Osa Ⅰ Herba Cistanche'i adjuvantväärtus, kui seda kasutatakse koos statiiniga hiiremudelites

Elaine Wat, Chun Fai Ng, Chi Man Koon, Cheng Zhang, Si Gao, Brian Tomlinson ja Clara Bik San Lau

1 Hiina Meditsiini Instituut, Hongkongi Hiina Ülikool, Shatin, New Territories, Hongkong.

2 Riiklik fütokeemia ja taimsete ressursside laboratoorium Lääne-Hiinas, Hongkongi Hiina Ülikool, Shatin, New Territories, Hongkong.

3 Kliinilise farmakoloogia osakond, Hongkongi Hiina ülikooli meditsiini- ja teraapiaosakond, Shatin, New Territories, Hongkong. Elaine Wat ja Chun Fai Ng panustasid sellesse töösse võrdselt. Kirjavahetus ja materjalide taotlused tuleb saata CBSL-ile (e-post: claralau@cuhk.edu.hk)

Lisateabe saamiseks: emily.li@wecistanche.com

Cistanche kohta lisateabe saamiseks klõpsake siin

Abstraktne

Statiinidel on teadaolevalt lihastoksilisuse probleeme.HerbaCistanches(HC) on Hiina ravimtaim, mida traditsiooniliselt kasutatakse nimme- ja põlvevalu korral. Meie eelmine in vitro uuring näitas, et see võib kaitsta statiinide põhjustatud lihastoksilisuse eest. Siiski ei ole selle in vivo kaitsvat toimet kunagi uuritud. Selle uuringu eesmärk oli kindlaks teha, kas vesiekstrakt onHerbaCistanche(HCE) võib ära hoida simvastatiini põhjustatud lihastoksilisust rottidel ja seda, kas Herba Cistanche E võib samuti avaldada kasulikku mõju kõrge rasvasisaldusega dieedist põhjustatud hüperkolesteroleemia ja maksa kolesteroolitaseme tõusu vähendamisele, vähendades seeläbi kombineeritud ravis kasutatava simvastatiini annust. Meie tulemuste põhjal taastas Herba Cistanche E märkimisväärselt simvastatiinist põhjustatud lihasmassi vähenemise ja vähendas rottidel plasma kreatiinkinaasi tõusu.HerbaCistancheE parandas ka simvastatiinist põhjustatud lihase glutatiooni taseme langust, lihaste mitokondriaalse membraani potentsiaali ja vähendas simvastatiinist põhjustatud lihaspõletikku. Lisaks võib HCE vähendada maksa massi, maksa lipiidide kogutaset ja plasma lipiidide taset kõrge rasvasisaldusega toidetud hiirtel. Kokkuvõtteks võib öelda, et meie uuring andis in vivo tõendeid selle kohtaHerba CistancheE-l on potentsiaalne kaitsev toime simvastatiini indutseeritud toksilisusele lihastes, samuti kasulik toime dieedist põhjustatud mittealkohoolsele rasvmaksale ja hüperlipideemiale, kui seda kasutatakse üksi või kombinatsioonis simvastatiiniga vähendatud annuses.

HMG-CoA reduktaasi inhibiitorid, tuntud ka kui statiinid, on hästi dokumenteeritud kui kasulikud mõõduka ja kõrge südame-veresoonkonna haiguste riskiga hüperkolesteroleemiaga patsientidele1. Statiinid, üks enimmüüdud retseptiravimite klasse maailmas, pärsivad HMG-CoA redutseerumist mevaloonhappeks mevalonaadi raja varases staadiumis, et vähendada endogeense kolesterooli sünteesi2, 3. Kuigi statiinid on tavaliselt hästi talutavad. , üks olulisemaid ja tuntumaid kliinilisi kõrvaltoimeid on skeletilihaste kõrvalekalded, mis võivad ulatuda healoomulisest müalgiast kuni raske müopaatiani4, 5. 10 409 prantslasest telefoniintervjuu kaudu läbi viidud suures küsitluses osales 10 protsenti patsientidest, kes said statiinravist teatati lihassümptomid, millest 30 protsenti nendest sümptomitega patsientidest lõpetas ravi6. Rahvusliku lipiidide assotsiatsiooni statiinide ohutuse töörühm on andnud soovitusi statiinravi saavate patsientide lihastega seotud sümptomite raviks. Üldiselt on soovitatav, et patsientidel, kellel on rasked sümptomid, nagu kreatiinkinaasi (CK) aktiivsuse tõus üle 5 × üle normi ülemise piiri, tuleks loobuda statiinide kasutamisest, kuni CK tase on taas normaliseerunud5. Nende kõrvaltoimete esinemise ja statiinide põhjustatud lihastoksilisuse tõhusa ravi puudumise tõttu tekib tung otsida uusi ravimeetodeid statiinist põhjustatud lihasprobleemide lahendamiseks.

