Osa 2: ehhinakosiid kutsub esile apoptootilise vähirakkude surma, inhibeerides nukleotiidide kogumit desinfitseeriva ensüümi MTh1

ehhinakosiid kutsub esile apoptootilise vähirakkude surma, inhibeerides nukleotiidide kogumit desinfitseerivat ensüümi MTh1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche ehhinakosiidonvähivastanejaanti-apoptootilinemõjusid

Pls 3. osa vaatamiseks klõpsake siin

Pls 1. osa vaatamiseks klõpsake siin

Tulemused

Ehhinakosiidi identifitseerimine MTh 1 inhibiitorina

MTH1 inhibeerima võimeliste looduslike ühendite otsimiseks kasutasime MTH1-katalüüsitud ensümaatilist reaktsiooni suure läbilaskevõimena vitro sõeluuringus. Lisaks oksüdeeritud puriini nukleotiididele võib MTH1 hüdrolüüsida ka normaalset desoksüguanosiintrifosfaati, et tekitada desoksüguanosiinmonofosfaati ja pürofosfaati. Liigse anorgaanilise pürofosfataasi juuresolekul muudetakse kõik pürofosfaadid anorgaanilisteks fosfaatideks, mida saab kvantifitseerida malahhiitrohelisel põhineva neeldumistestiga41, mis võimaldab kaudselt mõõta MTH1 aktiivsust.32 Testisüsteemi testimiseks mõõtsime kõigepealt (S)-krisotiniib, ühend, millel on tõestatud tõhusus MTH1 inhibiitorina.33 Tulemused näitasid, et (S)-krisotiniib inhibeeris tõepoolest tugevalt MTH1 (joonis 1A) IC50 väärtusega 500 nM, mis oli seitse korda kõrgem kui Huberi poolt teatatud. jt (72 nM).33 Tõenäoliselt oli see tingitud erinevustest tuvastamismeetodites või kemikaalide ja ensüümide allikates. Võtsime kasutusele vähem tundliku kromogeense lähenemisviisi, samal ajal kui Huber jt kasutasid väga tundlikku bioluminestseeruvat meetodit.33 Seda silmas pidades kontrollisime 12 kaubanduslikult saadavat looduslikku ühendit (tabel S1), millest igaüks on traditsiooniliste ürtide peamine koostisosa, millel on võimalik kasvajavastane toime. tegevust.ehhinakosiid, parasiitravimtaimest Cistanche salsa puhastatud ühend (joonis 1C), inhibeeris reaktsiooni märkimisväärselt (joonis 1B) IC50 väärtusega 7,01 ± 2,13 μM (joonis 1D). 50 korda suurema pürofosfataasi lisamine ei mõjutanud tulemust, samas kui viis korda rohkema MTH1 valgu lisamine vähendas oluliselt inhibeerimise astet, mis viitab sellele, etehhinakosiidinhibeeris in vitro ensümaatilises testis spetsiifiliselt MTH1 aktiivsust.

Ehhinakosiid inhibeeris raku MTh 1, et suurendada rakusisese 8-oksogi

Järgmiseks küsisime, kasehhinakosiidvõib pärssida rakusisest MTH1 aktiivsust. Rakulise MTH1 inhibeerimine põhjustab rakusisese 8-oksoG suurenemise. On näidatud, et avidiin seondub 8-oksoG-ga kõrge spetsiifilisusega;42 seetõttu kasutasime immunofluorestsentsvärvimist Cy3-konjugeeritud avidiiniga, et võrrelda rakusiseseid 8-oksoG tasemeid erinevates vähirakuliinides enne ja pärastehhinakosiidravi. Inimese MG{{0}} osteosarkoomi, SK-HEP-1hepatokartsinoomi, MCF-7 rinnavähi ja SW480 kolorektaalse vähi rakke raviti 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM või 80 μM ehhinakosiidi 5 tunniks, 12 tunniks või 24 tunniks. Värvimine Cy3-konjugeeritud avidiiniga näitas, et 24-tunnine töötlemine 60 µM ehhinakosiidiga suurendas selgelt ja märkimisväärselt rakulise 8-oksoG (Cy3-avidiini reaktiivne aine) taset nendes vähirakkudes ( Joonis 2A ja B). Kõrgem kontsentratsioon (80 μM).ehhinakosiidtulemuseks oli tugevam rakuline 8-oksoG värvumine (joonis 2B), mis viitab annuse-vastuse suhtele. Sarnased tulemused saadi

