2. osa: Verbaskosiid kaitseb pankrease rakke ER-stressi eest
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, pluss , Paola Marciani 1, pluss , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 ja Carla Perego 1,*
Palun klõpsake siin tagasi 1. osa juurde
3.4 Verbaskosiid moduleerib – rakkude mitokondriaalne aktiivsus ja dünaamika
MTT elujõulisuse testid viitavad võimalikule mõjuleverbascosideotse mitokondritele, mis tagab selle rakutüübi puhul insuliini sekretsiooni sidumise toitumisseisundiga ja rakkude ellujäämise. Kuju ja membraanipotentsiaal on mitokondriaalse tervise markerid [42]. Esmalt hindasime mitokondriaalse membraani potentsiaali, märgistades rakud MitoSpyw Orange CMTMRosiga, läbilaskva värvainega, mille kontsentratsioon sõltub sisemisest mitokondriaalsest membraanipotentsiaalist, samas kui MitoSpyw Green FM kasutati andmete normaliseerimiseks mitokondriaalse massi suhtes (joonis 4A, B). Mitokondrite membraanipotentsiaalverbascoside-töödeldud rakud suurenesid võrreldes kontrolliga nii põhi- kui ka stressitingimustes. Huvitaval kombelverbascosidemetaboliidid avaldasid erinevat mõju. Cafe hape ei parandanud mitokondriaalset potentsiaali, samas kui hüdroksütürosool põhjustas mitokondriaalse funktsiooni annusest sõltuvat kahjustust, kooskõlas rakkude elujõulisuse andmetega oli selline toime ilmne pärast H2O2 kokkupuudet (joonis S3).
Kuna funktsioon on rangelt seotud morfoloogiaga, mõõtsime Fereti läbimõõtu, pindala ja mitokondrite ringikujulisust. Äge oksüdatiivne stress soodustab ulatuslikku mitokondriaalset lõhustumist, mille tulemuseks on väiksemad ringikujulised mitokondrid [42]. H2O2 stressitingimustes olid verbaskosiidiga töödeldud rakkude mitokondrid piklikumad ja nende pind oli suurem kui kontrollrakkudel (joonis 4C, D ja joonis S4). Mitokondriaalne tsirkulaarsus oli verbaskosiidiga töödeldud rakkudes madalam kui kontrollides ja erinevused olid selgemad H2O2-ga töödeldud rakkudes (joonis S3), kinnitades taas polüfenooli kaitsvat rolli.
Nende organellide võime muuta oma kuju vastusena toitumisseisunditele või stressitingimustele on fusiooni- ja lõhustumisjuhtumite kontrolli all ning nõuab mitokondriaalset liikuvust [39]. Mitokondrite liikumiste jälgimine viis meid läbitud kumulatiivse vahemaa arvutamiseni ja analüüs näitas verbaskosiidiga töödeldud rakkude mitokondrite dünaamika märkimisväärset suurenemist võrreldes kontrolliga juba põhitingimustes (joonis 4E, F ja videod S1–S4). Mõju oli selgem pärast H2O2-ravi, tõepoolest, verbaskosiidi eeltöötlus muutis peaaegu täielikult oksüdatiivse stressi mõju mitokondriaalsele dünaamikale.
Kokkuvõttes toetavad need andmed tugevalt verbaskosiidi võtmerolli mitokondrite dünaamika tagamisel, mis on ülioluline selle organelli kiire kohanemise soodustamiseks stressitingimustega.
