OsaⅠ: tubulaarne mitokondriaalne AKT1 aktiveerub isheemia-reperfusioonikahjustuse ajal ja sellel on kriitiline roll kroonilise neeruhaiguse eelsoodumuses.
Apr 03, 2023
Abstraktne
Neerutuubulite düsfunktsioon võib põhjustada ägedat neerukahjustust ja muutuda krooniliseks neeruhaiguseks. Kuigi tubulaarseid mitokondreid seostatakse neerupuudulikkuse patofüsioloogiaga, on mehhanism ebaselge. Siin demonstreerime, et isheemia-reperfusioonikahjustus kutsub esile mitokondriaalse proteiinkinaasi B (tuntud ka kui AKT1) ägeda translokatsiooni ja aktiveerimise neerutuubulites. Me oletasime, et mitokondriaalne AKT1 signaalimine võib takistada ägeda neerukahjustuse ja sellele järgneva kroonilise neeruhaiguse teket. Selle ennustuse testimiseks kasutasime Cre-Loxi strateegiat, et luua kaks uut neerutuubulispetsiifilist transgeenset hiiretüve, mis kutsusid esile kas mitokondritele suunatud dominant-negatiivse AKT1 või konstitutiivselt aktiivse AKT1 ekspressiooni. mitokondritele suunatud domineerivatel AKT{10}}negatiivsetel hiirtel süvendas mitokondriaalse AKT1 inhibeerimine negatiivselt asoteemiat, tubulaarset vigastust, neerufibroosi, glomeruloskleroosi ja ellujäämist pärast isheemia-reperfusioonikahjustust. Seevastu mitokondritele suunatud konstitutiivselt aktiivsetel AKT1 hiirtel nõrgendas suurenenud tubulaarne mitokondriaalne AKT1 signaaliülekanne neerukahjustust, kaitses neerufunktsiooni ja parandas oluliselt elulemust pärast isheemia-reperfusioonikahjustust (vastavalt 76,9% vs. 20,8%). Kui mitokondriaalne AKT1 inhibeeriti, leiti neerutuubulites mitokondriaalse hingamise ja oksüdatiivse stressi suurenemine, mis toetab mitokondriaalse düsfunktsiooni rolli neerupuudulikkuse patofüsioloogias. Seega viitab meie uuring sellele, et torukujuline mitokondriaalne AKT1 signaalirada võib olla uudne sihtmärk uute strateegiate väljatöötamisel neerukahjustuste paremaks ennetamiseks ja raviks.
Tõlkeavaldus
Äge neerukahjustus (AKI) ja sellele järgnev kroonilise neeruhaiguse (CKD) areng on suured terviseprobleemid. Töötasime välja transgeense hiire mudeli ja määrasime proksimaalsete neerutuubulite mitokondrite AKT aktiveerimise rolli AKI ja CKD korral. See neerukaitse päästemehhanism võib olla uudne sihtmärk uute strateegiate väljatöötamisel AKI ja kroonilise neeruhaiguse paremaks ennetamiseks ja raviks. Tulevased uuringud peaksid kinnitama mitokondriaalse AKT signaaliraja seotust inimese neerukahjustusega ja uurima mitokondriaalse AKT1 raja ravimite sihtmärke.
Märksõnad
mitokondriaalne Akt1; Isheemia refusioonikahjustus; Äge neerukahjustus; Krooniline neeruhaigus;Cistanche ekstrakt.
