Teine osa Kuidas ravib echinacoside DNA oksüdatiivset kahjustust ja pärsib raku apoptoosi?

ESIMESE OSA AVAMISEKS KLÕPSAKE SIIN

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola'l on palju efekte, klõpsake siin, et rohkem teada saada

3.Eksperimentaalne Jagu

3.1.Lahtrid ja Kemikaalide

ATCC-lt osteti inimese kolorektaalne adenokartsinoomi SW480 rakuliin. Rakke kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i keskkonnas (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, USA), mis sisaldas 10% loote veiste seerumit (FBS) (Gibco) ja 1% (v/v) penitsilliin-streptomütsiin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) temperatuuril 37 °C niiskes atmosfääris, mis sisaldab 5% CO2.Echinacosideon ostetud Yuanye Biotechnology, Shanghai, Hiina (HPLC > 98%). Laolahendused valmistati ette DMSO-s (Sigma-Aldrich) ja töölahendused valmistati ette rakukultuuri keskkonnas.

3.2.MTT elujõulisuse analüüs

Rakud külvati 96-kaevu plaatidesse 1 × 104 rakku kaevu kohta 12 tunni jooksul ja inkubeeriti seejärel inkubeerimiselEchinacosidevõi 0,01% DMSO 24 või 48 h. Lõpuks lisati igale süvendile 20 μL MTT (3-(4,5-dimetüülthiazol-2-yl)-2,5-difenüül tetrazolium bromiidi) lahust (5 mg/ml PBS-is, pH 7,2) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja plaate inkubeeriti 4 h. Pärast MTT-d sisaldava andmekandja eemaldamist lisati igale süvendile 150 μL DMSO-d. Plaate inkubeeriti plaadi loksutil 10 minutit ja neelduvust 570 nm juures mõõdeti BioRad 680 mikroplaadilugejaga (Hercules, CA, USA). Iga katse viidi läbi kaks korda kolmekordselt. Andmeid analüüsiti GraphPad Prisma tarkvara abil (San Diego, CA, USA).

3.3.Kolooniate moodustumise analüüs

Rakud külvati 6-kaevu plaatidesse tihedusega 1 × 104 kaevu kohta 12 tunni jooksul ja inkubeeriti seejärel inkubeerimiselEchinacosidevõi 0,01% DMSO 10 päeva jooksul. Plaate pesti PBS-iga ja rakud fikseeriti jääkülma metanooliga ja värviti kristallvioleti lahusega (Sigma-Aldrich) (0,5% 25% metanooliga). Pilte pildistati pärast plaatide kuivatamist üleöö. Kristallvioletsed kristallid lahustati 70% etanoolis ja neeldumist 595 nm juures mõõtis BioRadi mikroplaadilugeja. Andmeid analüüsiti GraphPad Prisma tarkvara abil.

3.4.DNA killustatuse analüüs DAPI fluorestsentsiga Värvimist

Pärast ravimiravi pesti 24-kaevuliste plaatide rakke üks kord PBS-is, kinnitati jääkülmas 4% paraformaldehüüdis (PFA) (PFA) (Sigma-Aldrich) PBS-is 20 minutiks ja seejärel värviti 4,6-diamidino-2- fenüülindooliga (DAPI) (Sigma-Aldrich) (0,2 μg/mL) 10 minutiks toatemperatuuril. Pärast pesemist PBS-iga suleti rakud VECTASHIELD paigalduskeskkonnas (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Tuumamorfoloogiat pildistati Olympuse fluorestsentsmikroskoobiga.

