Teine osa DsbA-L interakteerub VDAC1-ga mitokondrite vahendatud torurakkude apoptoosis ja aitab kaasa ägeda neeruhaiguse progresseerumisele

Tulemused

1. Isheemiline vigastus indutseeris DsbA-L ekspressiooni BUMPT rakkudes ning hiirte ja patsientide neerudes

Et uurida, kas isheemiline vigastus kutsus esile DsbA-L ekspressiooni, tühjendasime BUMPT-rakke ATP-st 2 tundi ja seejärel lasime neil taastuda kokku 4 tundi. RT-qPCR ja immunoblotanalüüsi tulemused näitasid, et DsbA-L ekspressioon indutseeriti I/R-is 2-0, saavutas haripunkti I/R-is 2-2 ja vähenes seejärel järk-järgult I/R-i tasemeni. 2-0 (joonis 1a, e ja i). DsbA-L immunofluorestsentsvärvimine kinnitas neid leide veelgi ja näitas, et DsbA-L ekspresseerub valdavalt BUMPT-rakkude tsütoplasmas (joonis 1 m ja n). Lisaks tuvastasime DsbA-L ekspressiooni C57BL / 6 hiirtel, keda raviti isheemiaga (28 minutit) ja reperfusioonikahjustusega (24 tundi ja 48 tundi). RT-PCR ja immunoblotanalüüsi tulemused näitasid, et DsbA-L ekspressioon indutseeriti nii hiirte neeru ajukoores kui ka välimises medullas pärast 24-tunnist reperfusiooni ja saavutas maksimumi 48 tundi pärast reperfusiooni (joonis 1b, c, f, g). , j ja k). Neid leide kinnitas veelgi DsbAL-i immunohistokeemiline värvimine (joonis 1 o ja p). Lõpuks uurisime, kas isheemiast põhjustatud AKI-ga patsientidel indutseeriti DsbA-L ekspressioonitasemeid. Need tulemused näitasid, et DsbA-L mRNA ja valgu tase oli isheemiast põhjustatud AKI-ga patsientidel märkimisväärselt suurenenud, võrreldes MCD patsientidega (joonis 1. d, h ja l). Neid tulemusi kinnitati täiendavalt DsbA-L immunofluorestsentsvärvimisega (joonis 1. q ja r).

Joonis 1. DsbA-L indutseeriti I/R poolt hiirte ja patsientide BUMPT rakkudes ja neerudes. I/R mudelit BUMPT rakkudes indutseeriti 10 mM antimütsiin A ja 1,5 mM kaltsiumionofooriga 2 tunni jooksul ning taastati 0, 2 ja 4 tunni jooksul. I / R hiirte mudel indutseeriti kahepoolse neeruisheemiaga 28 minutit ja reperfusiooniga 24 ja 48 tundi. Neeru biopsia proovid koguti I/R-indutseeritud AKI patsientidelt ja minimaalse muutuse haigusega (MCD) patsientidelt. ( ad ) DsbA-L ekspressiooni RT-qPCR tuvastamine BUMPT rakkudes, hiirte neerukoore koes ja medulla ja neerupatsientidel, kellel on I / R seisund või ilma. (e-h) DsbA-L ja b-tubuliini immunoblotanalüüs BUMPT-rakkudes I/R-mudeli alusel BUMPT-rakkudes, kortikaalses koes medulla- ja neerupatsientidel. (i-l) DsbA-L ja b-tubuliini valgu ekspressiooni densitomeetriline analüüs. (m, o ja q) DsbA-L immunofluorestsents ja immunohistokeemiline värvimine hiirte BUMPT rakkudes ja neerudes ning patsientidel, kellel on I / R seisund või ilma. (n, p ja r) DsbA-L värvimise kvantifitseerimisanalüüs. Algne suurendus x 400. Armiriba: 10 µM m100 µM o ja q. Iga katset (e-h, m, o ja q) korrati 6 korda sõltumatult sarnaste tulemustega. Kahe grupi võrdluseks kasutati kahepoolseid Studenti t-teste. (a-d, i-l, n, p ja r). # lk<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.