Hankimiseks klõpsake siinCistanche kasulikud omadused neerudele
Sissejuhatus
Äge neerukahjustus (AKI) ja sellele järgnev kroonilise neeruhaiguse (CKD) areng on suured terviseprobleemid. Praegu on nende haigusseisundite spetsiifilised meditsiinilised ravimeetodid piiratud, osaliselt seetõttu, et puudub arusaam neerukahjustuse aluseks olevatest molekulaarsetest mehhanismidest. Neer on kehas üks energianõudlikumaid organeid ja mitokondrid, mis on vajalikud aktiivse transpordi hõlbustamiseks, õigete elektrokeemiliste gradientide säilitamiseks ja vedeliku homöostaasi reguleerimiseks, on raku ATP tootmise peamine allikas oksüdatiivse fosforüülimise kaudu. ATP tootmise häired ja mitokondriaalne düsfunktsioon võivad põhjustada suurenenud reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tootmist, mis omakorda kahjustab neerurakkude funktsiooni ja kutsub esile rakusurma. Kuigi neeruhaigusega patsientidel ning ägeda ja kroonilise neerukahjustuse loommudelitel on teatatud mitokondrite kahjustustest ja düsfunktsioonist, on teadmised mitokondrite patofüsioloogilisest rollist neerukahjustuses puudulikud.
Täiustatud mitokondriaalne funktsioon võib ära hoida isheemia-reperfusioonikahjustust (IRI). IRI isheemilise faasi ajal pärsib hapnikuvaegus mitokondriaalses hingamisahelas elektronide ülekannet ja vähendab ATP tootmist. Järgnev naatriumioonide sissevool ja prootonite väljavool aitavad taastada normaalset pH-d ja võivad soodustada rakkude ellujäämist, taastades rakusisese mahu Reperfusiooni ajal on verevoolu taastumine seotud reaktiivsete hapnikuliikide (ROS), Ca2 pluss sissevoolu suurenemisega mitokondritesse, mitokondriaalsed transmembraansed elektrokeemilised gradiendid ja apoptootiliste radade aktiveerimine Need rakusisesed muutused võivad olla kahjulikud rakkudele, mis jäävad ellu pärast esialgset isheemilist vigastust.
AKI esineb sagedamini haiglaravil olevatel patsientidel ja võib kiirendada uue kroonilise neeruhaiguse teket, süvendada olemasolevat kroonilist neeruhaigust ja viia neerude surmani. AKI-lt kroonilise neeruhaigusele ülemineku mehhanismid on ebaselged. Hiljutised loomkatsed näitavad, et neerutuubulite düsfunktsioon mängib olulist rolli AKI progresseerumisel krooniliseks neeruhaiguseks, peegeldades inimestel üleminekut AKI-lt CKD-le. Neerukahjustusi reguleerivate signaaliradade mõistmine võimaldab meil tuvastada uusi terapeutilisi sihtmärke, et leevendada neerukahjustusi ja vältida AKI progresseerumist krooniliseks neeruhaiguseks.
Seos tsütoplasmaatiliste signaaliradade ja mitokondriaalse funktsiooni vahel neerukahjustuse ajal on suures osas teadmata. Mitokondriaalne funktsioon on tihedalt seotud tsütoplasmaatilise signaaliülekande, teiste organellide ja tuumaradadega. Meie labor on tuvastanud AKT1 aktiveerimise ja translokatsiooni mitokondritesse kui võtmeetappi kardiomüotsüütide kaitsmisel IRI vigastuste eest, reguleerides oksüdatiivseid fosforüülimise komplekse, suurendades oksüdatiivse ja fosforüülimise tõhusust. ROS-i vähendamine. Siiski pole teada, kas IRI võib käivitada aktiveeritud AKT1 translokatsiooni tsütoplasmast neerutuubulite mitokondritesse. Kui mitokondriaalset AKT1 saab aktiveerida neerutuubulites vastusena neerukahjustusele, oleks oluline hinnata mitokondriaalse AKT1 patofüsioloogilist rolli ägeda neerukahjustuse (AKI) ja kroonilise neeruhaiguse (CKD) tekkes. Siin kasutasime kahte indutseeritavat neerutuubulispetsiifilist transgeenset hiiremudelit, mis moduleerivad mitokondriaalset AKT1 signaaliülekannet in vivo ja näitasid neerutuubulite mitokondriaalse AKT1 aktiveerimise kaitsvat rolli IRI ajal AKI ja sellele järgneva CKD arengu vastu.
