehhanismi. Võrdluseks uuriti ka HCF1 aktiivset komponenti 𝛽-sitosterooli (BSS). Mitokondriaalse lahtiühendamise võimalikku osalust HCF1-indutseeritud kehakaalu languses HFD-ga toidetud rasvunud hiirtel uuriti täiendavalt HCF1 manustamisel koos keemilise sidestaja 6-ketokolestanooliga (kCh). Adenosiinmonofosfaadist sõltuv proteiinkinaas (AMPK), kõikjal ekspresseeritud seriini / treoniini valgu kinaas, on raku energia metabolismi kontrollimise oluline keskus. Aktiveerimisel integreerib AMPK rakusisesed / ekstratsellulaarsed signaalid ja kutsub esile raku vastuseid erinevate rakuliste signaalide kaskaadide vahendusel [7, 8]. AMPK on võimeline moduleerima rakkude metabolismi, reguleerides metaboolsete ensüümide aktiivsust otsese fosforüülimise kaudu. AMPK avaldab ka pikaajalisi toimeid transkriptsiooni tasemel, fosforüülides peroksisoomi proliferaatoriga aktiveeritud retseptori 𝛾koaktivaatori-1 (PGC-1), mis viib adaptiivsete muutusteni geeniekspressioonis, mis on seotud energia metabolismi ja mitokondriaalse funktsiooniga. [9, 10]. Sellega seoses uurisime ka HCF1/BSS mõju AMPK/PGC-1 signaalirajale C2C12 müotorudes.

cistanchedeserticola eelised

2. Materjalid ja meetodid

2.1. Taimede ekstraheerimine.

Cistanches Herba, kuivatatud kogu taimCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae) osteti kohalikult ravimtaimede edasimüüjalt (Lee Hoong Kee). Tarnija kinnitas ürdi autentsuse ja kviitungi näidis (HKUST00301) deponeeriti Hongkongi teadus- ja tehnoloogiaülikooli (HKUST) bioteaduste osakonda. ACistanchesÜrdiekstrakt saadi jahvatatud taimse materjali etanooliga ekstraheerimisel, kuumutades püstjahuti all temperatuuril 78 °C 2 tundi, nagu eelnevalt kirjeldatud [11], saagisega 14 massiprotsenti. Ekstrakt fraktsioneeriti täiendavalt silikageeli kromatograafiaga [12]. HCF1 saadi saagisega 1,14% (w/w). Ekstrakt kuivatati, aurustades lahusti alandatud rõhul temperatuuril 50 °C, ja kuivatatud ekstrakti säilitati enne kasutamist temperatuuril -20 °C.

2.2. Kemikaalid.

Anti-𝛽-aktiini antikeha, BSS (CAS 83-46- 5), proteaasi inhibiitori kokteil ja fosfataasi inhibiitori kokteil 3 osteti ettevõttelt Sigma (St Louis, MO). Anti-AMPK𝛼1/2 antikeha, anti-p-AMPK𝛼1/2 antikeha, anti-PGC-1 (H-300) antikeha, anti-UCP3 (E-18) antikeha, {{16} [4- (2-piperidiin-1-üületoksü)fenüül)]-3-püridiin-4-üülpürrasolo[1,5-a ]-pürimidiin (CC) ja 6-ketokolestanool (kCh) osteti ettevõttest Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). COX-vastane antikeha osteti ettevõttest Cell Signaling (Danvers, MA). Lamiin B1 vastane antikeha osteti ettevõttelt Abcam (Cambridge, MA). Bio-Rad analüüsi reaktiiv osteti ettevõttest Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, USA). Kõik muud kemikaalid osteti firmalt Sigma (St. Louis, MO, USA).