Kuigi pakutakse välja mitmeid mehhanisme, mis võivad olla vastutavad statiini kahjulike mõjude eest, arvatakse, et mitokondriaalsed mehhanismid on seotud statiini lihastoksilisuse kahjuliku mõjuga1. Mevalonaat ei ole mitte ainult kolesterooli prekursor, vaid on ka oluliste ühendite, nagu selenoproteiinid, dolikool ja ubikinoon, eelkäija7, 8. Statiin võib selenoproteiini, nagu glutatioonperoksidaasi (GPx) alareguleerida, kahjustades antioksüdantide tihedust ja soodustades selle negatiivset mõju. mõjud 4. Statiinid võivad samuti põhjustada ubikinooni ammendumist, põhjustades hapnikutarbimise ja ATP sünteesi vähenemist9. Lisaks näitasid üha suurenevad in vitro ja in vivo uuringud, et statiin võib toimida otseselt ka kudede mitokondritele, põhjustades suurenenud reaktiivseid hapniku liike (ROS) ja mitokondriaalset oksüdatiivset stressi, põhjustades rakusurma ja aidates seega kaasa maksa- ja lihaskahjustustele 10, 11.

HerbaCistanches, kogu kuivatatud taimCistanchedeserticolaYC Ma (perekond Orobanchaceae) on parasiittaimed, mis kasvavad peamiselt Põhja- ja Kirde-Hiina kõrbealadel12. Hiina meditsiini teooria kohaselt on Herba Cistanches magus, soe ja soolane maitse13. See on Yangi turgutav Hiina toonik, mida kasutatakse peamiselt neerupuudulikkuse raviks, mille sümptomiteks on impotentsus, viljatus, enneaegne ejakulatsioon. See on ka Hiina ravimtaim, mida traditsiooniliselt määratakse patsientidele nimme- ja põlvevalu korral ning mida kasutatakse tavaliselt Hiina ravimvormides lihasprobleemide raviks12, 14. Huvitaval kombel on see kooskõlas ka tänapäevaste teaduslike uuringutega, mis on näidanud - Herba Cistanches'i polüsahhariidi- ja fenüületanoidirikka ekstrakti väsimust tekitav toime rottidel pärast treeningut, vähendades lihaskahjustusi ja parandades ATP säilitamist15. Lisaks näitas hiljutine töö, et Herba Cistanchesi metanooliekstrakt võib suurendada mitokondriaalset ATP teket16.HerbaCistanchesSamuti tõestati, et see on tugev antioksüdant ja vabade radikaalide püüdja ​​erinevates organites, vähendades oksüdatiivset stressi ja ROS-i aktiivsust in vivo uuringutes17, 18. Hiljutises meie laboris läbi viidud uuringus näitasime, et meieHerbaCistanchesvesiekstrakt takistas oluliselt simvastatiini poolt indutseeritud toksilisust L6 skeletilihasrakkudes, samuti annusest sõltuvat taastatud simvastatiinist põhjustatud ATP tootmise vähenemist L6 rakkudes, mis viitabHerbaCistanchesvesiekstrakt kaitseks statiinide põhjustatud lihastoksilisuse eest19. Sellegipoolest puuduvad in vivo tõendid.

Seetõttu püstitasime selle hüpoteesiHerbaCistanchesvesiekstrakt (HCE) võib avaldada kasulikku mõju simvastatiinist põhjustatud lihastoksilisusele. Seega oli selle uuringu eesmärk kindlaks teha, kas HCE kasutamine võib in vivo loommudeli abil vähendada simvastatiinist põhjustatud lihastoksilisust ja lisaks sellele, kas HCE võib avaldada kasulikku mõju ka kõrge rasvasisaldusega dieedist põhjustatud hüperkolesteroleemia ja maksa kolesteroolitaseme tõusu vähendamisele. , vähendades seeläbi kasutatava simvastatiini annust.

Materjalid ja meetodid

Taimsete materjalide autentimine ja ekstraheerimine.