3.5 Verbaskosiidi mõju Langerhansi inimese ellujäämisele ja funktsioonidele
Arvestades tõlkepotentsiaaliverbascosideRakendamist inimeste tervises, kontrollisime selle mõju inimese isoleeritud Langerhansi saartele, mis on asjakohasem mudel rakkude füsiopatoloogiliste ja farmakoloogiliste uuringute jaoks. Eraldatud saarekesi töödeldi 16 uM verbaskosiidiga 5 päeva ja hinnati mitokondriaalse membraani potentsiaali. Nagu on näidatud joonisel fig 5A, kuigi organellide potentsiaal oli pärast H2O2-ga kokkupuudet kontrollitud inimese saarekestes ohus, ei vähenenud verbaskosiidiga eeltöödeldud saarekeste mitokondrite sisemembraani potentsiaal märkimisväärselt, toetades hüpoteesi verbaskosiidi kaitsva rolli kohta ROS-i indutseeritud vastu. rakkude düsfunktsioon. ER-stressimarkerite ekspressiooni analüüs näitas P-eIF2 fraktsiooni olulist vähenemist kahes erinevas saarepreparaadis, mida hoiti 16 uM verbaskosiidis, kinnitades selle raja allareguleerimist ka inimese proovides (joonis 5D). Polüfenoolravi kasulikke mõjusid kinnitas verbaskosiidiga töödeldud saarekeste suurenenud insuliinisisaldus võrreldes kontrollidega (joonis 5B). Andmete hajutamine meie katsetes ei võimaldanud näidata olulisi erinevusi glükoosiga stimuleeritud insuliini sekretsioonis (GSIS) verbaskosiidiga töödeldud saarekestes, kuigi positiivne trend näib olevat ilmne nii põhi- kui ka stressitingimustes (joonis 5C).
4. Arutelu
Oksüdatiivne stress ja põletik on T2D [43, 44] ajal tekkiva rakkude düsfunktsiooni aluseks, funktsionaalset toitu, toitaineid ja fütokemikaale on uuritud kui vahendeid II tüüpi diabeedi ennetamiseks [45]. Selles töös keskendusime verbaskosiidile, millel on teadaolevalt neuronites põletikuvastane ja antioksüdantne toime [18]. Vaatamata suurele struktuurilisele keerukusele on verbaskosiidi ja isoverbaskosiidi leitud rottide vereplasmast, keda toideti Lippia citriodora ekstraktiga koos mõne metaboliidiga [20]. Lisaks on rinnavähi rakuliinis SKBR3 [23] avastatud verbaskosiidi ja verbaskosiidi akumuleerumine rakkudesse ning Caco-2 rakkudega läbi viidud uuringud näitavad, et mõõdukas koguses verbaskosiidi ja isoverbaskosiidi jäävad puutumatuks ja on pärast in vitro seedimist biojuurdepääsetavad. protsessi. Lisaks suudab Caco-2 omastada mõlemat molekuli kiire ja lineaarse transpordi kaudu vahemikus 10–100 uM [22]. Verbaskosiidi biosaadavuse kohta inimestel ei ole andmeid, kuid ülalmainitud uuringud näitavad, et metaboliseerumata verbaskosiidil võib olla võimalik läbida soolebarjääri, ringelda vereplasmas ja avaldada antioksüdantset toimet endokriinsetele rakkudele. kõhunääre.
Leidsime verbaskosiidi annusest sõltuva (0,8–16 uM) kaitsva rolli kloon- ja inimese rakkudel nii põhi- kui ka stressitingimustes. See toime tuleneb verbaskosiidist endast, mitte selle metaboliitidest kofeiinhappest ja hüdroksütürosoolist, mis on 16 uM kontsentratsiooni juures tegelikult tsütotoksilised. Meie katsetes aktiivseks osutunud kontsentratsioonid on kooskõlas verbaskosiidiga toidetud loomadel kirjeldatutega [20].
Kuigi me ei tea, kas verbaskosiid toimib ekstratsellulaarselt, seondudes membraani retseptoriga või on endotsütoosiga internaliseeritud ja toimib rakusiseselt, kinnitavad meie andmed, et verbaskosiidil on antioksüdantsed ja põletikuvastased omadused ning see kaitseb rakke ER-stressiga seotud düsfunktsioonide eest, vähendades UPR ja mitokondriaalse dünaamika edendamine.