Echinacoside tsistanche'is võib tugevdada immuunsüsteemi

3.5.Lahtritsükli analüüs

Rakud külvati 96-kaevu plaatidesse 1 × 104 rakku kaevu kohta 12 tunni jooksul ja inkubeeriti seejärel inkubeerimiselEchinacosidevõi 0,01% DMSO 24 tunni jooksul. Lõpuks korjati rakud trüpsiiniga (Invitrogen), pesti PBS-is kaks korda ja seejärel kinnitati jääkülma etanooliga (70%) 2 tunniks −20 °C juures. Fikseeritud rakke pesti kaks korda külmas PBS-is ja taaselustati 300 μL värskelt valmistatud PBS-is 0,1% Triton X-100, 0,2 mg/ml DNase-free RNase-free RNase A (Sigma), 10 μg/ml Propidium Iodiidiga (PI) (Roche, Indianapolis, IN, USA). Pärast inkubeerimist 37 °C juures pimedas 20 minutit filtreeriti rakud läbi nailonvõrgu (Falcon, BD Bioscience, San Jose, CA, USA), mis laaditi FACSCaliburi voolutsütomeetrile (BD Biosciences). Andmeid analüüsiti ModFiti tarkvara abil (Topsham, ME, USA).

3.6.Apoptoosi analüüs

Rakud külvati 96-kaevu plaatidesse 1 × 104 rakku kaevu kohta 12 tunni jooksul ja inkubeeriti seejärel inkubeerimiselEchinacosidevõi 0,01% DMSO 24 tunni jooksul. Lõpuks uuriti rakke lisa V-FITC apoptoosi tuvastamise komplektiga (Best, Shanghai, Hiina) vastavalt tootja juhistele. Rakke pesti kaks korda PBS-iga ja seejärel taaselustati siduvas puhvris. 5 μL iga lisa V-FITC ja Propidium Iodide (PI) (Roche) lisati järjestikku ja rakud inkubeeriti 15 minutit pimedas toatemperatuuril. Rakud laaditi FACSCaliburi voolutsütomeetrile (BD Biosciences). Andmeid analüüsiti Cell Quest tarkvara (BD Biosciences) abil.

3.7.Immunofluorestseeriv värvimine 53BP1

SW480 rakud külvati ümmargustele kattekihtidele 24-kaevulistel plaatidel. Pärast ravi koos raviEchinacosidevõi 0,01% DMSO 24 tunni jooksul, rakud fikseeriti 4% PFA-ga 20 minutiks ja blokeeriti 15% FBS-iga (0,1% Triton X-100) 1 h toatemperatuuril. Fikseeritud rakud inkubeeriti 2 tundi toatemperatuuril küüliku anti-53BP1 antikehaga (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA), lahjendatuna blokeerimislahuses 1:1000, millele järgnes värvimine Cy3-konjugeeritud kitsede küülikuvastase sekundaarse antikehaga (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) lahjendati 1:500 blokeerimispuhvris 1 h toatemperatuuril. Pärast pesemist PBS-is 3 × 5 minutit pitseeriti kaaneliigud DAPI-ga VECTASHIELD paigalduskeskkonnas klaasslaididele. Pildid on tehtud Zeiss LCM 510 konfokaalmikroskoobiga (Carl Zeiss, Jena, Saksamaa).

3.8.8-oxoG inkorporeerimise analüüs

Rakusisest 8-oxoG-d mõõdeti värvimisega Alexa 488-konjugeeritud avidiiniga (Invitrogen) [25]. Rakud külvati ümmargustele kattekihtidele 12-kaevu plaatidel. Pärast ravi koos raviEchinacosidevõi 0,01% DMSO 24 tunni jooksul, rakud fikseeriti jääkülma metanooliga 20 minutiks, millele järgnes inkubatsioon Tris-puhverdatud soolalahuses (TBS) (Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) 0,1% Triton X-100 -ga (Sigma-Aldrich) 15 minutit. Proovid blokeeriti TBS-is 0,1% Triton X-100 ja 15% FBS-iga 1 h toatemperatuuril ning seejärel värviti Alexa 488-konjugeeritud avidiiniga (0,5 μg/ml) blokeerimislahusega 1 h 37 °C juures. Pärast pesemist PBS-is 3 × 5 minutit pitseeriti kaanepildid vectashield paigalduskeskkonna klaasslaididele DAPI-ga (Vector Laboratories). Pilte tegi ja analüüsis Zeiss LCM 510 konfokaalmikroskoop.