Cistanche'i eeliste saamiseks klõpsake siin

2. PT-DsbA-LKO hiirtel nõrgenesid IR-indutseeritud neerukahjustused, tubulaarrakkude apoptoos ja mitokondriaalsed kahjustused

PT-DsbA-L-WT ja PT-DsbA-L-KO hiirte pesakonnakaaslasi raviti isheemiaga (28 minutit) ja reperfusioonikahjustusega (24 tundi ja 48 tundi) või ilma. Pärast seda ravi võtsime edasiseks uurimiseks vereproovid ja neerukudede proovid. Funktsionaalselt iseloomustas I/R-indutseeritud neerufunktsiooni halvenemist vere uurea lämmastiku (BUN) ja kreatiniini taseme tõus PT-DsbA-L-WT hiirtel; see toime nõrgenes oluliselt PT-DsbA-L-KO hiirtel (joonis 2a ja b). Histoloogia ja TUNEL analüüsid kinnitasid ka seda, et I/R-indutseeris PT-DsbA-L-WT hiirtel märkimisväärseid koekahjustusi ja apoptoosi, kuigi see paranes PT-DsbA-L-KO hiirtel (joonis 2c, d, f, ja g). Huvitaval kombel näitasid elektronmikroskoopia (EM) analüüsid, et PT-DsbA-L-KO hiirtel ilmnes I / R-indutseeritud mitokondriaalse kahjustuse märkimisväärne nõrgenemine (joonis 2 e ja h). Immunoblotanalüüs kinnitas veelgi, et PT-DsbA-LKO hiired väljendasid ka madalamat lõhustatud kaspaasi -3 taset, madalamat Baxi akumuleerumise määra mitokondrites ja tsütokroom c (Cyt-c) tsütosooli vabanemise vähenemist (joonis 2). I-o). RT-qPCR analüüsi tulemused näitasid, et PT-DsbA-L-KO muutis I/R poolt põhjustatud NRF1 ja PCG{41}}a vähenemise (joonis 2 p ja q), mida kinnitas veelgi immunoblotanalüüs ( Joonis 2 r- t). Need andmed näitasid, et DsbA-L mängis I / R-indutseeritud AKI-s keskset rolli.

Joonis 2. IR-indutseeritud neerukahjustuse, tubulaarrakkude apoptoosi, mitokondrite kahjustuse ja Baxi, Cytc ja lõhustatud kaspaas3 ekspressiooni nõrgenemine PT-DsbA-L-KO hiirtel. PT-DsbA-L-KO ja PT-DsbA-L-WT pesakonnakaaslaste hiirte kahepoolsed neeruarterid kinnitati 28 minutiks ja vabastati seejärel 48 tunniks, et luua IR-mudel. (a) BUN (b) Seerumi kreatiniini (c) Hematoksüliini ja eosiini värvimine. (d) TUNEL-positiivsete rakkude tüüpilised lõigud. (e) Mitokondrite morfoloogia tuvastamine elektronmikroskoobiga. f) torukujulise kahjustuse skoor. g) TUNEL-positiivsete rakkude arv. (h) mitokondrite vigastuse skoor. (i) Lõhustatud kaspaas3 ja DsbA-L ekspressiooni ning BAX ja Cyt-c ekspressiooni immunoblotanalüüs mitokondriaalsetes ja tsütosoolsetes fraktsioonides. b-tubuliini ja GAPDH-d kasutati vastavalt terve lüsaadi või tsütosoolse laadimise kontrollina. COX IV kasutati mitokondrite laadimise kontrollina. (j-o) Nendevahelise halltoonides kujutise analüüs. (p ja q) NRF1 ja PCG ekspressiooni RT-qPCR tuvastamine-1a. (r) NRF1 ja PCG-1a ekspressiooni immunoblotanalüüs. (s ja t) Nendevahelise halltoonide kujutise analüüs. Algne suurendus x 400 või x6000. Armiriba: 100 µM in c&d 20 µM in e. Iga katset (ce, I ja r) korrati 6 korda sõltumatult sarnaste tulemustega. Mitme rühma võrdluseks kasutati ühesuunalist ANOVA-d. (a, b,f- h, jo, pq&s- t). # lk<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus sham group. * P<0.05 versus PT-DsbA-L-WT with IR group.