Tõepoolest, tuvastasime verbaskosiidiga töödeldud rakkudes olulise ROS-i sisalduse vähenemise, mida kinnitab veelgi lipiidide peroksüdatsiooni vähenemine, mõõdetuna HNE ja akroleiini ekspressioonide kaudu. Erinevalt enamikust taimede polüfenoolidest järgib verbaskosiidi ROS-i eemaldamise aktiivsus pigem kaudset (ROS-i eemaldavate ensüümide ülesreguleerimise kaudu), mitte otsest rada. Tegelikult suurendab see mõnede antioksüdantsete ensüümide geenide transkriptsiooni, aktiveerides Nrf2 (NF-E2-seotud faktor 2) raja ja AhR (arüülsüsivesinike retseptor) sõltuva mehhanismi kaudu [24,29]. Sellisena leidsime verbaskosiidiga töödeldud rakkudes SOD1 suurenenud ekspressiooni.
ROS-i homöostaas on rakkude patoloogias äärmiselt oluline. Antioksüdantsete ensüümide nappuse tõttu ei saa ROS-i suurenenud tootmist neutraliseerida ja indutseeritakse ER-stressi, mis soodustab valkude valesti voltimist. ER-i stress viib UPR-i aktiveerimise kaudu insuliini transkriptsiooni ja translatsiooni vähenemiseni [44,46]. Selle raja peamine eesmärk on ER-funktsiooni taastamine geeniekspressiooni ümberprogrammeerimise kaudu, kuid ülestimuleerimisel käivitab see apoptoosi. Meie andmed viitavad sellele, et verbaskosiidi oluline tegevus on UPR-i leevendamine, võimaldades ER-i düsfunktsiooni parandamiseks vajalikke modifikatsioone ilma apoptoosi põhjustamata. Selle võimaluse kohaselt vähenes BIP, HSP70 ja PERK valkude ekspressioon verbaskosiidiga töödeldud rakkudes ja PERK raja aktiveerimine nõrgenes vastusena tunikamütsiini poolt indutseeritud ER stressile. Sarnast toimet teatati türosooli puhul insulinoomi NIT-1 rakuliinis [47].
Eriti huvitav on verbaskosiidi võime moduleerida UPR-i PERK-i haru aktiveerimist. Rakkudes on see rada vajalik basaalse sekretoorse homöostaasi ja rakkude ellujäämise säilitamiseks ning see on diabeedi korral tõsiselt dereguleeritud [41, 48]. Veelgi intrigeerivam on see, et PERK-i tavalised variandid suurendavad eeldiabeedi riski ja retsessiivsed mutatsioonid EIF2AK3 geenis (kodeerivad PERK-i) on vastuvõtlikkuse aluseks Wolcott-Rallisoni sündroomile, mida iseloomustab püsiv vastsündinu insuliinist sõltuv diabeet [49, 50].
Meie süsteemis tuvastati verbaskosiidi juuresolekul ka IKB-NFKB põletikuraja alareguleerimine. NFKB esindab peamist põletikuteed rakkudes ja selle püsiv aktiveerimine käivitab sündmuste kaskaadi, mis kulmineerub rakusurmaga. Stressis rakkudes kaitseb NFKB ekspressiooni vähendamine pankrease rakke diabetogeensete ainete eest [27,51], toetades veelgi verbaskosiidi kasutamist diabeedi ennetamisel. Huvitaval kombel aktiveerib PERK signaalimine transkriptsioonifaktorid NFR2 (seotud redoks-homöostaasiga) ja NFKB, selgitades seega verbaskosiidi antioksüdantset ja põletikuvastast toimet [40,52].
Meie andmed näitavad ka verbaskosiidi olulist rolli mitokondriaalses aktiivsuses ja dünaamikas.
Mitokondriaalse töökvaliteedi marker on nende dünaamiline protsess, mida iseloomustavad kooskõlastatud fusiooni- ja lõhustamistsüklid, mis reguleerivad mitokondriaalset arvu, jaotumist, morfoloogiat ja membraanipotentsiaali [39]. Kooskõlas selle võimalusega parandab verbaskosiid tc3 mitokondriaalse membraani potentsiaali nii põhi- kui ka stressitingimustes. Jällegi on toime tingitud verbaskosiidist, mitte selle metaboliitidest, kuna kofeiinhape ei paranda mitokondriaalset funktsiooni ja hüdroksütürosool vähendab oluliselt organellide potentsiaali. Mitokondriaalset liikumist jälgides täheldati suurenenud mitokondriaalset dünaamikat ja muutusi nende morfoloogias, mis viitab sellele, et verbaskosiid soodustab mitomorfoosi programmi. Rakulise mitokondriaalse võrgustiku ümberkujundamine mõjutab hingamisahela superkomplekside kokkupanekut, muutes seega mitte ainult rakkude metabolismi, vaid ka selle redoksseisundit ning võimaldades rakkudel paremini võidelda oksüdatiivse stressi ja põletiku vastu [5, 37, 39].