immunofluorestsentsvärvimisega hiire monoklonaalse anti-8-oksoG-antikehaga (joonis S1A).43ehhinakosiid(60 μM), mis on vajalik rakulise 8-oksoG oluliseks suurenemiseks, oli palju suurem kui in vitro testis saadud IC50 (7,01 μM). See oli tõenäoliselt tingitud kahe analüüsi tundlikkuse erinevusest. Immunofluorestsentsvärvimine on palju vähem tundlik kui in vitro ensümaatiline test; lisaks mõjutavad komplekssed bioloogilised protsessid inhibiitormolekulide arvu, mis võivad jõuda raku MTH1-le ja sellega interakteeruda; lisaks kasutatakse in vitro testis substraadina vähem lemmikut dGTP-d ja seetõttu võib MTH1 inhibeerimine olla lihtsam (kasutada vähem inhibiitoreid), mille tulemuseks on madalam IC50 in vitro testis.

ThevähivastanejaantioksüdantmõjudehhinakosiidalatesCistanchedeserticola

Raku 8-oksoG-d tekitab ROS, millele antioksüdandid antagoniseerivad. Seega tooks raku ROS-i suurenemine või antioksüdantide aktiivsuse pärssimine kaasa ka raku 8-oksoG taseme tõusu.ehhinakosiidise on tugev antioksüdant44,45 ja peaks seega pigem suurendama kui pärssima antioksüdantide aktiivsust. Et uurida, kas raku ROS-i taset muutisehhinakosiidravi ajal töödeldi samu vähirakke 0 µM, 15 µM, 30 µM, 60 µM või 80 µM ehhinakosiidiga 5 tundi, 12 tundi või 24 tundi ja analüüsiti seejärel voolutsütomeetria abil pärast fluorestsentsvärviga värvimist. sond 2',7'-diklorofluorestseiindiatsetaati. Tulemused näitasid, et ükski neist ravimeetoditest ei muutnud raku ROS-i taset (joonis 2C ja D). Seega oli suurenenud raku 8-oksoG tase tõenäoliselt tingitud MTH1 inhibeerimisest ehhinakosiidi poolt.

ehhinakosiidpõhjustas ulatuslikke DNA kahjustusi spetsiifiliselt vähirakkudes. 8-oksoG lisamine DNA-sse stimuleerib BER-i ja MMR-i, mis tekitavad üheahelalisi DNA katkestusi (SSB) ja lünki.16,17 Tavaliselt tihendatakse need katkestused ja lüngad parandusmehhanismid, mis hõlmavad tühimike täitmist ja ligeerimist DNA polümeraaside ja ligaasidega.46,47 Rakulise SSB kiire kasv võib aga küllastada raku paranemisvõimet, mis toob kaasa arvukate kaheahelaliste DNA katkestuste (DSB) moodustumise18 ja DDR signaaliülekande. Et uurida, kasehhinakosiid- indutseeritud raku 8-oksoG põhjustatud DNA kahjustuste suurenemine, uurisime ühte DNA kahjustuse varajast markerit, 53BP1, mis seostub DSB saitidega kui varaseim rakuline reaktsioon DSB-le.48 MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 ja SW480 vähirakuliinid ning mittevähirakuliinid inimese normaalne maks L-O2, 49 inimese embrüonaalne neer HEK 293 ja hiire fibroblastid NIH/ 3T3 töödeldi 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM või 80 μM ehhinakosiidiga 5 tundi, 12 tundi või 24 tundi. Fluorestseeruv immunovärvimine näitas, et 24-tunnine ravi 60 μM ehhinakosiidiga suurendas spetsiifiliselt viie või enama tugevalt värvunud tuuma 53BP1 fookusega rakkude arvu kõigis vähirakkudes, kuid mitte üheski mittevähi rakuliinis (joonis 2E ja F). 53BP1 pluss rakkude arvu olulist suurenemist täheldati juba 5 tundi pärast ehhinakosiidiga ravi alustamist (joonis 2F). Ehhinakosiidi kõrgem kontsentratsioon (80 μM) või pikem raviaeg (12 tundi ja 24 tundi) suurendas nii 53BP1 pluss rakkude arvu (joonis 2F) kui ka rakuliste 53BP1 fookuste arvu. Need tulemused näitavad koos, et MTH1 inhibeerimine ehhinakosiidi poolt põhjustas 8-oksoG akumulatsiooni ja ulatuslikke DNA kahjustusi vähi puhul, kuid mitte vähirakkudes.