Cistanche toidulisandid
Tulemused
Mitokondriaalse AKT1 aktiveerimine neerutuubulites IRI korral
Esmalt uurisime, kas IRI aktiveerib AKT1 neerude mitokondrites. Sel eesmärgil lõime neeru IRI mudeli, ligeerides vasaku neeruarteri 30 minutiks, millele järgnes kontralateraalne nefrektoomia (Nx). Vasaku neeruarteri ligeerimine pöörati isheemilise faasi lõpetamiseks ümber, viidi läbi reperfusioon ja vasak neer koguti näidatud ajavahemikul.
Neerutuubulitega rikastatud neerukoor isoleeriti ja mitokondrid valmistati subfraktsioneerimise teel. Reperfusioonil suurenes mitokondriaalse pAKT1 ja AKT1 arvukus, mis viitab aktiveeritud AKT1 translokatsioonile mitokondritesse (joonis 1A). See on sarnane sellega, mida täheldasime müokardis võrreldes fiktiivselt opereeritud kontrollidega või resekteeritud neerukontrollidega, kus mitokondriaalne AKT1 oli märkimisväärselt kõrgenenud 30-60 minutit pärast reperfusiooni (joonis 1A ja B) (n= 11-15). Samuti suurenes mitokondriaalne pAKT1. Need tulemused viitavad sellele, et IRI-indutseeritud AKT1 aktiveerimine ja translokatsioon neerude mitokondritesse. iHC värvimine kinnitas AKT1 fosforüülimist neerutuubulites pärast IRI-d (joonis 1C). pAKT1 taustavärvimine oli võltsitud kontrollide neerutuubulites minimaalne, samas kui pAKT1 oli pärast IRI-d neerutuubulites dramaatiliselt tõusnud (joonised 1C ja 1D). pAKT1 ei leitud üheski neerupiirkonnas, välja arvatud tuubulid. pAKT1 subtsellulaarse lokaliseerimise kinnitamiseks tuubulites värviti pAKT1 kombinatsioonis mitokondriaalsete markeritega. IRI-s täheldati neerutuubulite rakkudes pAKT1 ja mitokondrite olulist kooslokaliseerumist (joonis 1E). Need tulemused koos viitavad IRI translokatsioonile ja AKT1 aktiveerimisele mitokondritesse.
Joonis 1. Isheemia reperfusioonist põhjustatud äge translokatsioon ja AKT1 aktiveerimine neeru mitokondrites.
Indutseeritava neerutuubulispetsiifilise domineeriva negatiivse AKT ekspressiooniga transgeensete hiirte genereerimine mitokondrites
Et testida hüpoteesi, et neerutuubulaarse mitokondriaalse AKT1 aktiveerimine IRI ajal kaitseb neeru AKI ja sellele järgneva CKD arengu eest, genereerisime transgeense hiiremudeli, mis võimaldab tamoksifeeni (TAM) poolt indutseeritud ekspressiooni tubulaarsespetsiifilist mitokondriaalset sihtimist dominant-negatiivse AKT1 suhtes. N-otsa lisati domineerivad negatiivsed AKT1 (mdnAKT) ja mitokondriaalsed sihtimisjärjestused. AKT1 transgeenide tamoksifeeni tingimuslikku ekspressiooni vahendati pCALNL abil (vt materjalid ja meetodid). Et välistada segavaid mõjusid, mis on seotud transgeenimassiivide juhusliku integreerimisega genoomis, sisestati transgeeni üks koopia homoloogse rekombinatsiooni teel ES-rakkudesse sihtmärktransgeenidega kromosoomi Gt(ROSA) 26 või lookuses. Kahe geeniga hiired (KMDAKT) saadi mdnAKT hiirte tam-indutseeritud hiirte ristamise teel hemisügootsete KSP-CreERT2 hiirtega, kus tam-indutseeritud Cre aktiivsust ajendasid neerutorukeste rakuspetsiifilised kalmoduliin 16 promootorid. tam süsti indutseeritud Cre aktiivsus, isoleeritud mitokondrid ja SDS-PAGE eraldasid mitokondriaalsed valgud immunoblotimiseks. Tulemused näitasid, et TAM indutseeris edukalt mutandi AKT1 ekspressiooni. Mutantne valk oli KMDAKT hiirtel, KSPCreERT2 hiirtel ja metsiktüüpi hiirtel (maisiõli süstimine) tuvastamatu.
