OSA Ⅰ: sünbiootilise Lactobacillus Bulgaricus 6c3 tüve, inuliini ja fruktooligosahhariidi manustamine vähendab indoksüülsulfaadi kontsentratsiooni ja neerukahjustusi
Mar 23, 2022
ali.ma@wecistanche.com
AlonsoJerez-Morales, JoseS.Merino, Sindy T.Diaz-Castillo jt.
1. Sissejuhatus
Krooniline neeruhaigus(CKD) peetakse püsivaks muudatuseksneerudstruktuur, selle funktsioon või kõige raskematel juhtudel mõlemad. Krooniline neeruhaigus mõjutab otseselt inimese tervist ja elukvaliteeti [1,2]. Füsioloogilisel tasemel on kroonilise neeruhaiguse põhjustatud muutused, mida sageli täheldatakse, kreatiniini, tsüstatiini ja korureiinlämmastiku taseme tõusu seerumis [2]. Intensiivistunud jälgimine ja elanikkonna teadlikkus on suurendanud kroonilise neeruhaiguse diagnooside arvu, jõudes näiteks kindlaks, et see patoloogia mõjutab 15 protsenti USA elanikkonnast [3]. Haiguse progresseerumine ja ka ülalnimetatud metaboliitide mõju avaldavad tõsist mõju paljudele kehasüsteemidele, sealhulgas südame-veresoonkonna ja seedetrakti süsteemidele, kuna nende metaboliitide esinemine on seotud suurenenud suremusega. ning mõjutab viimaste assimilatsiooni, motoorikat ja läbilaskvust [4,5]. Seedetrakti muutused kutsuvad esile metaboliitide suurenenud imendumise soolestikus, mis aitab kaasa süsteemse põletiku püsimisele, mis omakorda mõjutab normaalse mikrobiota koostist ja selle metaboolseid funktsioone ning võib põhjustada soole düsbioosi [6].
Klõpsake, et näha cistanche'i kõrvaltoimeid ja Cistanche'i neerudele mõeldud toodet
Seost kroonilise neeruhaiguse ja soole düsbioosi vahel ei pruugi seletada mitte ainult toitumise muutustega, vaid ka luminaalse pH tõusuga, mis on sekundaarne ammooniumi suurenenud kontsentratsiooni tõttu [7]. Kroonilise neeruhaiguse lõppstaadiumis patsientidel on tervete inimestega võrreldes märgatavad erinevused mitmete bakteritaksonite arvukuses nende väljaheites [8]. Eelkõige bakterite perekonna tasandil on kroonilise neeruhaigusega patsientidel suurenenud Enterorhabdus, Blautia, Ruminococcus, Parasutterella, Bacteroides, Clostridium (sensu stricto), Escherichia, Shigella ja Allobaculum ning väheneb Akkermansia, Bifidobacterium, Clostocobacilus IV,,Lactobacillus , Leuconostoc, Alkaliphilus ja Pseudomonas [9-11]. Kas neerude halva depuratsiooni või soole düsbioosi tõttu väheneb bakterite perekond, mis on võimeline metaboliseerima ja inhibeerima toksilisi metaboliite tootvaid patogeene, mille tulemuseks on nende arvu suurenemine [12]. Wong et al. [8] näitasid, et kaugelearenenud kroonilise neeruhaigusega patsientidel suurenes bakterirühmade arv, mis sisaldasid ensüüme nagu ureaas, urikaas ja p-kresooli ja indooli tootvaid ensüüme.