ehhinakosiid pärssis vähirakkude proliferatsiooni

Rakutsüklis põhjustavad parandamata DNA ahela katkestused DNA replikatsioonikahvlite kokkuvarisemise, mis viib seejärel rakkude proliferatsiooni blokeerimiseni, kutsudes esile rakutsükli seiskumise ja apoptoosi.50 Et kontrollidaehhinakosiidrakkude kasvu ja proliferatsiooni osas analüüsisime esmalt ehhinakosiidiga töödeldud MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 ja SW480 vähirakkude kasvu kolooniate moodustumise testiga. Tulemused näitasid, et vähirakke töödeldi 60 μM või 80 μMehhinakosiidmoodustasid palju vähem kolooniaid ja moodustunud kolooniad olid palju väiksemad (joonis 3A ja B), mis näitab oluliselt allasurutud kasvupotentsiaali. Järgmisena analüüsisime nende vähirakkude proliferatsiooni koos L-O2, HEK 293 ja NIH/3T3 mittevähirakkudega MTT testiga. Tulemused näitasid, et ehhinakosiid pärssis annusest sõltuvalt vähi, kuid mitte vähirakkude proliferatsiooni (joonis 3C). 60 μM ehhinakosiidiga töödeldud vähirakkude ajaline uuring näitas, et 5 tunni pärast ei olnud mitteravitud ja ravirühmade vahel olulist erinevust, kuid 12 tunni pärast pärssis vähirakkude proliferatsioon oluliselt 60 μM.ehhinakosiid(Joonis 3D).

rakutsükli etapid näitasid voolutsütomeetria abil, etehhinakosiidravi vähendas annusest sõltuvalt rakkude protsenti nii S- kui ka G2 / M-faasis, samas kui rakkude protsent G1-faasis suurenes (joonis 4C ja D). Pärast MG-63 rakkude 80 μM ehhinakosiidiga töötlemist 24 tunni jooksul vähenesid G2/M faasi rakud 15 protsendilt peaaegu nullini ja S-faasi rakkude arv 37 protsendilt 17 protsendini. , samas kui rakkude arv G0/1 faasis kasvas 43 protsendilt 80 protsendini (joonis 4E). Need tulemused näitavad, et ravi koosehhinakosiidindutseeris rakutsükli peatamise ja blokeeris vähirakud G1 faasis.

Ehhinakosiid indutseeris vähirakkudes apoptoosi

Kooskõlas rakkude proliferatsiooni vaatlustega näitas Western blot analüüs, et töötlemine 60 μM ja 80 μMehhinakosiid24 tunni jooksul suurendas aktiivse kaspaasi -3 ja lõhustatud polü (ADP-riboos) polümeraasi valkude taset vähirakkudes (joonis 5A ja B), mis viitab kaspaasist sõltuva apoptoosi esilekutsumisele. Seejärel uurisime mitmeid apoptoosi rakulisi markereid. Esiteks, tuuma morfoloogiaehhinakosiid-töödeldud vähirakud paljastati värvimisel DNA-värviga DAPI, mis näitas, et 24-tunnine ravi 60 μM ja 80 μMehhinakosiidsuurendas apoptoosi tunnuste, sealhulgas püknoosi ja kondenseerunud kromatiini (heledamad tuumad) arvu (joonis 5C). Teiseks analüüsiti sarnaselt töödeldud vähirakkudest ekstraheeritud DNA-d elektroforeesiga agaroosgeelil, mis näitas tüüpilist apoptootilist redeli mustrit (joonis S1B). Lõpuks tuvastati raku aktiivne kaspaas-3 immunofluorestsentsvärvimisega, mis näitas tugevaid aktiveeritud kaspaas-3 signaaleehhinakosiid-ravitud vähirakud (joonis S1C).