Taimne tooraineHerbaCistanches(Cistanche deserticola, hangitud Sise-Mongooliast) osteti Hiinas Guangzhous asuvalt tuntud tarnijalt Zi Xin. Herba Cistanches autentiti keemiliselt, kasutades õhukese kihi kromatograafiat ja üliefektiivset vedelikkromatograafiat vastavalt Hiina farmakopöale 201013, nagu eelnevalt kirjeldatud19,verbascosidejaehhinakosiid(ostetud Hiinast riiklikust farmaatsia- ja bioloogiliste toodete kontrolli instituudist) keemiliste markeritena. Keemilise autentimise korral herbaariumi vautšeri näidisHerbaCistanchesanti hoiule Hongkongi Hiina Ülikooli Hiina Meditsiini Instituudi muuseumisse vautšeri näidisnumbriga 2014-3434.

HerbaCistanchesvesiekstrakt valmistati eelnevalt kirjeldatud viisil19. Lühidalt, 1 kg toorest ürti leotati 1 tund, millele järgnes kahekordne ekstraheerimine, kuumutades 1 tund püstjahuti all 100 kraadi juures, kasutades 10x destilleeritud vett. Vesiekstraktid (HCE) ühendati ja filtriti ning filtraat kontsentreeriti alandatud rõhul temperatuuril 60 °C. Kontsentreeritud ekstrakt lüofiliseeriti kuivaks. Saagise protsent oli 50,1 massiprotsenti. Kogu ekstraheeritud pulber pakiti vaakumisse ja säilitati kuni kasutamiseni.

Katseloomad.

Simvastatiin osteti ettevõttelt SR Pharmasolutions Ltd. Isased Sprague Dawley rotid (180–200 g) ja isased C57Bl/6J hiired (8-nädalased) tarnisid Hongkongi Hiina ülikooli laboratoorsete loomade teenuste keskusest. Loomkatsed kiitis heaks Hongkongi Hiina ülikooli loomkatsete eetikakomitee (viide nr 12/074/MIS). Kõik katsemeetodid viidi läbi Hongkongi Hiina ülikooli loomkatsete eetikakomitee kinnitatud juhiste järgi. Kõik rotid (3 looma puuri kohta) ja hiired (5 looma puuri kohta) peeti tavalistes standardpuurides konstantsel temperatuuril 21 kraadi 12-tunnise valguse-pimeduse tsükliga. Igas standardpuuris oli allapanumaterjalina haab. Kõikidele loomadele võimaldati ad libitum juurdepääs dieedile ja veele.

Statiinide põhjustatud lihastoksilisuse uuring rottidel.

Kõik rotid jagati juhuslikult 5 rühma (n=5–10). Kõik loomad olid tavalisel tšau dieedil. Neile manustati ka destilleeritud vett või simvastatiini iga päev ja koos HCE-raviga või ilma intragastraalselt. Loomadele, kellele tuleb manustada nii simvastatiini kui ka HCE-d, manustati HCE-d 3 tundi pärast simvastatiini manustamist, et vältida otsest ürtide ja ravimite keemilist koostoimet. Taimeekstrakt ehk simvastatiin lahustati teadaoleva kontsentratsiooniga 0,5% metüültselluloosis destilleeritud vees. Igale loomale manustati intragastraalselt vastavalt isendi kaalule eelnevalt arvutatud maht, nii et arvutatud maht sisaldas kavandatud vajaliku annuse kogust. Nende rühmade üksikasjad on järgmised:

Rühm a) Tavaline toitumine pluss destilleeritud vesi (tavaline kontrollrühm)

Rühm b) Tavaline toitumine pluss simvastatiin (640 mg/kg)

Rühm c) Tavaline toitumine pluss simvastatiin (640 mg/kg) pluss väikeses annuses HCE (1,1 g/kg looma kohta)

Rühm d) Tavaline toitumine pluss simvastatiin (640 mg/kg) pluss suur annus HCE (2,2 g/kg looma kohta)

Rühm e) Tavaline toitumine koos suure annusega HCE (2,2 g/kg looma kohta)

Toidu tarbimine registreeriti iga päev ja kehakaalu mõõdeti kaks korda nädalas. Ravi kestis 4 nädalat. Pärast seda anesteseeriti loomad, kasutades intraperitoneaalselt ketamiini (100 mg/kg) ja ksülasiini (10 mg/kg) segu. Veri võeti südame punktsiooniga ja lasti hüübida. Seejärel eraldati plasma tsentrifuugimisega (3, 000 pööret minutis 10 minutit). Erinevad lihased (nelipealihased, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior ja sirutajakõõluse lihased) lõigati välja ja säilitati kuni analüüsimiseni temperatuuril -80 kraadi.