Ureemiliste retentsiooni metaboliitide (URM) kogunemine veres, sealhulgasindoksüülsulfaat(IS), p-kresüülsulfaat (pCS), trietüülamiin ja trimetüülamiin-N-oksiid (TMAO)[5] on postuleeritud kroonilise neeruhaiguse kiirendajatena [13]. ON(Indoksüülsulfaat)ureemilist indooli, mis on tuntuim ureemiline indool, erituvad proksimaalsete keerdunud tuubulite kaudu.neerudja see pärineb trüptofaani metabolismist bakteriaalse trüptofanaasi poolt. Loommudelite tõendid näitavad, et IS(Indoksüülsulfaat)võib mõjutada neerufunktsiooni ja kahjustada tuubulite rakke, tekitades endoteelirakkudes oksüdatiivset stressi, inhibeerides parandusmehhanisme ja soodustades interstitsiaalset tubulaarset fibroosi, kuna see suurendab metalloproteinaaside kudede inhibiitori (TIMP) TGF{0}} geeniekspressiooni. -1) ja kollageeni [14]. Sellegipoolest saab muuta soolestiku mikrobiota tasakaalustamatust ja sellega kaasnevat toksiliste metaboliitide tootmist. On kirjeldatud, et teatud probiootikumide ja prebiootikumide lisamine võib vähendada teatud ureemiliste toksiinide tootmist ja taastada normaalse mikrobiota [5]. Näiteks on metaanalüüsi uuringutes jõutud järeldusele, et kroonilise neeruhaigusega patsientidel, kes said täiendavalt probiootilisi tüvesid, suurenesid põletikuvastased tsütokiinid ja vähenesid ureemiliste toksiinide tase [15,16]. Mõned uuringud teatasid, et sünbiootikumide, probiootikumide ja prebiootikumide kombinatsiooni manustamine on võimeline vähendama kroonilise neeruhaiguse progresseerumist soodsate tulemustega [12]. Käesoleva töö kontekstis on inuliini tüüpi fruktaanid olulised prebiootikumid, kuna need on näidanud. nende võime vähendada kroonilise neeruhaiguse progresseerumist [17] ja vähendada URM-e, nagu pCS ja IS(Indoksüülsulfaat)[18]. Panza et al. (2017) manustasid probiootikume L.acidophlilus ja Bifidobacterium longum pluss fruktooligosahhariide (FOS) 2-5 staadiumi kroonilise neeruhaigusega patsientidele ja teatasid, et ravimata patsientidel oli oluliselt rohkem pCS-i ja(Indoksüülsulfaat)veres kui sünbiootilist ravi saanud patsientidel [19]. Selles töös hindasime esmalt probiootiliste tüvede võimet IS-i vähendada(Indoksüülsulfaat)in vitro, et valida välja kõige lootustandvam. Seejärel kombineeriti see tüvi prebiootikumidega inuliini ja fruktooligosahhariididega (FOS), et saada oletatav sünbiootikum. Need prebiootikumid valiti välja, kuna nad on näidanud, et need võivad vähendada pCS-i ja IS-i(Indoksüülsulfaat)kontsentratsioon veres [17,18]. Lõpuks testiti oletatava sünbiootikumi efektiivsust in vivo, hinnates vere IS-i(Indoksüülsulfaat)ja kreatiniini taset janeerudja südamekahjustus rotimudeli kasutamisel (Sprague-Dawley rotid), sealhulgasneerudpuudulikud (nefrektoomilised) ja ravimata loomad.
2. Tulemused
2.1.IS-i vähendavate tüvede eraldamine(Indoksüülsulfaat)In vitro
36 piimatoodete proovist eraldati 84 tüve MRS-agaris, millele oli lisatud bromofenoolsinist (MRS-BFB), mida kasutati diferentsiaalsöötmena. See sööde võimaldab diferentseerida piimhappebaktereid. PH väärtusel 3 on kolooniad kollase värvusega ja pH 5 lähedal siniseks [19]. Kõiki 84 isoleeritud tüve testiti in vitro, et teha kindlaks nende võime vahendada IS vähenemist.(Indoksüülsulfaat). Selleks kultiveeriti tüvesid MRS puljongis, millele oli lisatud 2,8 mM IS(Indoksüülsulfaat)48 tundi ja seejärel ON(Indoksüülsulfaat)mõõdeti kõrgsurvevedelikkromatograafia (HPLC) abil. Tüved lc2, 6c3 ja VIc2 suutsid oluliselt vähendada (p<0.05) the="" concentration="" of="" the="" compound="" (table="" 1).="" furthermore,="" the="" three="" strains="" were="" cultured="" together="" for="" 48="" h="" in="" the="" presence="" of="">(Indoksüülsulfaat)hinnata, kas nad tegutsesid IS-i vähendamiseks sünergiliselt(Indoksüülsulfaat). Kui kõiki kolme tüve kasvatati koos IS juuresolekul(Indoksüülsulfaat)IS kontsentratsioon(Indoksüülsulfaat)vähenes samuti oluliselt, kuid vähem kui ainult tüvede puhul, välistades sünergilise aktiivsuse võimaluse (tabel 1).
Tabel 1.In vitro vähenemine, kuiindoksüülsulfaat(IS) hinnatakse kõrgefektiivse vedelikkromatograafia (HPLC) abil, mida vahendavad bakteritüved.