2.3. Rakukultuur.

C2C12, C3H hiire skeletilihastest saadud müoblastikultuur [13] Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist (ATCC), pakkus lahkelt professor Zhenguo Wu (eluteaduste osakond, HKUST). Rakuliini kultiveeriti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM) (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY), millele oli lisatud 10% (maht/maht) veiseloote seerumit (FBS), 100 IU/mL penitsilliini ja 100 µg. 1/ml streptomütsiini ja 17 mM NaHC03. C2C12 müoblastide diferentseerumine C2C12 müotorudeks kutsuti esile, asendades täieliku kultiveerimissöötme diferentseerumissöötmega, mis sisaldas 2% (maht/maht) hobuse seerumit (HS) 10% (maht/maht) FBS asemel. Rakke kasvatati 5% (maht/maht) CO2 atmosfääris õhus 37 °C juures.

Cistancheonkaalulangusefekt

2.4. Biokeemilised analüüsid C2C12 müotorudes

2.4.1. MMP.

Mitokondriaalse membraani potentsiaali mõõdeti fluorestseeruva katioonse värvainega 5,5,6,6 -tetrakloro- 1,1,3,3 -tetraetüülbensimidasolüülkarbotsüaniinjodiidi (JC- 1) [14]. Rakke kultiveeriti tihedusega 10 × 104 rakku 96-süvendiga mikrotiiterplaatidel. Pärast stabiilset kinnitumist värviti rakke 10 minutit temperatuuril 37 ∘ C 20 µM JC-1-ga (lahustunud kultuurisöötmes). Pärast eelvärvimist pesti rakke kaks korda Hanki tasakaalustatud soolalahusega (HBSS), millele oli lisatud 0,1 protsenti veise seerumi albumiini (BSA). MMP mõõtmine algatati HCF1/BSS-i sisaldava söötme lisamisega. JC-1 molekulide J-agregaadi kogus, mis moodustub suure membraanipotentsiaaliga mitokondrite sisemembraanis, määrati JC-1 punase fluorestsentsi jälgimise teel (Ex 485 nm/Em 580 nm). - Täiendaval ja alternatiivsel meditsiinil põhinev 3 temperatuuril 37 ∘ C 1 tund. MMP määramiseks lahutati testitud proovide fluorestsentsi intensiivsusest tühiproovide (st ainult söödet sisaldavate) proovide fluorestsentsi intensiivsused. HCF1/BSS-iga inkubeeritud rakkude MMP väärtused normaliseeriti vastavate mitte-HCF1/BSS-inkubeeritud kontrollväärtustega ja väljendati kontrollprotsendina.

2.4.2. Adenosiinmonofosfaadist sõltuva proteiinkinaasi (AMPK) aktiveerimine.

C2C12 müotorud külvati (1,5 × 105 rakku) 6-süvendiga mikrotiiterplaatidele. Pärast stabiilset kinnitumist eelinkubeeriti rakke HCF1 / BSS-i sisaldava söötmega 8 tundi. Eelinkubeeritud rakud lüüsiti seejärel 300 µl naatriumdodetsüülsulfaat- (SDS-) lüüsipuhvriga (20 mM Tris-Cl, 2 mM etüleendiamiintetraäädikhape (EDTA), 3 mM etüleenglükooltetraäädikhape (EGTA), 1% (w/). v) Triton X- 100, 10% (mass/maht) glütserool, 5% SDS, 1 mM ditiotreitool (DTT), proteaasi inhibiitori kokteil ja fosfataasi inhibiitori kokteil 3, pH 7,5). Lüsaati tsentrifuugiti veel 10 minutit 12000 x g juures 4 °C juures, et eemaldada rakujäänused. AMPK aktivatsiooni ulatust hinnati fosfor-AMPK (p-AMPK) ja AMPK suhtelise suhte põhjal Western blot analüüsiga, kasutades anti-p-AMPK𝛼1/2 antikeha ja anti-AMPK𝛼1/2 antikeha pärast SDS-PAGE analüüsi. 10 (maht/maht) akrüülamiidi eraldusgeel. Laaditi rakulüsaat (20 𝜇g) ja võrdlusmarkerina kasutati 𝛽-aktiini. Immuunvärvitud valguribasid analüüsiti densitomeetriaga (Quantiscan, Biosoft) ja p-AMPK𝛼 ja AMPK𝛼 kogused (suvalised ühikud) normaliseeriti, viidates 𝛽-aktiini tasemele (suvalised ühikud) proovis.