Neeruspetsiifilise ekspressiooni kontrollimiseks ekstraheeriti pärast TAM-i süstimist erinevatest kudedest mitokondriaalsed valgud. tema märgistatud mutant AKT1 ekspresseeriti ainult neerus. Neerulõigud värviti immunofluorestsentskujutiseks anti-his-märgise antikehade ja mitokondriaalse Mitotrackeriga. Tulemused näitasid, et kõik mutandid AKT1 värviti His-märgise antikehaga ja lokaliseeriti mitokondrites. Glomerulites AKT1 mutatsioone ei tuvastatud. Mitokondriaalse AKT1 ensümaatilist aktiivsust analüüsiti rekombinantse GSK3 abil, et kinnitada olulist negatiivset rolli tam-ravitud KMDAKT tuubulite mitokondrites. Kuna IRI aktiveerib neerutuubulite mitokondriaalset AKT1, võrdlesime pärast IRI-d AKT1 ensümaatilist aktiivsust tam-ravi saanud hiirtelt ja maisiõliga töödeldud hiirtelt eraldatud mitokondrites. Tulemused näitasid, et TAM-iga ravitud KMDAKT hiirtel inhibeeriti oluliselt neeru mitokondriaalne AKT1 aktiivsus. Seetõttu on see transgeenne hiireliin hea mudel AKT1 rolli uurimiseks tubulaarsetes mitokondrites.
Cistanche eelised
Neerutuubulite mitokondriaalse AKT inhibeerimine süvendas IRI-d in vivo
IRI indutseeriti ühepoolse neeruisheemia korral. Viimases katseseerias oli fosforüülitud AKT1 vaevu tuvastatav proksimaalsete neerutuubulite mitokondrites. Maisiõliga süstitud ja tam-süstitud KMDAKT hiirtel ei täheldatud olulisi erinevusi neerude histoloogias, vere uurea lämmastiku (BUN) ja seerumi kreatiniini (Cr) tasemes, mis viitab sellele, et mitokondriaalsel AKT1 signaalimisel ei ole algtasemel olulist rolli neerude struktuuris ja funktsioonis. enne IRI esilekutsumist. Et uurida, kas mitokondriaalne AKT1 mängib IRI ajal kaitsvat rolli, kasutati ühepoolset IRI-d AKI esilekutsumiseks maisiõli hiirtel või TAM-KMDAKT hiirtel. Vahetult pärast IRI indutseerimist saadud BUN- ega Cr-tasemetes ei olnud erinevusi, kuid TAM-KMDAKT-hiirtel olid nii BUN- kui ka Cr-tasemed 45 päeva pärast märkimisväärselt tõusnud. Need tulemused viitavad sellele, et mitokondriaalse AKT1 blokeeritud aktiveerimine neerutuubulites IRI ajal süvendas neerufunktsiooni häire hilist arengut. H&E-ga värvitud neerulõikude histoloogiline analüüs näitas, et TAM-KMDAKT hiirtel süvenes neerukahjustus. Jablonski neerutuubulite vigastuse skoor oli kõrgem, kuna torukujulise harja piire kadus, torukujuline lüüs ja rohkem prahti torukujulises luumenis (p=0.018). TAM või Cre rekombinaasi mõju välistamiseks analüüsisime ka TAM-iga süstitud KSP/CreERT2 hiiri ning Jablonski skoorid olid maisiõli KMdakt ja TAM-KSP/CreERT2 hiirtel 7. päeval pärast IRI-d sarnased (joonis 3D) (p{{ 19}}.7613). Need andmed viitavad sellele, et meie tulemusi ei seganud TAM-i ega Cre rekombinaasi toime. TAM-KMDAKT hiirtel pärast IRI-d näitas Massoni trikroomvärvimine suuremat fibrootilist pindala (protsenti) (p<0,001), millega kaasnesid korrastamata torukujulised struktuurid koos luminaalsete kihtide ja prahiga. col1a ekspressioon suurenes, mis on kooskõlas Massoni trikroomvärvimisega. tGF ekspressioon ei suurenenud, mis viitab sellele, et mitokondriaalne AKT1 ei reguleerinud põletikulist vastust. Pärast IRI-d suurenes tubulaarse vigastuse markeri KIM -1 ekspressioon TAM-KMDAKT rühmas, kinnitades suurenenud neerukahjustust TAM-KMDAKT rühmas (p=0,002).