2.2. Valitud tüvede tuvastamine
Kolm tüve valiti nende võime tõttu vähendada IS-i(Indoksüülsulfaat)identifitseeriti 16S rRNA sekveneerimisega pärast DNA PCR amplifikatsiooni. Tüvi 1c2 oli grampositiivset ahelat moodustav kokk, mis molekulaaranalüüsis amplifitseeriti Streptococcus thermophilus'e LacZ praimeritega. Tüved 6c3 ja VIc2 olid mõlemad grampositiivsed batsillid ja amplifitseeriti LbG praimeritega, et tuvastada perekond Lactobacillus. 16SrRNA sekveneerimise analüüs võimaldas identifitseerida tüve lc2 kui Streptococcus thermophilus (97,3-protsendiline sarnasus; juurdepääsunumber: AY188354.1), tüvi 6c3 kui Lactobacillus bulgaricus (99,7-protsendiline sarnasus; juurdepääsunumber: CR95425acilus VIcillus ja Lastraintobac3). 99,5-protsendiline sarnasus; juurdepääsunumber: AY773947.1). Sünbiootikumi valmistamiseks ja järgmiste analüüside läbiviimiseks valiti ainult üks kolmest tüvest. Streptococcus thermophilus 1c2 tüvi jäeti kõrvale, kuna see näitas madalat kasvukiirust. Ülejäänud kahest tüvest valiti välja Lactobacillus bul-garicus 6c3 tüvi, kuna sellel oli parem probiootiline funktsionaalsus ja ohutusomadused kui Lactobacillus acidophilus VIIc2 tüvel.
2.3. Sünbiootikumi mõju vere kreatiniinile ja IS-le(Indoksüülsulfaat)Tasemed
Probiootiline L. bulgaricus 6c3 lüofiliseeriti koos prebiootikumidega Inuline ja FOS, mis on probiootilise kontsentratsiooniga 10 kraadi CFU/g lüofiliseeritud produkti. Nefrektoomiaga sünbiootikumidega töödeldud Sprague-Dawley rottide (Lac) rühmale manustati iga päev joogivees kümme grammi sünbiootikumi. Nefrektoomiaga ravimata rühm (Nef) ja nefrektoomiata kontrollrühm ei saanud sünbiootikumi. Seerumi kreatiniin ja IS(Indoksüülsulfaat)rottide tasemeid mõõdeti HPLC abil testi alguses (nädal pärast nefrektoomiat) ja lõpus. Lisaks registreeriti kõigi rühmade loomade hematokritid. Seerumi kreatiniinitaseme kõikumine testi lõpus oli oluliselt erinev (lk<0.05) in="" the="" nef="" and="" lac="" groups,increasing="" 127%and="" 121%,="" respectively,="" when="" compared="" to="" their="" initial="" values(figure="" 1).="" the="" control="" group="" showed="" a="" non-significant="" creatinine="" increase="" of="" only="" 2%.="" the="" increase="" of="" creatinine="" serum="" levels="" in="" the="" nef="" and="" lac="" groups="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" control="" group="" but="" not="" significantly="" different="" between="" the="" nef="" and="" lac="" groups.="" nevertheless,="" all="" three="" groups="" maintained="" their="" creatinine="" levels="" within="" de="" normal="" limits="" for="" these="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" serum="">(Indoksüülsulfaat)tase tõusis oluliselt ainult Nef rühmas, mis vastas nefrektoomiaga (neerupuudulikkusega) loomadele, kellele sünbiootikumi ei manustatud (38,8 protsenti) (p<0.05).>(Indoksüülsulfaat)tasemed näitasid kontrollrühmas mitteolulist 0,5 protsendilist tõusu ja Lac rühmas mitteolulist 0,8 protsendilist langust (joonis 2). Kui võrreldi nefrektoomiaga loomade rühmi, näitas sünbiootikumi (Nef) mittetarvinud rühm oluliselt kõrgemat IS-i.(Indoksüülsulfaat)võrreldes sünbiootikumi (Lac) tarbinud rühmaga. Lac-rühma ja kontrollrühma vahel ei olnud olulist erinevust. Andmete analüüs, otsides võimalikku korrelatsiooni kreatiniini ja IS vahel(Indoksüülsulfaat)tasemed näitasid, et seda korrelatsiooni ei olnud (täiendavad materjalid: joonised S1-S3). Lõpuks ei näidanud hematokriti tulemused kolme rühma vahel olulisi erinevusi (joonis 3).
Joonis 1. a ) Sprague-Dawley rottide seerumi kreatiniinisisaldus sünbiootikumi 16-nädalase manustamise alguses ja lõpus. (b) Kreatiniini lõppkontsentratsiooni keskmiste erinevused 95-protsendilise Tukey samaaegse usaldusvahemikuga (kui intervall ei sisalda nulli, on vastavad keskmised oluliselt erinevad). Nef: nefrektoomiaga rotid, kes ei saa sünbiootikumi, Lac: nefrektoomiaga rotid, kes saavad sünbiootikumi, kontroll: võltsnefrektoomiaga rotid.