Plasma kreatiinkinaasi mõõtmine. Plasma kreatiinkinaasi (CK) aktiivsus määrati, kasutades Stanbio CK Liqui-UV® komplekti (2910-430, Stanbio Laboratory, USA) vastavalt tootja juhistele.

Lihase glutatioonperoksüdaasi mõõtmine. Lihase glutatioonperoksüdaasi (GPx) mõõdeti vastavalt tootja juhistele, kasutades kaubanduslikult saadavat komplekti (703102, Cayman Chemical, USA). Lühidalt öeldes loputati lihaskoed PBS-ga pH 7,4 juures, et eemaldada kõik punased verelibled, ja homogeniseeriti 5–10 ml külmas lüüsipuhvris, misjärel homogenaati tsentrifuugiti 10, 000 g juures 15 minutit 4 kraadi juures. Seejärel eemaldati supernatant ja testiti GPx aktiivsust, kasutades kaubanduslikku komplekti.

Lihaste mitokondriaalsete ja tsütosoolsete fraktsioonide ettevalmistamine. Lihasproovide mitokondriaalsed ja tsütosoolsed fraktsioonid valmistati, kasutades Mitochondria Isolation Kit (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA) vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, värskeid lihaseproove töödeldi eelnevalt ekstraheerimisvõiga, lõigati väikesteks tükkideks ja homogeniseeriti ekstraheerimispuhvris. Seejärel tsentrifuugiti koehomogenaate. Supernatant koguti ja reserveeriti tsütosoolse fraktsiooni analüüsiks. Seejärel pesti mitokondriaalseid pelleteid ja tsentrifuugiti uuesti ning kasutati mitokondriaalse fraktsiooni analüüsiks.

Lihaste mitokondriaalsete reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) mõõtmine. ROS-i mõõdeti eelmisest kirjandusest muudetud protokolliga20. Lühidalt, ROS-i mõõdeti mitokondriaalsest fraktsioonist (50 µg valku / ml), kasutades DCFDA lahust (C6827, Invitrogen, USA). Segu inkubeeriti 37 kraadi juures 10 minutit pimedas, seejärel inkubeeriti fotoaktiveerimiseks substraadi lahusega (10 mM püruvaat, 15 mM malaat). Fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti iga 5 minuti järel 60 minuti jooksul BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG fluorestsentsmikroplaadi lugejaga 485 nm ergastuse ja 520 nm emissiooni juures. ROS-i tekke mõõtmiseks arvutati fluorestsentsi intensiivsused.

Lihaste mitokondriaalse membraani potentsiaal. Lihasproovide mitokondriaalse fraktsiooni mitokondriaalse membraani potentsiaal määrati vastavalt tootja protokollile (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA). See protseduur on fikseeritud punkti test, millega mõõdetakse JC-1 omastamist koos J-agregaatide moodustumisega. Lühidalt, mitokondriaalne suspensioon lahjendati nii, et see sisaldaks 20 µg valku, ja inkubeeriti JC-1 värviga 7 minutit toatemperatuuril. See 7-minut on aeg, mille tootja on optimeerinud ja valideerinud, kasutades erinevaid ühendeid (nagu on märgitud tootja protokollis), kuna lahuse täheldatud fluorestsents tõuseb 5–10 minuti pärast platoole, millele järgneb drastiline langus JC-1 fluorestsents, mis on tingitud JC-1 kontsentratsioonide ühtlustamisest mitokondriaalses maatriksis ja väljaspool seda. Fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG fluorestsentsmikroplaadi lugejaga 490 nm ergastuse ja 590 nm emissiooni juures. Potentsiaalsete gradientide mõõtmiseks arvutati fluorestsentsi intensiivsused.

Lihaste histoloogia ja põletiku hindamine. Lihaste põletikuliste rakkude immunohistokeemiat hinnati CD68 ja CD163 värvimisega, nagu eelnevalt kirjeldatud 21–23. Lõigati 5 μm parafnilõigud, mis kleebiti Superfrost™ Plus klaasklaasidele (Menzel-Gläser, Saksamaa). Sektsioonidele kanti hiire esmased rotivastased CD68, ED1 ja CD163 antikehad ED2 (Bio-Rad, USA) lahjenduses 1:100. Spetsiifilise värvumise tuvastas EnVision™ Systems (Dako, Taani), kasutades sekundaarset antikeha, EnVision-HRP polümeeriga konjugeeritud hiirevastast IgG-d lahjenduses 1:200 ja tuvastati DAB lahuse abil (Dako, Taani), millele järgnes. hematoksüliiniga vastuvärvimisega. Seejärel paigaldati sektsioonid histooni dibutüülftalaati (DPX). Neutrofiilide olemasolu lihastes tuvastati kvantitatiivse immunohistokeemia abil, kasutades ImageJ tarkvara.