Neerurakkude apoptoosi hindamiseks kasutati TUNEL-i värvimist. Apoptootiliste rakkude arv suurenes oluliselt TAM-KMDAKT hiirte tuubulites (p{{0}}0054) ja glomerulites (p<0,001) võrreldes kontrollrühmaga. Arvatakse, et tubulaarse mitokondriaalse AKT1 inhibeerimine IRI ajal süvendab tubulaarsete rakkude surma ja glomerulaarkahjustusi. Kooskõlas sellega suurenes TAM-KMDAKT neerutuubulite epiteelirakkudes märkimisväärselt nii kaspaas 9 (promootor) kui ka kaspaas 3 (täitja) aktiveerimine. Krooniliste glomerulaarsete muutuste edasiseks uurimiseks viidi neerulõikudele läbi perioodilise happe-Schiffi (PAS) värvimise analüüs, et kvantifitseerida glomeruloskleroosi. Kuigi 7 päeva pärast IRI-d ei täheldatud erinevust glomeruloskleroosi osas (p=0.2634), leiti TAM-KMDAKT hiirtel 45 päeva pärast IRI-d rohkem glomeruloskleroosi (p<0,001). See leid viitab sellele, et neerutuubulite mitokondriaalne AKT signaalirada võib reguleerida glomerulaarsete armide moodustumist CKD arengu ajal. Kaplan-Meieri ellujäämise analüüs näitas tubulaarse mitokondriaalse AKT inhibeerimise mõju IRI tulemusele. Elulemus vähenes pärast IRI-d TAM-KMDAKT hiirtel võrreldes kontrollidega (p{21}},0013).
TAM-KMDAKT hiirte elulemus oli 7 päeva jooksul pärast IRI-d oluliselt madalam kui kontrollidel, kuid TAM- ja maisiõli-KMDAKT hiirte BUN/Cr tasemed olid sel perioodil sarnased. Teatatud BUN/Cr muutusi TAM-iga ravitud hiirtel võidi alahinnata surnud hiirte BUN/Cr andmete puudumise tõttu. Lisaks võib TAM-KMDAKT hiirte suurem suremus olla põhjustatud pigem distaalse elundi düsfunktsioonist (kopsud, süda, aju), mitte ainult BUN/Cr muutused.
Tubulaarse mitokondriaalse AKT1 rolli hinnati ka emastel KMDAKT hiirtel. seerumi BUN/Cr ja neerude histoloogia olid TAM-KMDAKT emastel hiirtel 45 päeva pärast IRI-d suhteliselt kõrgemad. Olulist seksimõju ei täheldatud.
Taimne Cistanche
VIITED
1. Yang JY, Deng W, Chen Y jt. Mitokondriaalse Akt1 halvenenud translokatsioon ja aktiveerimine leevendas mitokondriaalset oksüdatiivset fosforüülimise kompleksi V aktiivsust diabeetilises müokardis. J Mol Cell Cardiol. 2013;59:167–175.
2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A jt. Peamiste elundite ja kudede spetsiifilised ainevahetuse määrad täiskasvanueas: hindamine puhkeenergia kulutamise mehaanilise mudeli järgi. Olen J Clin Nutr. 2010;92(6):1369–77.
3. Li SY, Susztak K. Peroksisoomi proliferaatoriga aktiveeritud retseptori gamma koaktivaatori 1alfa (PGC-1alfa) roll neeruhaiguste korral. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.