Joonis 2.a) seerumindoksüülsulfaat(IS) tase Sprague-Dawley rottidel sünbiootikumi 16-nädalase manustamise alguses ja lõpus. b) Lõpliku IS-i määramise vahendite erinevus(Indoksüülsulfaat)kontsentratsioonid 95-protsendilise Tukey samaaegse usaldusvahemikuga (kui intervall ei sisalda nulli, on vastavad keskmised oluliselt erinevad). Nef: nefrektoomiaga rotid, kes ei saa sünbiootikumi, Lac: nefrektoomiaga rotid, kes saavad sünbiootikumi, kontroll: võltsitud nefrektoomiaga rotid.
2.4. Histoloogiline analüüs näitas, et sübiootikumi manustamine vähendas kroonilise neeruhaiguse progresseerumist
Katse lõpus eutaniseeriti rotid, et saada proove vasakultneerudja südamed, mida töödeldakse histoloogiliseks analüüsiks. Fibrootiline ala määrati Massoni trikroomse (MT) pleki abil, kasutades informaatilist tööriista Image-Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) kahjustatud (st fibrootilise) piirkonna protsendi arvutamiseks. (tabel 2) ja kahe fotoni ergastusmikroskoopia abil – meetod, mis tuvastab kollageeni kahe footoni emissiooni teel, pannes kollageeni genereerima teise harmoonilise, mida saab visualiseerida konfokaalse mikroskoopia abil, saades konkreetse kujutise organisatsiooni lähedale ja kollageeni jaotumine koes. Võrreldes neerude fibrootilisi piirkondi, mida hinnati MT-värviga, võis täheldada, et fibrootilised piirkonnad olid 25 protsenti suuremad Nef-rühmas, kuid ainult 12 protsenti suuremad Lac-rühmas, kui snbiootilist manustati võltsraviga võrreldes. nefrektoomiaga kontrollloomad. Selle värvimisprotseduuriga täheldatud kahjustused paiknesid Bowmani kapsli parietaalkihil ning Nef ja Lac rühmade loomade proksimaalsete ja distaalsete keerdunud tuubulite basaalmembraanil. Nef-rühma puhul, sealhulgas loomadel, kellele sünbiootikumi ei manustatud, täheldati keerdunud tuubulite rakkude tsütoplasma kadu koos fibrootilise koe arenguga. Neerude kudede analüüsimisel kahe fotoni ergastusmikroskoopia abil täheldati kollageeni kõigis võrgutüüpi konformatsiooniga proovides. Rühmad Nef ja Lac näitasid rohkem kahjustusi kui kontrollrühmas, kus leiti ainult üks fibrootiline piirkond (joonis 4). Kahe fotoni ergastusmikroskoobiga vaadeldes ei leitud üheski proovis kahjustusi neerukorpusklites.
Tabel 2.Fibrootilise ala protsent Massoni trikroomiga värvitudneerudhistoloogilised lõigud. Tulemused on väljendatud keskmise pluss standardveana.
 |  |
| Joonis 3.Sprague-Dawley rottide hematokriti väärtused sünbiootikumi 16-nädalase manustamise lõpus. Nef: nefrektoomiaga rotid, kes ei saa sünbiootikumi, Lac: nefrektoomiaga rotid, kes saavad sünbiootikumi, kontroll: võltsitud nefrektoomiaga rotid. | Joonis 4.Sprague-Dawley rottide neerude histoloogilised lõigud. (AC): Massoni trikroomne nefronite plekk. Fibrootilisi alasid vaadeldakse sinisena (nooled). (DF): sama kude, mida täheldati kahe fotoni ergastusmikroskoopia abil. Fibrootilist kudet täheldatakse roheliselt. Nef: nefrektoomiaga rotid, kes ei saa sünbiootikumi, Lac: nefrektoomiaga rotid, kes saavad sünbiootikumi, kontroll: võltsitud nefrektoomiaga rotid. Skaalariba∶ 100 μum (AC) mikrograafide jaoks ja 50 μm (DF) mikrograafide jaoks. |
2.5. Sünbiootikumi manustamine ei nõrgendanud südamefibroosi
Südames näitas MT plekk fibrootiliste piirkondade olemasolu nefrektoomiaga rottide koes, samas kui kontrollloomadel need alad puudusid. CKD esilekutsumine rottidel tekitab südamefibroosi, mida sünbiootilise ravi manustamine nefrektoomiaga rottidel ei takistanud (joonis 5).
Joonis 5.Massoni trikroom (MT) värvimine Sprague-Dawley rottide südames. Fibrootilised alad on värvitud sinisega (nooled). Nef: nefrektoomiaga rotid, kes ei saa sünbiootikumi, Lac: nefrektoomiaga rotid, kes saavad sünbiootikumi. Kontroll: võltsnefrektoomiaga rotid. Skaalariba 100 um.