Järgmisena mõõdeti anneksiin V-FITC ja PI topeltvärvimise ja voolutsütomeetria abil apoptootiliste rakkude protsenti. Rakkude analüüs, mida on töödeldud 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM või 160 μMehhinakosiid2 tundi, 5 tundi, 12 tundi või 24 tundi näitasid, et 60 μM või kõrgemad kontsentratsioonidehhinakosiidkutsus esile olulise apoptoosi vähirakkudes MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 ja SW480 (joonis 6A), kuid mitte vähirakkudes L-O2, HEK 293 ja NIH/3T3 rakud (joonis S2). Pärast MG-63 rakkude töötlemist 60 μM, 80 μM või 160 μMehhinakosiid24 tunni jooksul suurenes apoptootiliste rakkude protsent 8,89 protsendilt 33,72 protsendini, 39,01 protsendini ja 48,12 protsendini (joonis 6A). Aja jooksul tehtud uuring näitas, et 5 tunni pärast ei ilmnenud olulist erinevust mitteravitud ja ravirühmade vahel, kuid pärast 12-tunnist töötlemist ehhinakosiidiga 60 μM või kõrgema kontsentratsiooniga täheldati olulist apoptoosi (joonised 6B ja S3).

Lõpuks näitas mitokondriaalse membraani potentsiaali mõõtmine JC-1 fluorestsentsvärviga selgelt mitokondriaalse membraani potentsiaali märgatavat vähenemist pärast töötlemist 60 μMehhinakosiid12 tunni jooksul (joonis 6C), kuid mitte 5 tunni pärast, mis näitab sisemise apoptoosi raja aktiveerumist pärast kõrgenenud 8- oxodG põhjustatud DNA kahjustusi.

Thevähivastaneja põletikuvastast toimetcistanche ehhinakosiid

Arutelu

ehhinakosiidon looduslik ühend, mis on eraldatud ravimtaimedest Cistanche ja Echinacea.51,52 Sellel on mitmekülgsed tervist edendavad ja haigusi ennetavad omadused, sealhulgas neuraalne kaitse, hepatokaitse, põletikuvastane, väsimusevastane, vananemisvastane, diabeedivastane ja kasvajavastane toime. 53–58 Tuntuim ja tunnustatud bioaktiivsusehhinakosiidon selle antioksüdatiivne ja ROS-i eemaldav toime;44,45 aga on näidatud, et see põhjustab vähirakkudes ka oksüdatiivseid DNA kahjustusi, mille aluseks olevad mehhanismid jäävad ebaselgeks.58 Käesolevas uuringus kasutati suure läbilaskevõimega in vitro sõeluuringuid. test, leidsime selleehhinakosiidinhibeeris tõhusalt MTH{0}}katalüüsitud ensümaatilist reaktsiooni. MTH1 ensüümi koguse suurendamine vähendas inhibeerimise astet, samas kui anorgaanilise pürofosfataasi koguse suurendamine ei mõjutanud inhibeerimist, mis näitab, et ehhinakosiid inhibeeris spetsiifiliselt MTH1 aktiivsust in vitro testis. Inimese erinevate vähirakuliinide ravi ehhinakosiidiga põhjustas raku 8-oksoG taseme olulise tõusu, muutmata raku ROS-i taset. Arvestades, et ehhinakosiid ise on tugev antioksüdant, viitasid need tulemused sellele, et suurenenud rakusisene 8-oksoG tase oli tõenäoliselt tingitud raku MTH1 pärssimisest ehhinakosiidi poolt.