4. Portilla D, Dai G, McClure T jt. PPARalpha ja selle koaktivaatori PGC-1 muutused tsisplatiinist põhjustatud ägeda neerupuudulikkuse korral. Kidney Int. 2002;62(4):1208–18.
5. Forbes JM. Mitokondrite võimsusega mängijad neerufunktsioonis? Trends Endocrinol Metab. 2016;27(7):441–4425.
6. Szeto HH, Liu S, Soong Y jt. Mitokondriaalse bioenergeetika parandamine isheemilistes tingimustes suurendab sooja isheemia taluvust neerudes. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308(1):F11–F21.6.
7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, et al. Isheemia/reperfusioonikahjustuse rakubioloogia. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;298:229–317.
8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Molekulaarsed rajad maksa kaitsmisel isheemia/reperfusioonikahjustuse eest: 2015. aasta värskendus. Clin Sci (London). 2015;129(4):345–62.
9. Vt EJ, Jayasinghe K, Glassford N, et al. Pikaajaline risk kõrvaltoimete tekkeks pärast ägedat neerukahjustust: kohortuuringute süstemaatiline ülevaade ja metaanalüüs, kasutades kokkupuute konsensuslikke määratlusi. Kidney Int. 2019;95(1):160–72.
10. Szeto HH, Liu S, Soong Y jt. Mitokondrite kaitse pärast ägedat isheemiat hoiab ära IL-1beeta ja IL-18 pikaajalise ülesreguleerimise ning peatab kroonilise neeruhaiguse. J Am Soc Nephrol. 2017;28(5):1437–49.
11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH jt. PGC1alpha juhib NAD-i biosünteesi, ühendades oksüdatiivse metabolismi neerude kaitsega. Loodus. 2016;531(7595):528–32.
12. Tait SW, Green DR. Mitokondrid ja raku signaalimine. J Cell Sci. 2012; 125 (pt 4): 807–815.
13. Deng W, Leu HB, Chen Y jt. Proteiini kinaas B (PKB / AKT1) moodustas signaalikompleksid mitokondriaalsete valkudega ja hoidis ära glükolüütilise energia düsfunktsiooni kultiveeritud kardiomüotsüütides isheemia-reperfusioonikahjustuse ajal. Endokrinoloogia. 2014;155(5):1618–28.
14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y jt. Tõhus geenide aktiveerimine imetajarakkudes, kasutades kohaspetsiifilist Cre rekombinaasi ekspresseerivat rekombinantset adenoviirust. Nucleic Acids Res. 1995;23(19):3816–21.
15. Matsuda T, Cepko CL. In vivo elektroporatsiooniga sisestatud transgeenide kontrollitud ekspressioon. Proc Natl Acad Sci US A. 2007 1 16;104(3):1027–32.
16. Lee SA, Cozzi M, Bush EL jt. Kaugorganite düsfunktsioon ägeda neerukahjustuse korral: ülevaade. Olen J Kidney Dis. 2018;72(6):846–856.
Hugo YH Lin1,2,3,4, Nami Chen1, Yu-Han Chen1, Albert P. Ta1,2, Hsiao-Chen Lee1,5, Grant R. MacGregor6, Nosratola D. Vaziri1,2, Ping H. Wang1,2,7
1. UC Irvine'i diabeedikeskus ja California ülikooli meditsiiniosakond, Irvine, California
2. Füsioloogia ja biofüüsika osakond, California Ülikool, Irvine, California
3. Kaohsiungi meditsiiniülikooli meditsiiniosakond, Kaohsiung, Taiwan
4. Taiwani Kaohsiungi linna Ta-Tungi haigla sisehaiguste osakond
5. Kaohsiungi meditsiiniülikooli plastilise kirurgia osakond, Kaohsiung, Taiwan
6. Arengu- ja rakubioloogia osakond, California ülikool, Irvine, California
7. Diabeedi, endokrinoloogia ja ainevahetuse osakond, City of Hope'i riiklik meditsiinikeskus, Duarte, California