Cistanche tubulosa

3. DsbA-L vahendatud I/R indutseeritud apoptoos BUMPT rakkudes

Edasiseks uurimiseks, kas DsbA-L vahendab apoptoosi I/R poolt indutseeritud BUMPT rakkudes, transfekteerisime BUMPT rakud DsbA-L siRNA-ga ja seejärel tühjendasime need rakud ATP-st 2 tunni jooksul; rakkudel lasti seejärel 2 tundi taastuda. FCM analüüsid näitasid, et DsbA-L siRNA nõrgendas oluliselt I / R-indutseeritud apoptoosi BUMPT-rakkudes (joonis 3a). Immunoblotanalüüsid kinnitasid veel, et DsbA-L siRNA pärssis märkimisväärselt I/R-indutseeritud lõhustatud kaspaasi-3 ekspressiooni suurenemist, Baxi suurenenud akumuleerumist mitokondrites ja Cyt-c suurenenud vabanemist tsütosooli (joonis). 3 b-h). RT-qPCR analüüsi tulemused näitasid, et I/R surus alla NRF1 ja PCG-1a ekspressiooni, mille DsbA-L siRNA muutis ümber (joonis 3 i ja j). Immunoblotanalüüsi tulemused olid kooskõlas RT-qPCR tulemustega (joonis 3 km). Seevastu DsbA-L plasmiid suurendas I/R-indutseeritud apoptoosi BUMPT-rakkudes, suurendas lõhustatud kaspaasi ekspressiooni-3, suurendas Baxi akumulatsiooni ja suurendas Cyt-c vabanemist tsütosooli (joonis fig. 3 o- u). RT-qPCR analüüsi tulemused näitasid, et I/R pärssis NRF1 ja PCG-1a ekspressiooni, mida võimendas DsbA-L plasmiid (joonis 3 v ja w). Immunoblotanalüüsi tulemused kinnitasid veelgi RT-qPCR tulemusi (joonis 3 x-z). Need andmed kinnitasid veel, et DsbA-L-vahendatud nii apoptoosi protsessi kui ka mitokondriaalse düsfunktsiooni isheemilise vigastuse ajal.

Joonis 3. DsbA-L-vahendatud lõhustatud kaspaas3, BAX ja Cyt-c IR-indutseeritud ekspressioon BUMPT rakkudes. DsbA-L plasmiid ja siRNA transfekteeriti BUMPT rakkudesse ja seejärel eksponeeriti ATP ammendumisele 2 tundi ja taastumisele 2 tundi. (a&n) BUMPT-rakkude apoptoosi voolutsütomeetria analüüs. (b&o) Immunoblotid analüüsisid lõhustatud kaspaas3 ja DsbA-L ekspressiooni ning BAX ja Cyt-c ekspressiooni mitokondriaalsetes ja tsütosoolsetes fraktsioonides. b-tubuliini ja GAPDH-d kasutati vastavalt terve lüsaadi või tsütosoolse laadimise kontrollina. COX IV kasutati mitokondrite laadimise kontrollina. (c-h ja q-u) Nendevahelise halltoonides kujutise analüüs. (i, j ja v, w) RT-qPCR tuvastab NRF1 ja PCG-1a ekspressiooni. (k ja x) NRF1 ja PCG ekspressiooni immunoblotanalüüs-1a. (l, m ja y,z) Nendevahelise halltoonides kujutise analüüs. Iga katset (a, b, k, n, o ja x) korrati 6 korda sõltumatult sarnaste tulemustega. Mitme rühma võrdluseks kasutati ühesuunalist ANOVA-d. (c-j,c-m, p-w & y, z). # lk<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group. # P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