Ravi koosehhinakosiidpõhjustas ulatuslikke DNA kahjustusi ja G1 / S-CDK blokaatori p21 olulist ülesreguleerimist, millele järgnes märgatav apoptootiline rakusurm ja rakkude proliferatsiooni pärssimine spetsiifiliselt vähi korral, kuid mitte vähirakkudes. Lisaks ilmneb mitokondriaalse membraani potentsiaali märgatav kadu pärast

ehhinakosiidravi näitas sisemise apoptoosi raja aktiveerimist.ehhinakosiid-indutseeritud DNA kahjustusi ja p21 ülesreguleerimist täheldati 5 tunni jooksul pärast ravi, samas kui vähirakkude apoptoosi, mitokondriaalse membraani potentsiaali katkemist ja kasvu pärssimist täheldati 12 tundi pärast ravi alustamist. Need andmed kinnitavad, et vähirakkude apoptoos ja kasvu pärssimine olid MTH1 inhibeerimisest põhjustatud ulatuslike DNA kahjustuste tulemus. Hiljutised uuringud on näidanud, et raku dNTP kogumi suuruse vähenemine võib samuti esile kutsuda DNA replikatsioonistressi ja DNA kahjustusi.59,60 Siiski on ehhinakosiidiga töödeldud vähirakkude 8-oksoG taseme 200-protsendiline tõus vaidleb vastu. dNTP kogumi suuruse vähenemise võimalus ja Bcl2, dNTP kogumi suurust vähendav valk60, vähenes ehhinakosiidiga töödeldud SW480 vähirakkudes märkimisväärselt;58 pealegi näitasid meie andmed selgelt, et ehhinakosiid inhibeeris otseselt MTH1, mis võiks vähemalt olla osaliselt vastutab ehhinakosiidi põhjustatud DNA kahjustuste ja rakuliste mõjude eest.

dNTP kogum on ROS-i kriitiline sihtmärk ja oksüdeeritud dNTP-d on olulised oksüdatiivse DNA kahjustuse allikad.3,10 Parandusega seotud DNA SSB-d ja DSB-d võivad põhjustada rakkude vananemist ja apoptoosi, mis on seotud vananemise ja suure kasvajasisese kasvajaga. heterogeensus ja kõrge mutatsioonimäär vähirakkudes. Seevastu MTH1 inhibeerimine on suunatud fenotüübile, mis eristab enamikku vähirakke normaalsetest rakkudest ja esindab seega uudset vähivastast strateegiat, mida geneetilised kohandused ei piira. Huvitaval kombel on välja töötatud apoptoosivastase valgu Bcl266,67 ja proapoptoosi agonistid Bax68 väikesemolekulilised antagonistid, mis on osutunud paljutõotavateks uudseteks vähivastasteks aineteks. Arvestades nende üksteist täiendavaid toimemehhanisme, looks MTH1 inhibiitorite ja apoptoosi soodustavate kemikaalide kombineerimine põneva uue põlvkonna vähivastaseid ravimeid.

Esimest korda demonstreerisime ehhinakosiidi kui vähivastase loodusliku ühendi uut funktsiooni. In vitro testis inhibeeris ehhinakosiid MTH1 IC50 väärtusega 7,01 µM. See IC50 väärtus on kõrgem kui seni teatatud MTH1 inhibiitorite oma.32,33,69 (S)-krisotiniibi kasutamisel positiivse kontrollina näitasime, et meie test on seitse korda vähem tundlik kui Huberi jt.33. , on ehhinakosiidi tegelik IC50 tõenäoliselt madalam. Sellegipoolest tuleb selle raviainena väljatöötamiseks tõenäoliselt parandada loodusliku ehhinakosiidi molekuli efektiivsust. Loodusliku tootena, mida on pikka aega kasutatud taimsete ravimitena, võib ehhinakosiid olla hea keemiline karkass tõhusate ja tõenäoliselt ohutute MTH1 inhibiitorite väljatöötamiseks.37,70 Arvestades, et looduslikud tooted on olnud uudsete keemiliste karkasside rikkalik allikas. ratsionaalse struktuuripõhise ravimidisaini jaoks70 lähenemisviisi, mis sarnaneb siin kasutatule,

koos tohutu huviga ravimite avastamiseks mõeldud looduslike toodete vastu on kasulikud uute, sihtotstarbeliste, tõhusate ja ohutute ravimite leidmisel.

Cistancheehhinakosiidonvähivastaneja immuunsust tugevdav toime