Lihase geeniekspressiooni analüüs. Oksüdatiivse stressiga seotud geenide profiilide PCR-analüüs viidi läbi roti oksüdatiivse stressi ja antioksüdantide kaitse PCR-massiivide abil (PARN-065Z, SABiosciences, Frederick, USA). PCR massiiv viidi läbi vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, kogu RNA eraldati selektiivse seondumise teel silikageelil põhineva membraaniga pärast lihaste proovide lüüsi ja homogeniseerimist denatureerivas guanidiintiotsüanaatpuhvris (RNeasy komplekt, Qiagen). RNA pöördtranskribeeriti cDNA-ks, kasutades komplekti RT2 First Strand Kit (SABiosciences, Frederick, USA). See cDNA lisati seejärel RT2 SYBR Green qPCR Master Mix'i (SABiosciences, Frederick, USA). Järgmisena jaotati iga proov roti oksüdatiivse stressi ja antioksüdantide kaitse PCR-massiividele (SABiosciences, Frederick, USA). Kõik toimingud viidi läbi vastavalt tootja protokollile.

Suure rasvasisaldusega dieedist põhjustatud hüperlipideemia ja maksa steatoosi uuring hiirtel.

Kõik hiired jagati juhuslikult 5 rühma (n=8–10) ja said järgmist: Rühm a) Tavaline toitumine (tabel 1); Rühmad b kuni e) Rasvane toit (sisaldab 21 protsenti rasva ja 0,15 protsenti kolesterooli) (tabel 2). Loomadele anti rasvumise esilekutsumiseks dieeti 8 nädalat. 8 nädala pärast anti kõigile suure rasvasisaldusega toidetud rühmadele destilleeritud vett või simvastatiini iga päev ja/või HCE-ravi intragastraalselt, 3 tundi pärast simvastatiini manustamist. Taimeekstrakt ehk simvastatiin lahustati teadaoleva kontsentratsiooniga destilleeritud vees 0,5% metüültselluloosis (Sigma-Aldrich Corporation, USA). Igale loomale manustati intragastraalselt vastavalt isendi kaalule eelnevalt arvutatud maht, nii et arvutatud maht sisaldas kavandatud vajaliku annuse kogust. Nende rühmade üksikasjad on järgmised:

Rühm a) Tavaline toitumine pluss destilleeritud vesi

Rühm b) Rasvane toit pluss destilleeritud vesi

Rühm c) Suure rasvasisaldusega dieet pluss simvastatiin (50 mg/kg)

Rühm d) Rasvane toit pluss HCE (4,4 g/kg)

Rühm e) Suure rasvasisaldusega dieet pluss simvastatiin (25 mg/kg) pluss HCE (4,4 g/kg)

Toidu tarbimine registreeriti iga päev ja kehakaalu mõõdeti kaks korda nädalas. 16-nädalase uuringu lõpus surmati kõik hiired pärast 16-tunnist üleöö paastumist. Loomad anesteseeriti ketamiini (100 mg/kg) ja ksülasiini (10 mg/kg) seguga intraperitoneaalselt. Veri võeti südame punktsiooniga ja lasti hüübida. Plasma eraldati tsentrifuugimisega (3, 000 pööret minutis 10 minutit). Maksad lõigati välja ja säilitati analüüsini -80 kraadi juures.

Plasma ja maksa lipiidide mõõtmine.

Plasma triglütseriid, kolesterool (11488872216 ja 11489232216, Roche Diagnostics, Šveits), kõrge ja madala tihedusega lipoproteiinide kolesterool (L-tüüpi HDL-C ja L-tüüpi LDL-C, Wako Pure Chemicals, kontsentratsiooni mõõdeti Jaapanis) ensümaatilised meetodid, kasutades kaubanduslikult saadavat komplekti vastavalt tootja juhistele. Plasma kreatiinkinaasi (CK) aktiivsus määrati Stanbio CK Liqui-UV® komplekti (2910-430, Stanbio Laboratory, USA) abil. Maksa lipiidide kogusisaldus määrati gravimeetriliselt pärast ekstraheerimist Bligh ja Dyer24 meetodil. Üksikud maksa lipiidid kvantifitseeriti ensümaatiliselt (nagu ülalpool kirjeldatud) pärast lahustamist isopropanoolis (Sigma-Aldrich, USA)25.