3.9.Western Blot Analüüs

6-kaevulistes plaatides kasvatatud ja töödeldud rakud kraabiti RIPA puhvris (150 mM NaCl, 1,0% IGEPAL CA-630, 0,5% naatriumdeoksükolaat, 0,1% SDS ja 50 mM Tris, 1 mM PMSF, pH 8,0) (Sigma). Valgu kogukontsentratsiooni mõõdeti BCA komplektiga (Dingguo, Changchun, Hiina) vastavalt tootja juhistele. Proovid denatureeriti 95 °C juures 10 minutit, eraldati 4%–12% SDS-PAGE geelil ja seejärel kanti PVDF-membraanidesse (Millipore, Billerica, MA, USA). Membraanid blokeeriti tuberkuloosis 5% rasvavabas piimas 2 tunni jooksul ja inkubeeriti primaarsete antikehadega (Bcl-2, sc-492, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA; Bax, Santa Cruz, sc-493; c, Santa Cruz, sc-7159; p21, ab109520, Abcam, Cambridge, MA, USA; kaspaas 3, Abcam, ab32042; PARP, Bioss, bs-2318R; 53BP1, Bethyl Laboratories, A300-272A) üleöö temperatuuril 4 °C. Pärast PBS-iga pesemist inkubeeriti membraanid HRP konjugeeritud sekundaarsete antikehadega (Jackson ImmunoResearch Laboratories) ja visualiseeriti ECL Western blotting avastamise komplektiga (Transgen Biotech, Changchun, Hiina). Fotosid pildistas ja analüüsis imager (Tanon, Shanghai, Hiina).

3.10.Raku mõõtmine ROS

Rakusisest ROS-i mõõdeti voolutsütomeetriaga, kasutades rakupõhist ROS-analüüsikomplekti (Beyotime Biotechnology, Haimen, Hiina; S0033). Lõpus lõpusEchinacosideravis rakke kaks korda PBS-iga ja inkubeeriti 10 μM diklorofluorestseiini diatsetaadiga (DCFH-DA) 30 minutit 37 °C juures. Seejärel trüpsiseeriti ja analüüsiti rakke FACSCaliberi voolutsütomeetriga (BD Biosciences). Rakusisene ROS-i tase väljendati rakkude keskmise DCF fluorestsentsintensiivsusena.

3.11.Mitokondriaalse membraani mõõtmine Potentsiaali

Mitokondriaalse membraani potentsiaali mõõdeti JC-1 värviga (Beyotime Biotechnology, C2006) tootja juhiseid järgides. Kontroll jaEchinacoside-töödeldud rakud inkubeeriti JC-1-ga 20 minutit ja seejärel uuriti Olympuse fluorestseeruva mikroskoobi abil.

3.12.Statistiline analüüs

Statistiline analüüs viidi läbi GraphPad Prisma tarkvara abil. Olulisus arvutati dispersiooni ühesuunalise analüüsi (ANOVA) jap< 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" results="" were="" expressed="" as="" mean="" ±="">

Echinacosideincistanche:NeuroprotektsioneerimineMõju

4.Järeldused

Selles uuringus testisimeEchinacosideerinevatel inimese vähirakkude liinidel. Üllataval kombel leidsime, et

Cistanchedeserticola'l on palju efekte, klõpsake siin, et rohkem teada saada

pärssis inimese SK-HEP-1 hepatoomi, MCF-7 rinnavähi ja SW480 kolorektaalvähi rakkude vohamist. Edasised analüüsid näitasid, et Echinacoside vahistas SW480 rakud G1 faasis ja indutseeris kaspaasist sõltuva apoptoosi, aktiveerides mitokondritega seotud sisemise apoptoosi raja. Rakutsükli seiskumine oli seotud G1/S-CDK blokaatori ja DNA sünteesi inhibiitori CDKN1B (p21) upreguleerimisega ning apoptoosi seostati antiapoptootilise valgu Bcl-2 allareguleerimisega ja apoptootilise Baxi pro-apoptootilise Baxi upreguleerimisega, samuti mitokondriaalse membraani potentsiaali kadumisega. Guaniini rakusisese oksüdeeritud vormi märkimisväärne suurenemine, 8-oxoG, viitab sellele, et dNTP-de ja / või DNA molekulide oksüdatsioon suurenes, mis võis põhjustada RAKUTSÜKLI seiskumise ja apoptoosi SW480 vähirakkudes. Kuigi aluseks olevad mehhanismidEchinacoside"mõju oksüdatiivsetele kahjustustele ja apoptoosile on veel iseloomustamata, need tulemused toetavad Echinacoside'i kui uudset keemilist tellingut vähivastaste ravimite väljatöötamiseks.