2.4.3. PGC-1 Tuumatranslokatsioon.

C2C12 müotube kultiveeriti tihedusega 2.0×106 rakku 100 mm kultuuriplaatidel. Pärast 8-tunnist HCF1/BSS eelinkubatsiooni rakud trüpsiiniti ja inkubeeriti 1 ml jääkülma hüpotoonilise puhvriga (10 mM HEPES, 1,5 mM KCl ja 1,5 mM MgCl2, pH 7,9) temperatuuril 4 °C 10 minutit. Pärast inkubeerimist koguti rakud tsentrifuugimisega 500 x g juures 4 °C juures 10 minutit. Kogutud rakud resuspendeeriti 300 µl hüpotoonilises puhvris, millele oli lisatud 0,5 mM DTT, 0,1% (mass/maht) nonüülfenoksü-polüetoksüetanooli (NP-40) ja proteaasi inhibiitori kokteili, et hõlbustada lahustuvate tsütosoolsete valkude ekstraheerimist. . Saadud lüsaati tsentrifuugiti 12000 × g juures 4 °C juures 1 minut, et saada tsütosoolsed (supernatant) ja tuumafraktsioonid (pelletid). Tuumavalkude eraldamine saavutati pelletite inkubeerimisel 25 µl jääkülma hüpertoonilise puhvriga (20 mM HEPES, 25% (mass/maht) glütserool, 400 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0, 5 mM DTT). proteaasi inhibiitorite kokteil, pH 7,9) temperatuuril 4 °C 30 minutit, millele järgnes tsentrifuugimine kiirusel 12000 x g temperatuuril 4 °C 5 minutit. PGC-1 tuuma translokatsiooni ulatust hinnati tsütosoolsete ja tuumafraktsioonide PGC-1 taseme suhtelise suhte alusel, kasutades Western blot analüüsi, mis järgnes SDS-PAGE analüüsile, nagu eespool kirjeldatud. Laaditi nii tsütosool- kui ka tuumafraktsioonid (20 µg), kusjuures tsütosoolsete ja tuuma võrdlusmarkeritena kasutati vastavalt 𝛽-aktiini ja B1-d. PGC-1 kogused (suvalised ühikud) normaliseeriti vastavalt 𝛽-aktiini ja laminaat B1 tasemetele (suvalised ühikud) proovis.

2.4.4. Mitokondriaalne lahtiühendav valk 3 (UCP3) ja tsütokroom c oksüdaasi (COX) ekspressioon.

C2C12 müotorud külvati (20 × 106 rakku) 100 mm kultiveerimisplaatidele. Pärast stabiilset kinnitumist eelinkubeeriti rakke HCF1/BSS-i sisaldava söötmega 37 °C juures 48 tundi. Pärast HCF1/BSS-i sisaldava söötme eemaldamist rakud trüpsiiniti ja lüüsiti 300 ml SDS-lüüsipuhvri lisamisega. Rakulüsaati tsentrifuugiti 12000 × g juures 4 °C juures 10 minutit, et eemaldada rakujäänused. UCP3 ja COX tasemed supernatandis määrati Western blot analüüsiga, kasutades anti-UCP3 (E- 18) ja anti-COX antikeha pärast SDS-PAGE analüüsi, nagu ülalpool kirjeldatud. Laaditi rakulüsaat (50 𝜇g) ja võrdlusmarkerina kasutati 𝛽-aktiini. UCP3 ja COX kogused (suvalised ühikud) normaliseeriti, viidates proovis sisalduvale 𝛽-aktiini tasemele (suvalised ühikud).