Cistanche toidulisand

4. DsbA-L interakteeris VDAC1-ga BUMPT rakkudes, mis olid allutatud ATP ammendumisele, samuti hiirte ja AKI-ga patsientide neerudes

Varasemad tulemused näitasid, et pingest sõltuv anioonkanal -1 (VDAC1), mis on mitokondriaalse välismembraani oluline valk, osaleb raku apoptoosis36 Meie hiljutine uuring näitas, et DsbA-L ekspresseerub ka mitokondrites. Seega oletasime, et DsbA-L suhtles VDAC1-ga, et reguleerida AKI progresseerumist. Immunosadestamise (IP) tulemused näitasid, et VDAC1-vastane antikeha tõmbas maha nii VDAC1 kui ka DsbA-L valgud, samas kui anti-DsbA-L sadestas nii DsbA-L kui ka VDAC1 BUMPT-rakkude kontroll- ja I/R-rühmade tervetes lüsaatides ja hiirte neerud ja patsientide neerud (joonis 4a). Lisaks kasutati DsbA-L ja VDAC1 ko-IP jaoks ka BUMPT-rakkude hiirte neerude ja patsientide neerude mitokondriaalseid lüsaate; leiud olid kooskõlas kogu lüsaadi omadega (joonis 4b). DsbA-L struktuur sisaldab nukleotiidi siduvat domeeni/ATPaasi domeeni (aminohapped 1-51), aminoterminaalset domeeni (NTD), dimerisatsiooni spiraalset piirkonda (aminohapped 56-178) ja karboksüülterminaalne domeen (CTD; aminohapped 185-216) (joonis 4c). VDAC1 struktuuri põhjal näitas tarkvara ennustus, et VDAC1 N-terminaalne domeen (aminohapped 1 kuni 25) võib interakteeruda DsbA-L-ga (joonis 4d). Et selgitada, millised VDAC1 domeenid võivad interakteeruda DsbA-L-ga, konstrueerisime HA-VDAC1 jaoks kolm plasmiidi, mis sisaldasid aminohappeid 1- 75, aminohappeid 76-1098 ja täielikku geeni (joonis 4e). HA-vastane antikeha sadestas DsbA-L rühmades, mis sisaldasid VDAC1 aminohapete 1-75 ja täisgeeniga, kuid mitte VDAC1 ja aminohappeid sisaldava plasmiidiga 76-1098. See näitas, et DsbA-L interakteerub VDAC1 piirkonnaga, millel on aminohapped 1-75 (joonis 4f). Edasiseks uurimiseks, millised konkreetsed VDAC1 piirkonnad interakteerusid DsbA-L-ga, transfekteerisime BUMPT rakud VDAC1 plasmiidide HA-märgisega D9-13, 22-27, D39-45, {{59 }}, D9-13, 22-27, 39-45, 55-57. IP tulemused näitasid, et HA-vastane antikeha sadestas DsbA-L ainult D39-45 ja 55-57 plasmiididega, mitte aga D9-13 ja 22-27 plasmiididega (vt joonis 4g ). See näitas veelgi, et DsbA-L interakteerub VDAC1 aminohapetega 9-13 ja 22-27. Joonisel 4g on mudel, mis näitab, kuidas DsbA-L interakteerub VDAC1 aminohapetega 9-13 ja 22-27 (joonis 4g). Need andmed näitavad ühiselt, et DsbA-L interakteerub VDAC1 aminohapetega 9-13 ja 22-27.