Tunnustused

Neid uuringuid toetasid Jilini provintsi toetus (toetuse number: 20130101120JC) ja Jilini ülikooli uurimisfond (projekti number: 450091099029).

Autori kaastööd

Liwei Dong tegi suurema osa eksperimentaalsest tööst, analüüsis andmeid ja kirjutas käsikirja; Debin Yu ja Nuoting Wu tegid MTT ja koloonia moodustumise analüüsi; Hongge Wang ja Jiajing Niu tegid immunostainingut ja Lääne blot eksperimente; Ye Wang aitas rakutsükli ja apoptoosi eksperimentidega; ja Zhihua Zou töötas kontseptsiooni välja, analüüsis andmeid ja jälgis selle uuringu rakendamist ja käsikirja kirjutamist. Kõik autorid on esitatud käsikirja heaks kiitnud.

Huvide konfliktid

Autorid ei väida, et huvide konflikt puudub.

EchinacosideincistancheVõibpõletikuvastane

Viited

1. Jiang, Y.; Tu, P.F. Cistanche liikide keemiliste koostisosade analüüs.J. Chromatogr.2009,

1216, 1970–1979.

2. Wang, T.; Zhang, X.; Xie, W.Cistanche deserticolaY.C. Ma, "kõrbe ženšenn": ülevaade.Am. J. Chin. Med.2012,40, 1123–1141.

3. Freeman, C.; Spelman, K. Kriitiline hinnang ravimite koostoimeleEchinacea Spp.

Mol. Nutr. Toit Res.2008,52, 789–798.

4. Hudson, J.B. Fütomeditsiini rakendusedEchinacea purpurea(Lilla koonuslill) nakkushaiguste korral.J. Biomed. Biotehnoloogia.2012,2012, 769896.

5. Zhang, D.; Li, H.; Wang, J.B. Echinacoside pärsib HEWL-i amüloidset fibrillisatsiooni ja kaitseb Aβ-indutseeritud neurotoksilisuse eest.Int. J. Biol. Macromol.2015,72, 243–253.

6. Wu, Y.; Li, L.; Wen, T.; Li, Y.Q. Echinakosiidi kaitsev toime süsiniku tetrakloriidist põhjustatud hepatotoksilisusele rottidel.Toksikoloogia2007,232, 50–56.

7. Li, X.; Gou, C.; Yang, H.; Qiu, J.; Gu, T.; Wen, T. Echinacoside leevendab D-galaktosamiini ja lipopopolüsahhariidi põhjustatud ägedat maksakahjustust hiirtel apoptoosi ja põletiku pärssimise kaudu.Skaneeritud J. Gastroenterol.2014,49, 993–1000.

8. Xie, H.; Zhu, H.; Cheng, C.; Liang, Y.; Wang, Z. Echinacoside aeglustab inimese fibroblastiliste rakkude MRC-5 rakulist vananemist.Pharmazie2009,64, 752–754.

9. Wang, S.; Zheng, G.; Tian, S.; Zhang, Y.; Shen, L.; Pak, Y.; Shen, Y.; Qian, J. Echinacoside parandab vereloome funktsiooni 5-FU indutseeritud müelosupressiooni hiirtel.Elu Sci.2015,123, 86–92.