2.5. Loomade eest hoolitsemine.

ICR-hiiri (8 nädalat; 30–35 g isastel ja 25–30 g emastel) hoiti 12-tunnises pimeduse/valguse tsüklis õhu/niiskusega kontrollitud keskkonnas temperatuuril umbes 22 °C ning neile lubati süüa ja vett ad libitum. Hongkongi Teadus- ja Tehnoloogiaülikooli (HKUST) looma- ja taimehooldusasutustes (APCF). Kõik katseprotseduurid kiitis heaks uurimispraktika komitee (HKUST) (loomaprotokolli kinnitusnumber 2013049; heakskiitmise kuupäev: 25. september 2013; katse kestus: 3 aastat).

2.6. Ravi protokoll.

Et uurida 6-keto-kolestanooli (kCh) mõju HCF1--indutseeritud kehakaalu langusele HFD-ga toidetud hiirtel, jaotati loomad juhuslikult 6 rühma, igas rühmas 10–15 hiirt: (1 ) normaalse toitumise (ND, 13 protsenti rasvast saadud energiat, ostetud LabDietist, tootenumber 5010) kontroll; (2) ND pluss kCh (päevaannusel 9 mg/kg); (3) HFD (60 protsenti rasvast saadud energiat; ostetud ettevõttelt Research Diet Inc., tootenumber D12492) kontroll; (4) HFD pluss HCF1 (päevaannuses 45 mg/kg); (5) HFD pluss kCh; ja (6) HFD pluss HCF1 pluss kCh. Näidati, et HCF1 põhjustas päevase annuse 45 mg/kg juures märkimisväärse kaalulanguse isastel hiirtel [4], samas kui päevaannuse 9 mg/kg juures kCh tühistas HCF1- indutseeritud lahtisidestusefekt hiire skeletilihastest eraldatud mitokondrites (andmeid pole näidatud). Loomadele manustati intragastraalselt kCh, HCF1 või HCF1/kCh 5 päeva nädalas 8 nädala jooksul (st kokku 40 annust). Kontrollhiired said ainult kandjat (oliiviõli). Katse käigus jälgiti iganädalaselt hiirte kehakaalu ja toidutarbimist. Kehakaalu muutused kvantifitseeriti, arvutades graafiku kõveraaluse pindala (AUC), mis kujutab kehamassi protsenti aja järgi (nädal 1 kuni 8) ja väljendati suvalistes ühikutes. Hiired surmati emakakaela dislokatsiooniga 24 tundi pärast viimast annustamist (koos kCh, HCF1 või HCF1/kCh) pärast üleöö paastumist. Mitokondriaalse hingamise mõõtmiseks lõigati välja gastrocnemius lihase proovid. Rasvapadjad (gonadaalne, retroperitoneaalne ja mesenteriaalne rasv) lõigati lahti ja kaaluti. Konkreetse rasvapadja massi ja kehakaalu suhet hinnati ja väljendati "rasvapadjaindeksina".

Cistancheon kaalulangetava toimega looduslik ravimtaim

2.7. Biokeemilised analüüsid hiirtel

2.7.1. Näidiste ettevalmistused.

Gastrocnemius'e lihaskoed segati 10 ml kollagenaasi lahusega (0,075% (mass/maht)) puhvris (100 mM KCl, 50 mM MOPS, pH 7,2) ja segud inkubeeriti temperatuuril 4 °C 20 minutit. Lagundatud kudede segusid tsentrifuugiti 600 x g juures 4 °C juures 20 minutit. Supernatant eemaldati; lagundatud kuded segati 20 ml jääkülma homogeniseerimispuhvriga (50 mM sahharoosi, 200 mM mannitooli, 5 mM KH2PO4, 1 mM EGTA ja 5 mM MOPS, pH 7,2) ja homogeniseeriti jääl teflonklaasist homogenisaatoriga. kiirusel 4000 p/min 25 kuni 30 täielikku lööki. Seejärel tsentrifuugiti homogenaate 600 x g juures 4 °C juures 10 minutit, saades tuumavaba fraktsiooni (supernatant). Mitokondriaalsed pelletid valmistati lihaste homogenaatidest tsentrifuugimisega 9200 x g temperatuuril 4 °C 30 minutit. Mitokondriaalsed fraktsioonid saadi pelletite suspendeerimisel puhvris, mis sisaldas 125 mM KCl, 10 mM Tris-Base, 2 mM KH2PO4, 0,5 mM EGTA ja 20 mM MOPS, pH 7,5 [15].