Joonis 4. Interaktsioon DsbA-L ja VDAC1 vahel BUMPT rakkudes koos ATP ammendumisega või ilma ning neerude I/R hiirte ja patsientide neerudes. (a&b n=3 rühma kohta) Kogu või mitokondriaalne lüsaat ekstraheeriti DsbA-L ja VDAC1 vastastikuseks kaasimmunosadendamiseks BUMPT rakkudes, mida töödeldi ATP ammendumise ja taastumisega, ning I/R-indutseeritud AKI hiirte ja patsientide neerudes. (cn=3 rühma kohta) DsbA-L funktsionaalsed domeenid ja struktuur. (dn=3 rühma kohta) DsbA-L ja VDAC1 interaktsiooni ennustusmudel. (e-gn=3 rühma kohta) Anti-HA immunosademeid analüüsiti HA suhtes ja seejärel tuvastati immunoblotanalüüsi abil DsbA-L.

Herba Cistanche

5. DsbA-L või VDAC1 kaaslokaliseerimine mitokondrites ning DsbA-L ja VDAC1 kaaslokaliseerimine (i) BUMPT rakkudes, mis on ammendunud ATP-st ning (ii) hiirte ja patsientide neerudes

IP-tulemuste kinnitamiseks viisime läbi kaaslokaliseerimise testi. Immunofluorestsents-konfokaalne mikroskoopia näitas, et DsbA-L või VDAC1 lokaliseeriti BUMPT-rakkude mitokondrites ja nii võltsitud hiirte kui ka MCD-ga patsientide neerudes ning et see toime tugevnes veelgi BUMPT-rakkudes, mis olid ammendunud ATP-st, ja hiirte neerudes. ja AKI-ga patsiendid (joonis 5 a, b, d, e, g ja h). Huvitaval kombel kinnitas immunofluorestsents-konfokaalne mikroskoopia, et DsbA-L ja VDAC1 kooslokaliseerimissignaal BUMPT rakkudes ning võltsitud hiirte ja MCD patsientide neerudes oli suhteliselt nõrk. Kuid kaaslokalisatsiooni signaal suurenes märkimisväärselt BUMPT-rakkudes, kus ATP-d oli ammendunud, ning hiirte ja AKI-ga patsientide neerudes (joonis 5 c, f ja i). Need andmed annavad ühiselt täiendavaid tõendeid DsbA-L ja VDAC1 interaktsiooni toetamiseks mitokondrites.

Joonis 5. DsbA-L ja VDAC1 kolokaliseerumine AKI hiirte ja patsientide BUMPT rakkude ja neerude mitokondrites. (a, d&g n=4 rühma kohta) DsbA-L lokaliseerimine mitokondrites BUMPT-rakkudes koos ATP ammendumise ja taastumisega või ilma, hiirte neerude mudel võlts- ja I/R-rühmades, samuti MCD ja I/R patsiendid. (b, e&h n=4 rühma kohta) VDAC1 lokaliseerimine mitokondrites BUMPT-rakkudes koos ATP ammendumise ja taastumisega või ilma, hiirte neerud modelleerivad võlts- ja I/R-rühmades, samuti MCD ja I/ R. (c, f&i n=4 rühma kohta) DsbA-L ja VDAC1 kaaslokaliseerimine mitokondrites BUMPT-rakkudes koos ATP ammendumise ja taastumisega või ilma, hiirte neerud modelleerivad võlts- ja I/R-rühmades samuti MCD ja I/R patsiendid.