10. Jia, Y.; Guan, Q.; Guo, Y.; Du, C. Echinacoside stimuleerib rakkude vohamist ja takistab rakkude apoptoosi soolestiku epiteeli MODE-K rakkudes, reguleerides kasvufaktori-β1 ekspressiooni ümberkujundamist.J. Pharmacol. Sci.2012,118, 99–108.

11. Morikawa, T.; Ninomiya, K.; Imamura, M.; Akaki, J.; Fujikura, S.; Pan, Y.; Jüaan, D.; Yoshikawa, M.; Jia, X.; Li, Z.;et al.Atsüülitud fenüületanoolglükosiidid, echinacoside ja acteoside alatesCistanche tubulosa, parandada hiirte glükoositaluvust.J. Nat. Med.2014,68, 561–566.

12. Yang, X.; Li, F.; Yang, Y.; Shen, J.; Zou, R.; Zhu, P.; Zhang, C.; Yang, Z.; Li, P. Echinacoside'i efektiivsus ja ohutus roti osteopeenia mudelis.Evid. Põhineb täiendus. Altern. Med.2013,2013, 926928.

13. Kuang, R.; Päike, Y.; Zheng, X. Echinakosiidi kaitsva toimega seotud lämmastikoksiidi pärssimine H2O2 poolt indutseeritud PC12 rakukahjustusele.Nat. Prod. Kommuun.2010,5, 571–574.

14. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Fenüületanoidide antioksüdatiivne toime

Cistanche deserticola.Biol. Pharm. Bull.1996,19, 1580–1585.

15. Zhang, Y.; Du, Y.; Le, W.; Wang, K.; Kieffer, N.; Zhang, J. Redox kontrollib tervete ja haigete rakkude ellujäämist.Antioksüdeeritud. Redokssignaal.2011,15, 2867–2908.

16. Russo, M.T.; Blasi, M.F.; Chiera, F.; Fortini, P.; Degan, P.; Macpherson, P.; Furuichi, M.; Nakabeppu, Y.; Karran, P.; Aquilina, G.;et al.Oksünukleosiidtrifosfaadi bassein on oluline tegur geneetilise ebastabiilsuse tekkeks mittevastavuse parandamise puudulikes rakkudes.Mol. Cell. Biol.2004,24, 465–474.

17. Ventura, I.; Russo, M.T.; de Luca, G.; Bignami, M. Oksüdeeritud puriini nukleotiidid, genoomi ebastabiilsus ja neurodegeneratsioon.Mutat. Res.2010,703, 59–65.

18. Rajendran, P.; Nandakumar, N.; Rengarajan, T.; Palaniswami, R.; Gnanadhas, E.N.; Lakshminarasaiah, U.; Gopas, J.; Nishigaki, I. Antioksüdandid ja inimeste haigused.Clin. Chim. Acta2014,436, 332–347.

19. Rai, P.; Onder, T.T.; Noor, J.J.; McFaline, J.L.; Pang, B.; Dedon, P.C.; Weinberg, R.A. Oksüdeerunud nukleotiidide pidev kõrvaldamine on vajalik rakulise vananemise kiire alguse vältimiseks.Proc. Natl. Acad. Sci. USA2009,106, 169–174.

20. DeNicola, G.M.; Karreth, F.A.; Humpton, T.J.; Gopinathan, A.; Wei, C.; Frese, K.; Mangal, D.; Yu, K.H.; Yeo, C.J.; Calhoun, E.S.;et al.Onkogeenist indutseeritud Nrf2 transkriptsioon soodustab ROS-i detoksikatsiooni ja kasvajaigenees.Loodus2011,475, 106–109.

21. Santos, M.A.; Faryabi, R.B.; Ergen, A.V.; Päev, A.M.; Malachowski, A.; Canela, A.; Onozawa, M.; Lee, J.E.; Callen, E.; Gutierrez-Martinez, P.;et al.DNA-kahjustusest tingitud leukeemiarakkude diferentseerumine vähivastase barjäärina.Loodus2014,514, 107–111.

22. öeldes, V.I.; Ibrahim, M.X.; Larsson, E.; Nilsson, J.A.; Lindahl, P.; Bergo, M.O. Antioksüdandid kiirendavad kopsuvähi progresseerumist hiirtel.Sci. Transl. Med.2014,6, 221–215.