2.7.2. Mitokondriaalne hingamine.

Hingamissagedus hiire skeletilihastest eraldatud mitokondrites määrati vastavalt Wongi ja Ko kirjeldatule [12]. Lühidalt öeldes mõõdeti mitokondriaalset hingamist polarograafiliselt, kasutades Clarki tüüpi elektroodi (Hansatech Instruments, Norfolk) temperatuuril 30 C. Mitokondriaalseid fraktsioone (1 mg valku/ml) inkubeeriti hingamispuhvris (3{{17}). } mM KCl, 6 mM MgCl2, 75 mM sahharoosi, 1 mM EDTA ja 20 mM KH2PO4, pH 7,0). Lisati substraadi lahus, mis sisaldas 15 mM naatriumpüruvaati ja 5 mM naatriummalaati. Pärast tasakaalustamist käivitati 3. oleku hingamine ADP lisamisega (lõppkontsentratsioon 0,6 mM). Kui kogu lisatud ADP oli ATP genereerimiseks ära kasutatud, lisati 4. oleku hingamise esilekutsumiseks oligomütsiini. Hingamiskontrolli suhet (RCR) hinnati, arvutades oleku 3 ja oleku 4 hingamissageduste suhte [16].

2.7.3. Mitokondriaalne UCP3 ekspressioon hiire skeletilihases.

Mitokondriaalset UCP3 taset hinnati Western blot analüüsiga, kasutades anti-UCP3 (E-18) antikeha pärast mitokondriaalse fraktsiooni SDS PAGE analüüsi, kasutades 10% akrüülamiidi eraldusgeeli. Geelile kanti hiire skeletilihastest eraldatud mitokondriaalsed fraktsioonid (∼ 60 𝜇g) ja võrdlusmarkerina kasutati tsütokroom c oksüdaasi (COX). Immunovärvitud valguribasid analüüsiti densitomeetriaga ja UCP3 kogused (suvalised ühikud) normaliseeriti COX taseme (suvalised ühikud) suhtes proovis.

2.8. Valgu analüüs.

Valgu kontsentratsioonid määrati Bio-Rad valguanalüüsi komplekti kasutades. Mitokondrite/rakulüsaadi proovi alikvoot (10 µl) lahjendati 40 µl veega. Seejärel lisati 96-süvendiga mikrotiiterplaadi süvendisse alikvoot (10 µL) lahjendatud proovi, millele järgnes 200 µL lahjendatud Bio-Rad analüüsi reaktiivi lisamine (5-kordne lahjendus). Segul lasti 5 minutit toatemperatuuril seista ja seejärel mõõdeti reaktsioonisegu neeldumine lainepikkusel 570 nm. Valgu kontsentratsioon määrati kalibreerimiskõvera põhjal, kasutades standardina veise seerumi albumiini (BSA).