Maksa histopatoloogia ja põletiku hindamine. Hematoksüliini ja eosiini värvimine (H&E värvimine). Parafiiniga kaetud koe puugilõigud (5 μm) lõigati mikrotoomiga ja asetati SuperFrost Plus® mikroskoobi slaididele (Thermo Scientific, USA). Sektsioone värviti H&E-ga vastavalt Harrise et al. meetodile. 26 ja paigaldatud dibutüülftalaadiga histoonis (DPX) (Sigma-Aldrich, USA)25.

Mac{0}} värvimine ja kvantifitseerimine. Paksud lõigud (5 μm) parafiiniga manustatud koest lõigati mikrotoomi abil ja asetati SuperFrost Plus® mikroskoobi slaididele (Thermo Scientific, USA). Viidi läbi antigeeni otsimine, millele järgnes blokeerimine peroksidaasi blokeerimisega (Dako Cytomation, Taani). Sektsioonidele kanti primaarne puhastatud hiirevastane Mac-3 antikeha (BD Pharmingen, USA) lahjendusega 1:50. Spetsiifiline värvumine tuvastati EnVision™ Systemsiga (Dako, Taani). Slaide inkubeeriti sekundaarse antikehaga, EnVision-HRP polümeeriga konjugeeritud küülikuvastase IgG-ga lahjenduses 1:200. Mac-3 tuvastati DAB-lahusega (Dako, Taani) ja värviti hematoksüliiniga. Seejärel paigaldati sektsioonid DPX-i. Makrofaagide olemasolu maksas tuvastati kvantitatiivse immunohistokeemia abil, kasutades ImageJ tarkvara.

Statistiline analüüs. Ravi- ja kontrollrühmade erinevusi testiti ühesuunalise dispersioonanalüüsiga (ANOVA), millele järgnes posthoc Bonferroni mitmekordne võrdlustest. Kõik statistilised analüüsid viidi läbi, kasutades GraphPad Prism versiooni 6.0 (GraphPad, USA). Tõenäosus p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

Tulemused

MõjuHerbaCistancheE simvastatiinist põhjustatud lihastoksilisuse kohta rottidel. Lihasmassi ja plasma kreatiinkinaasi mõõtmine. Kõigilt ravitud rottidelt eraldati viis erinevat tüüpi lihaseid (nelipealihased, gastrocnemius, tallalihased, tibialis anterior ja sirutajakõõluse lihased). Erinevate ravimeetodite mõju lihasmassile on näidatud joonisel 1a. Simvastatiin (640 mg/kg) indutseeris rottidel nelipealihase, gastrocnemiuse ja sääreluu eesmise lihase kaalu olulist vähenemist, samal ajal kui HCE taastas need vähenemised märkimisväärselt nelipealihaste ja gastrocnemius lihaste puhul annusest sõltuval viisil. KuigiHerbaCistancheE avaldas suundumust taastada sääreluu eesmise lihase kaal simvastatiiniga ravitud rottidel, ükski neist ravirühmadest ei olnud saavutanud statistilist olulisust. Kontrollrottidega võrreldes ei täheldatud ainult HCE-ga ravi olulist mõju lihasmassile (joonis 1a).

Joonisel fig 1b on näidatud erinevate ravimeetodite mõju plasma kreatiinkinaasi (CK) tasemele rottidel. Simvastatiin kutsus rottidel esile kreatiinkinaasi aktiivsuse olulise tõusu, mida HCE-ga samaaegne ravi mõlema annusega oluliselt vähendas. Samuti ei avaldanud ainult HCE-ravi olulist mõju CK tasemele võrreldes kontrollrühmaga. Kuna gastrocnemius tundus olevat tundlik simvastatiinravi suhtes ja see on suurim massi järgi eraldatud lihas, valisime selle lihase edasiseks analüüsiks, sealhulgas lihase glutatioonperoksidaasi mõõtmiseks (GPx), mitokondriaalse MMP ja ROS mõõtmiseks ning lihaste histoloogia ja põletiku hindamiseks. .