23. Harris, I.S.; Treloar, A.E.; Inoue, S.; Sasaki, M.; Guerrini, C.; Lee, K.C.; Yung, K.Y.; Brenner, D.; Knobbe-Thomsen, C.B.; Cox, M.A.;et al.Glutatiooni ja tiooredoksiini antioksüdantide rajad sünergiseerivad, et juhtida vähi alustamist ja progresseerumist.Vähirakk2015,27, 211–222.

24. Wong, H.S.; Ko, K.M. Herba Cistanches stimuleerib raku glutatiooni redoksrattasõitu reaktiivsete hapnikuliikidega, mis tekivad mitokondriaalsest hingamisest H9c2 kardiomüotsüütides.Pharm. Biol.2013,51, 64–73.

25. Struthers, L.; Patel, R.; Clark, J.; Thomas, S. 8-oxo desoksüguanosiini ja 8-oksoguaaniini otsene avastamine avidiini ja selle analoogide abil.Anal. Biochem.1998,255, 20–31.

26. Sild, G.; Rashid, S.; Martin, S.A. DNA mittevastavuse parandamine ja oksüdatiivne DNA kahjustus: mõju vähibioloogiale ja ravile.Vähk2014,6, 1597–1614.

27. Caldecott, K.W. Üheahelaline purunemise remont ja geneetiline haigus.Nat. Rev. Genet. 2008,9, 619–631.

28. Kogudus, I.M.; Minn, K.; van Deursen, J.; Chen, J. p53 Seonduv valk 53BP1 on vajalik DNA kahjustustele reageerimiseks ja kasvaja supressiooniks hiirtel.Mol. Cell. Biol.2003,23, 2556–2563.

29. Nakabeppu, Y. 8-oxo guaniini rakuline tase DNA-s või nukleotiidide basseinis mängib keskset rolli kantserogeenide tekkes ja vähirakkude ellujäämises.Int. J. Mol. Sci.2014,15, 12543–12557.

30. Colussi, D.; Brandi, G.; Bazzoli, F.; Ricciardiello, L. Kolorektaalse vähiga seotud molekulaarsed rajad: mõju haiguste käitumisele ja ennetamisele.Int.J.Mol. Sci.2013,14, 16365–16385.

31. Satelli, A.; Mitra, A.; Brownlee, Z.; Xia, X.; Bellister, S.; Overman, M.J.; Kopetz, S.; Ellis, L.M.; Meng, Q.H.; Li, S. Epiteeli-mesenhümaalne üleminek ringlevatele kasvajarakkudele, mis püüavad kasvaja progresseerumise avastamiseks.Clin. Vähk Res.2015,21, 899–906.

32. Liao, X.; Lochhead, P.; Nishihara, R.; Morikawa, T.; Kuchiba, A.; Yamauchi, M.; Imamura, Y.; Qian, Z.R.; Baba, Y.; Shima, K.;et al.Aspiriini kasutamine, kasvaja PIK3CA mutatsioon ja kolorektaalvähi ellujäämine.N. Engl. J. Med.2012,367, 1596–1606.

33. Domingo, E.; Kirik, D.N.; Sieber, O.; Ramamoorthy, R.; Yanagisawa, Y.; Johnstone, E.; Davidson, B.; Kerr, D.J.; Tomlinson, I.P.; Midgley, R. PIK3CA mutatsiooni hindamine kolorektaalse vähi mittesteroidsest põletikuvastasest ravimiravist saadava kasu ennustajana.J. Clin. Oncol.2013,31, 4297–4305.

34. Ahmed, D.; Eide, P.W.; Eilertsen, I.A.; Danielsen, S.A.; Eknaes, M.; Hektoen, M.; Lind, G.E.; Lothe, R.A. 24 käärsoolevähi rakuliini epigeneetilised ja geneetilised omadused.Onkogenees2013,2, doi:10.1038/onksis.2013.35.