Kuigi molekulaarne mehhanism on veel teadmata, võime oletada, et verbaskosiid, nagu ka teised polüfenoolid, kaitseb mitokondriaalset DNA-d, vähendades ROS-i kontsentratsiooni [53] ja takistab mitokondriaalse läbilaskvuse üleminekupoori avanemist [54], tagades mitokondriaalse füsioloogilise aktiivsuse. Veel üks intrigeeriv võimalus on see, et mitokondrite dünaamika ja aktiivsuse muutumist vahendab taas verbaskosiidi toime UPR-ile. Tõepoolest, hiljutised uuringud mitokondriaalses valdkonnas näitavad, et ER-mitokondrite interaktsiooni kohad mängivad võtmerolli mitokondriaalse dünaamika ja aktiivsuse kontrollimisel vastuseks oksüdatiivsele stressile ning PERK on seotud nähtusega [55]. Enamik in vitro uuringuid polüfenoolidega viidi läbi rakuliinides, mis on sageli kasvajalise päritoluga ja mis erinevad algrakkudest ainevahetuse ja ROS-i tootmise poolest. Pakume siin tõendeid selle kohta, et verbaskosiid avaldab kaitsvat toimet ka inimese isoleeritud Langerhansi saartele, mis on diabeedi sekkumise viimane sihtmärk. Huvitav on see, et polüfenool leevendab PERK signaali aktiveerimist juba põhitingimustes, suurendades seega insuliinisisaldust ja vältides oksüdatiivse stressi poolt vahendatud mitokondriaalseid düsfunktsioone. Jääb veel selgitada, kas polüfenoolide mõju insuliinisisaldusele peegeldab ühendi võimet ennetada rakusurma, leevendada ER stressi või kontrollida otseselt insuliini geeniekspressiooni, nagu on näidatud teiste polüfenoolsete ühendite puhul [56]. Need andmed on eriti olulised, arvestades verbaskosiidi võimalikku kasutamist täiendava ravina diabeedi ravis.
5. Kokkuvõtted
Siin kirjeldatud in vitro uuringud klonaalsete ja inimese rakkude kohta näitavad, et verbaskosiid avaldab kaitsvat toimet ER-stressiga seotud düsfunktsioonide vastu, leevendades UPR-i PERK haru aktiveerimist ja parandades mitokondrite dünaamikat. Kuna ER-i homöostaasi häirimine põhjustab rakkude kahjustusi ja diabeedi, annavad need andmed aluse verbaskosiidi võimalikule kasutamisele haiguste ennetamisel ja ravis toitainena. Siiski tuleb verbaskosiidi tõhusaks kliiniliseks kasutamiseks lahendada palju probleeme. Vaatamata arvukatele laboriuuringutele on usaldusväärsed kliinilised uuringud, mis kinnitavad verbaskosiidi mõju tervisele in vivo, piiratud. Lisaks on selle ühendi edaspidiseks kasutamiseks inimeste tervises selle stabiilsuse ja biosaadavuse suurendamine kohustuslik. Sellest hetkest alates on verbaskosiid huvitav molekul, kuna selle karkassil on erinevad reaktiivsed saidid, mida saab kombineeritud keemia abil muuta. Loodame, et nendest uuringutest saadud teave avab võimalused oksüdatiivse stressi ja patoloogiliste seisundite põletiku terapeutiliseks moduleerimiseks, kasutades looduslikke ühendeid.