Lihase glutatioonperoksidaasi (GPx) mõõtmine. Mõõdeti lihase glutatioonperoksidaasi taset ja see on näidatud joonisel 2a. Simvastatiini manustamine kutsus esile suundumuse lihase glutatioonperoksidaasi (GPx) mõõtmise vähenemisele rottidel. Siiski avaldas HCE suundumust leevendada simvastatiinist põhjustatud lihaste GPx vähenemist nii annustes 1, 1 g / kg kui ka 2, 2 g / kg. Võrreldes normaalsete kontrollrottidega ei avaldanud ka ainult HCE-ravi olulist mõju lihaste GPx tasemele.

Mitokondriaalse membraani potentsiaali (MMP) ja ROS mõõtmine. Ravi simvastatiiniga (640 mg/kg) kutsus esile lihaste MMP olulise vähenemise (joonis 2b). See vähenemine paranes annusest sõltuvalt rottidel, kes said samaaegset ravi HCE ja simvastatiiniga (joonis 2b). Teisest küljest oli huvitav, et ainult simvastatiini saanud ravirühmal oli võrreldes normaalse kontrollrühmaga oluliselt vähenenud lihaste mitokondriaalne ROS tase (joonis 2c). Simvastatiiniga ravitud rottidele antud HCE-ravi avaldas aga annusest sõltuvat suundumust lihaste mitokondriaalse ROS-i taseme taastamiseks normaalsele tasemele. Nii mitokondriaalse MMP kui ka ROS mõõtmisel ei avaldanud rottidel ainult HCE-ravi olulist mõju võrreldes normaalse kontrollrühmaga.

Lihaste histoloogia ja põletiku hindamine. Erinevat ravi saanud rottide gastrocnemius lihaseid analüüsiti täiendavalt histoloogiliselt ja joonisel 3a on näidatud tüüpilised värvitud lõigud. Kontrollrühma loomad näitasid normaalsete lihaste histoloogilisi lõike. Seevastu simvastatiiniga ravitud loomade H&E lõigud näitasid põletikuliste markerite (kollased nooled) infiltratsiooni, mis simvastatiini ja HCE kombinatsiooni saanud rottide lihaslõikudes oluliselt vähenes. Immunohistokeemilised analüüsid viidi läbi ka makrofaagide CD68 ja CD163 olemasolu kohta vastavalt joonistel 4a ja 5a, kusjuures vastavate makrofaagide kvantifitseerimine on näidatud joonistel 4b ja 5b. Lihaslõikude immunohistokeemiline analüüs näitas makrofaagide (CD68) olemasolu simvastatiiniga ravitud rottidel (pruun värvus), mis vähenes oluliselt rottidel, kui HCE-d manustati mõlemas annuses (joonis 4b). Samuti ei täheldatud ainult HCE-ga ravitud loomadel olulist põletikku. Samamoodi näitas lihaslõikude immunohistokeemiline analüüs CD163-positiivsete makrofaagide olemasolu simvastatiiniga ravitud rottidel (pruun värvus), mis vähenes oluliselt rottidel, kui HCE-d manustati 2,2 g/kg (joonis 5b). ). Samuti ei täheldatud ainult HCE-ga ravitud loomadel olulist põletikku.

Lihase geeniekspressiooni analüüs. Simvastatiini ja HCE mõju määramiseks oksüdatiivse stressiga seotud geenidele lihastes viidi läbi PCR-analüüs, mis profiilib oksüdatiivse stressiga seotud geene, kasutades roti oksüdatiivse stressi ja antioksüdantide kaitse PCR-massiive. Geene, mida simvastatiinravi oluliselt mõjutas, analüüsiti ja esitati joonisel fig 6. Antioksüdante reguleerivate geenide ekspressiooniprofiili osas suurendasid simvastatiiniga (640 mg/kg) töödeldud rotid antioksüdante reguleerivate geenide ekspressiooni. Tese sisaldab glutatioonperoksidaase (GPx) GPx1 ja GPx7 ning muid peroksidaase, sealhulgas Serpinb1b ja klubi (joonis 6a). HCE mõlemas annuses (1,1 või 2,2 g/kg) vähendas simvastatiinist põhjustatud GPx-de ja teiste peroksidaaside tõusu normaalsele tasemele. Teisest küljest suurendas ainult HCE-ravi oluliselt GPx1 ekspressioonitasemeid. ROS-i metabolismi reguleerivate geenide ekspressiooni osas indutseeris simvastatiin oluliselt teiste superoksiidi metabolismi geenide, sealhulgas Cyba, Ncf1, Ncf2, Scd1 ja Ucp2, ekspressiooni. Samamoodi vähendas HCE mõlemas annuses neid suurenemisi oluliselt (joonis 6b). Lisaks indutseeris simvastatiin oksüdatiivsele stressile reageerivate geenide, sealhulgas Apoe, Ccl5 ja Txn1, ekspressiooni, samas kui need ekspressioonid vähenesid HCE-ga kaasravi saanud loomadel mõlema annuse korral oluliselt (joonis 6c). Teisest küljest põhjustas simvastatiin Txnipi geeniekspressiooni märkimisväärse vähenemise. HCE ei avaldanud olulist mõju simvastatiini poolt indutseeritud Txnip geeniekspressiooni vähenemisele (joonis 6c). Simvastatiin suurendas oluliselt ka hapniku transportereid reguleerivate geenide, sealhulgas Slc38a1 ja Vim, ekspressiooni. HCE kaasravi vähendas nende geenide ekspressiooni mõlema annuse korral (joonis 6d).