2.9. Statistiline analüüs.

Kõik andmed väljendati keskmisena ± keskmise standardviga (SEM), kui pole teisiti täpsustatud. Andmeid analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsiga (ühesuunaline ANOVA), kui ei ole teisiti märgitud, ja rühmadevahelised erinevused tuvastati Tukey vahemiku testi abil, mille <>

Cistanchedeserticolal onpalju efekte

3. Tulemused

3.1. HCF1/BSS mõju MMP-le C2C12 müotorudes.

Keemilise lahtisiduja, karbonüültsüaniidi {{0}} (trifluorometoksü)fenüülhüdrasooni (FCCP) inkubeerimine kontsentratsioonil 1 µM põhjustas ajast sõltuva MMP vähenemise, kusjuures vähenemise ulatus oli 29 protsenti. mõõtmise lõpp (joonised 1 ja 2). Seevastu HCF1 ja BSS suurendasid kontsentratsioonidel 30 ng/mL ja 10 µM MMP-d vastavalt 5 ja 4 protsenti HCF1/BSS inkubatsiooni esimese 10 minuti jooksul (joonised 1 ja 2). . Esialgsele HCF1/BSS-i indutseeritud tõusule järgnes MMP järkjärguline vähenemine vastavalt 95 ja 93 protsendini vastavast algväärtusest mõõtmise lõpus (60 min HCF1/BSS inkubatsioon) (joonised 1 ja 2). HCF1/BSS-indutseeritud muutusi MMP-s iseloomustas spetsiifiliste inhibiitorite kasutamine. Rotenoon (0, 1 nM), mitokondriaalse kompleksi I inhibiitor ja kolesterool (0, 3 µM), membraani jäikuse tugevdaja, pärssisid HCF1 / BSS-i põhjustatud muutusi MMP-s kogu mõõtmise ajal (joonised 1 ja 2). Teisest küljest vähendas koos inkubeerimine spetsiifilise UCP-de inhibiitori, GDP, keemilise sidestaja, 6-ketokolestanooli (kCh) või antioksüdandi dimetüültiouureaga (DMTU) HCF1-indutseeritud vähenemist. MMP HCF1 inkubeerimise hilisemal ajal (joonis 1). SKT, kCh ja DMTU vähendasid ka BSS-i põhjustatud MMP vähenemist BSS-i inkubeerimise hilisemal ajal, kusjuures MMP väärtus oli 110 protsenti, võrreldes vastava ajaliselt sobitatud kontrolliga (joonis 2).

3.2. HCF1 / BSS mõju AMPK aktiveerimisele C2C12 müotorudes.

HCF1 mõju AMPK-le uuriti, mõõtes fosforüülitud AMPK𝛼 (p-AMPK𝛼) ja kogu AMPK𝛼 (AMPK𝛼) suhet, mis näitab AMPK aktivatsiooni ulatust. Inkubeerimine HCF1-ga kontsentratsioonidel 30 ja 100 ng/ml põhjustas ajast sõltuva AMPK aktivatsiooni suurenemise, kusjuures selle suurenemise ulatus oli 8-tunnisel HCF1 inkubatsioonil vastavalt 32 ja 43 protsenti, võrreldes vastava ajaga. sobitatud kontroll (joonis 3). Paralleelselt HCF1-ga suurendas eelinkubatsioon BSS-iga (10 µM) märkimisväärselt AMPK aktivatsiooni ulatust 25% võrra, võrreldes eelinkubeerimata kontrolliga (joonis 5). HCF1 / BSS-indutseeritud AMPK aktiveerimine C2C12 müotorudes tühistati täielikult inkubeerimise teel kas kCh (lahtisiduja) või DMTU-ga (joonised 4 ja 5, veebis saadaval oleva lisamaterjali tabelid 1 ja 2