6. VDAC1-vahendatud BUMPT-rakkude apoptoos, mis on põhjustatud isheemia-reperfusioonist

Järgmisena püüdsime kindlaks teha, kas VDAC1 osales BUMPT-rakkudes I / R-indutseeritud apoptoosi protsessis. Immunoblotanalüüsi tulemused näitasid, et VDAC1 ekspressioon indutseeriti I/R 2-0 juures ja saavutas haripunkti I/R 2-2 juures, seejärel vähenes järk-järgult I/R 2-0 tasemele ( Joonis 6 a ja b). FCM analüüs näitas, et I/R indutseeris BUMPT rakkudes apoptoosi; seda efekti nõrgendas VDAC1 siRNA rakendamine (joonis 6c). Immunoblotanalüüsi tulemused kinnitasid veelgi, et VDAC1 siRNA leevendas märkimisväärselt I/R-indutseeritud lõhustatud kaspaasi{11}} ekspressiooni suurenemist, Baxi suurenenud akumuleerumist mitokondrites ja Cyt-c suurenenud vabanemist tsütosooli (joonis 6d- k). Seevastu ülaltoodud muutusi võimendas VDAC1 plasmiidi üleekspressioon (joonis 6 l-s). Need andmed näitasid koos, et VDAC{18}}vahenes I/R-indutseeritud apoptoosi BUMPT-rakkudes.

Joonis 6. Lõhustatud kaspaas3, BAX ja Cyt-c IR-indutseeritud ekspressiooni BUMPT rakkudes vahendas VDAC1. VDAC1 siRNA või plasmiid transfekteeriti BUMPT rakkudesse ja seejärel eksponeeriti ATP ammendumisele 2 tundi ja taastumisele 2 tundi. ( a ) VDAC1 ja b-tubuliini immunoblotanalüüs BUMPT rakkudes. (b) Nendevahelise halltoonide kujutise analüüs (c) BUMPT-rakkude apoptoosi voolutsütomeetria analüüs. ( d ) Immunoblotid analüüsisid lõhustatud kaspaas3, VDAC1 ja DsbA-L ekspressiooni ning BAX ja Cyt-c ekspressiooni mitokondriaalsetes ja tsütosoolsetes fraktsioonides. b-tubuliini ja GAPDH-d kasutati vastavalt terve lüsaadi või tsütosoolse laadimise kontrollina. COX IV kasutati mitokondrite laadimise kontrollina. (ek) Nendevahelise halltoonide kujutise analüüs. (i) BUMPT-rakkude apoptoosi voolutsütomeetria analüüs. ( m ) Immunoblotid analüüsivad lõhustatud kaspaas3, VDAC1 ja DsbAL ekspressiooni ning BAX ja Cyt-c ekspressiooni mitokondriaalsetes ja tsütosoolsetes fraktsioonides. b-tubuliini ja GAPDH-d kasutati vastavalt terve lüsaadi või tsütosoolse laadimise kontrollina. COX IV kasutati mitokondrite laadimise kontrollina. (ns) Nendevahelise halltoonide kujutise analüüs. Iga katset (a, c, d, l & m) korrati 6 korda sõltumatult sarnaste tulemustega. Kahe grupi võrdluseks kasutati kahepoolseid Studenti t-teste. (b) Mitme rühma võrdluseks kasutati ühesuunalist ANOVA-d. (e- k ja n- s). # lk<0.05: versus saline group, sham group, or MCD group.# P<0.05 versus scramble with the saline group. * P<0.05 versus scramble with IR group.

Cistanche ekstrakt

Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h ja Dongshan Zhang a,b *

erakorralise meditsiini osakond, Hiina Rahvavabariik

b Erakorralise meditsiini ja raskete haiguste instituut, teine ​​Xiangya haigla, Kesk-Lõuna ülikool, Changsha, Hunan 410011, Hiina Rahvavabariik

c Hiina Rahvavabariigi oftalmoloogia osakond

d Hiina Rahvavabariigi kusekirurgia osakond

e Hiina Rahvavabariigi rindkere kirurgia osakond

f Hiina Rahvavabariigi teise Xiangya haigla üldkirurgia osakond

g Rahvatervise osakond, Central South University, Changsha, Hunan, Hiina Rahvavabariik

h Endokrinoloogia osakond, Shenzheni rahvahaigla, Jinani ülikooli teine ​​kliinilise meditsiini kolledž, lõunapoolse teadus- ja tehnoloogiaülikooli esimene sidushaigla, Shenzhen, Hiina rahvavabariik

1 Xiaozhou Li ja Jian Pan panustasid sellesse uuringusse võrdselt