Täiendavad materjalid: järgmised on veebis saadaval aadressil http://www.mdpi.com/2227-9059/8/12/582/s1. Joonis S1: kofeiinhappe ja hüdroksütürosooli mõju rakkude elujõulisusele. Joonis S2: verbaskosiidi mõju tunikamütsiini poolt indutseeritud ER stressile. Joonis S3: kofeiinhappe ja hüdroksütürosooli mõju mitokondriaalse membraani potentsiaalile. Joonis S4: kofeiinhappe ja hüdroksütürosooliga töödeldud rakkude mitokondrite kvantitatiivsed pildianalüüsid. Video S1, S2 Videod: Mitokondrite dünaamika salvestatakse põhitingimustes, verbaskosiidi puudumisel (S1) või olemasolul (S2). Video S3, S4: Mitokondrite dünaamika, mis on registreeritud oksüdatiivse stressi tingimustes, verbaskosiidi puudumisel (S3) või olemasolul (S4).
Autori kaastööd: Conceptualization, AG, PM ja CP; andmete kureerimine, AG ja PM; formaalne analüüs, AG ja PM; rahastamise omandamine, CP; uurimine, MC; metoodika, AM ja SG; ressursid, FB, RR ja ADG; järelevalve, CP; valideerimine, AM, SG ja MC; visualiseerimine, AG ja AM; kirjutamine – algne mustand, AG; kirjutamine – läbivaatamine ja toimetamine, PM, AM, FB, RR, ADG, MC ja CP Kõik autorid on käsikirja avaldatud versiooni läbi lugenud ja sellega nõustunud.
Rahastamine: see uurimus ei saanud välist rahastamist.
Tänuavaldused: Täname Carlo Corinot ja Mario Dell'Aglit reaktiivide ja kasuliku arutelu eest.
Huvide konflikt: autorid ei deklareeri huvide konflikti.
Viited
1. Cho, NH; Shaw, JE; Karuranga, S.; Huang, Y.; da Rocha Fernandes, JD; Ohlrogge, AW; Malanda, B. IDF Diabeedi atlas: Diabeedi levimuse globaalsed hinnangud 2017. aastaks ja prognoosid 2045. aastaks. Diabetes Res. Clin. Harjuta. 2018, 138, 271–281. [CrossRef]
2. Leslie, RD; Palmer, J.; Schlott, NC; Lernmark, A. Diabeet ristteel: haiguste klassifikatsiooni olulisus patofüsioloogia ja ravi seisukohalt. Diabetologia 2016, 59, 13–20. [CrossRef] [PubMed]
3. Tokarz, VL; MacDonald, PE; Klip, A. Süsteemse insuliini funktsiooni rakubioloogia. J. Cell Biol. 2018, 217, 2273–2289. [CrossRef] [PubMed]
4. Perego, C.; Da Dalt, L.; Pirillo, A.; Galli, A.; Catapano, AL; Norata, GD Kolesterooli metabolism, pankrease rakkude funktsioon ja diabeet. Biochim. et Biophys. Acta (BBA) Mol. Alus Dis. 2019, 1865, 2149–2156. [CrossRef] [PubMed]
5. Galli, A.; Alžeeria, M.; Marciani, P.; Schulte, C.; Leonardi, C.; Milani, P.; Mafoli, E.; Tedeschi, G.; Perego, C. Pankrease-rakkude diferentseerumise ja funktsioneerimise kujundamine: mehaanilise ülekande mõju. Cells 2020, 9, 413. [CrossRef]
6. Ashcroft, FM; Rorsman, P. Diabeet mellitus ja rakk: viimased kümme aastat. Cell 2012, 148, 1160–1171. [CrossRef] [PubMed]
7. Rosengren, AH; Braun, M.; Mahdi, T.; Andersson, SA; Travers, MINA; Shigeto, M.; Zhang, E.; Almgren, P.; Ladenvall, C.; Axelsson, AS; et al. Vähenenud insuliini eksotsütoos inimese pankrease rakkudes, mille geenivariandid on seotud II tüüpi diabeediga. Diabeet 2012, 61, 1726–1733. [CrossRef] [PubMed]
8. Polonsky, KS Insuliini sekretsiooni dünaamika rasvumise ja diabeedi korral. Int. J. Obes. 2000, 24, S29–S31. [CrossRef]
9. Roden, M.; Shulman, GI II tüüpi diabeedi integreeriv bioloogia. Loodus 2019, 576, 51–60. [CrossRef]