3.3. HCF1/BSS mõju PGC-1 tuumatranslokatsioonile C2C12 müotorudes.

PGC-1 aktiveerimist saab kaudselt mõõta PGC-1 tuuma translokatsiooni ulatuse järgi. Eelinkubeerimine HCF1 ja BSS-ga suurendas oluliselt PGC-1 tuuma translokatsiooni vastavalt 25 ja 28 protsenti, mida tõendab PGC -1 kõrgenenud suhe tuumas ja tsütoplasmas (joonised 6 ja 7). AMPK spetsiifiline inhibiitor, 6-[4-(2-piperidiin-1-üületoksü)fenüül)]-3-püridiin-4-üülpürrasolo[ 1,5-a]-pürimidiin (CC) inhibeeris kontsentratsioonis 10 µM HCF1/BSS-indutseeritud PGC-1 tuuma translokatsiooni suurenemist vastavalt 156 ja 235 protsenti C2C12 müotorudes ( tabelid 1 ja 2). HCF1/BSS-indutseeritud PGC-1 tuuma translokatsiooni välditi ka koosinkubeerimisega kas kCh või DMTU-ga (joonised 6 ja 7, lisamaterjali tabelid 1 ja 2).

3.4. HCF1 / BSS mõju mitokondriaalsele UCP3 ja tsütokroom c oksüdaasi (COX) ekspressioonile C2C12 müotorudes.

HCF1/BSS-i poolt indutseeritud aktivatsiooni tähtsuse määramiseks AMPK/PGC-1 rajas, HCF1/BSS mõju mitokondriaalsele lahtiühendamisele ja biogeneesile, mida hinnatakse UCP3 ja COX tasemega (mitokondriaalse massi usaldusväärne näitaja). rakkudes), uuriti vastavalt. Eelinkubatsioon HCF1/BSS-iga suurendas märkimisväärselt mitokondriaalset UCP3 ja COX taset, kusjuures selle tõusu ulatus oli 37 ja 23 protsenti (HCF{9}}inkubeeritud müotorudes) (joonis 8) ning 52 ja 24 protsenti (BSS-iga inkubeeritud müotorudes) ) (joonis 9), võrreldes vastava eelinkubeerimata kontrolliga. HCF1/BSS-i indutseeritud UCP3 ja COX taseme tõus hoiti täielikult ära HCF1 inkubeerimisel kCh, DMTU või

CC (lisamaterjali tabelid 1 ja 2). Tuleb märkida, et selles katses kasutatud kCh ja CC kontsentratsioonid reguleeriti vastavalt 20 ja 1 µM, et vältida kCh ja CC tsütotoksilist mõju C2C12 müotorudele (avaldamata tähelepanek).

3.5. Mitokondriaalse lahtiühendamise roll HCF{2}}indutseeritud kehakaalu vähendamisel HFD-indutseeritud rasvunud hiirtel.

Mitokondriaalse lahtisidumise võimalikku rolli HCF{0}}indutseeritud kaalu vähenemisel uuriti täiendavalt keemilise siduri kCh kasutamisega (lisamaterjali tabel 3). HCF1 indutseeris mitokondriaalse lahtiühendamise hiire skeletilihastes, mida tõendab mitokondriaalse hingamiskontrolli suhte (RCR) vähenemine ja mitokondriaalse UCP3 ekspressiooni suurenemine nii ND- kui ka HFD-ga toidetud hiirtel. kCh iseenesest (päevaannusel 9 mg/kg) suurendas ND-ga toidetud hiirtel (kuid mitte HFD-ga toidetud hiirtel) mitokondriaalset RCR-i märkimisväärselt 23 protsenti. HCF1-indutseeritud mitokondriaalne lahtiühendamine HFD-ga toidetud hiirtel pärssis täielikult kCh-ga töötlemist. HCF1 põhjustas kehakaalu langust nii ND- kui ka HFD-ga toidetud hiirtel. Seda efekti seostati HFD-indutseeritud vistseraalse rasva indeksi suurenemise pärssimisega. Erinevalt HCF1-st ei avaldanud kCh ND- ja HFD-ga loomadel 8-nädalase katse kestuse jooksul tuvastatavat mõju kehakaalu tõusule. KCh koosmanustamine HCF1-ga kaotas HCF1-indutseeritud pärssiva toime HFD poolt indutseeritud kehakaalu ja vistseraalse rasvaindeksi suurenemisele hiirtel (lisamaterjali tabel 3).