Simvastatiini ja HCE kombineeritud kasutamise mõju toidutarbimisele ja kehakaalule hiirtel. Joonisel 7a on näidatud hiirte igapäevane toidutarbimine kõigis ravirühmades. Suure rasvasisaldusega dieet suurendas oluliselt loomade päevast toidutarbimist võrreldes toiduga toidetud loomadega (p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

Iganädalane kehakaalu mõõtmine. Pärast 16-nädalast kõrge rasvasisaldusega toitmist võtsid HF-ga toidetud loomad oluliselt rohkem kaalus juurde kui toiduga toidetud loomad (joonis 7b). Siiski ei ilmnenud olulist mõju HF-ga toidetud hiirte ja kõigi HF-i saanud ravirühmade vahel. Samuti ei ilmnenud olulist erinevust HF-ga toidetud hiirte vahel, kes said samaaegselt simvastatiini ja HCE-d, võrreldes HF-ga toidetud hiirtega, kes said ainult HCE-d või simvastatiinravi (joonis 7b).

Simvastatiini ja HCE kombineeritud kasutamise mõju hüperlipideemiale ja maksa steatoosile hiirtel. Plasma lipiidide ja kreatiinkinaasi aktiivsuse mõõtmine. Kõikide hiirte plasma lipiidide tasemed on näidatud joonisel 8. Võrreldes tavaliste toiduga toidetud hiirtega oli HF-ga toidetud hiirtel märkimisväärselt kõrgenenud plasma üldkolesterooli (TC) tase, mis oli kõigis ravirühmades oluliselt vähenenud (joonis 8a). . HF-ga toidetud hiirtel, keda raviti simvastatiini ja HCE-ga, oli plasma TC oluliselt madalam kui HF-loomadel, kellele manustati ainult simvastatiini või HF-loomadel, kellele manustati ainult HCE-d (p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

madalam plasma TG võrreldes HF-ga toidetud hiirtega, kellele manustati ainult simvastatiinravi (lk<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">iveri lipiidide mõõtmine.

Erinevate ravirühmade mõju HF-i indutseeritud hepatomegaaliale (suurenenud maks) oli seotud maksa üldlipiidide sisalduse olulise vähenemisega, väljendatuna lipiidide milligrammides maksa kohta (joonis 9a). Maksa üldlipiidide sisaldus oli HF-ga toidetud hiirtel oluliselt kõrgem võrreldes tavaliste toiduga toidetud hiirtega (30- korda kõrgem, p.<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

Nagu on näidatud joonistel fig 9b ja c, näitas maksa üldkolesterooli (TC) ja maksa triglütseriidide (TG) mõõtmine, et kõrgenenud HF-ga toidetud hiirtel oli mõlema lipiidide tase kõrgem võrreldes tavaliste toiduga toidetud hiirtega (st 3.{{4} }kordne TC kasv, lk<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

Maksapõletiku hindamine. Makrofaagide (Mac-3) esinemise tuvastamiseks viidi läbi immunohistokeemiline värvimine (joonis 10a). Maksaosade immunohistokeemiline analüüs näitas Mac-3 esinemist nii suure rasvasisaldusega kui ka normaalse toiduga toidetud hiirtel (pruun värvus). See põletik suurenes veelgi simvastatiiniga ravitud loomadel, kuigi selline suurenemine ei saavutanud statistilist tähtsust. Huvitaval kombel vähendas HCE-ravi koos simvastatiiniga või ilma selleta märkimisväärselt rasvasisaldusega toidetud hiirte põletikku. Kõigi ravirühmade võrdluses oli HCE-ravi koos simvastatiinraviga või ilma selleta ka oluliselt madalam põletik võrreldes simvastatiinravi rühmaga (p<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

Jätka lugemist...