2. osa Cistanches Herba (Rou Cong Rong) ravimite tuvastamine, kasutades liigispetsiifilisi nukleotiidisignatuure

Uurides selles uuringus välja töötatud nukleotiidide signatuure, leidsime, et 15 Hiina patenditud ravimist 31-st olid märgistatud, et need sisaldavadCistanches Herbaselle asemel sisaldasid võltsaineid, sealhulgas kaheksat võltsitud koostisosa ja seitset võltsimisainet (tabel 2). Näiteks kuus partiid asendati Cy-ga. songaricum, sealhulgas kolm partii Shihu Yeguangi pille, üks partii Kangguzhi Zengshengi pille, üks partii Sanbao kapsleid ja üks partii Wenweishu osakesi.

Lisaks andsid sama tootja erinevad partiid mõnevõrra erinevaid tulemusi. Näiteks ühe tootja kolme partii hulgas (ZCY16, ZCY69 ja ZCY71) sisaldas üks partii Ci segu.deserticolaja Cy. songaricum, sisaldas üks partii seguCi. deserticolajaCi. tubulosaja ainult üks partii sisaldasCi. tubulosa. Samuti erinesid kaks teise tootja partiid (ZCY44 ja ZCY70): üks partii sisaldas Cy. songaricum, samas kui teine ​​partii sisaldasCi. deserticolajaCi. tubulosa.

Cistanches Herbatuvastati 23-s 31-st testitud Hiina patendiravimist (tabel 2) ja ainult 16 proovi olid autentsed, nt ilma võltsitud koostisosadeta.Ci. tubulosatuvastati 16 Hiina patenditud ravimite partiis ja Ci. deserticola tuvastati 10 partiis. O. coerulescens'i ei leitud üheski tootes (tabel 2).

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

ARUTELU

Vajadus töötada välja uus meetod müügilolevate ravimite seireks, mis sisaldavadCistanchesHerba

Cistanches Herbaon toonik, mida kasutatakse laialdaselt taastavates Hiina patentravimites ja muudes ravimites. Hiina patendiga ravimite kvaliteedikontroll on aga koostisosade mitmekesisuse ja keerukuse tõttu suur väljakutse. Regulatiivse järelevalve puudumise tõttu on toote võltsimise või võltsimise oht märkimisväärne. Lisaks tuleks kõiki tooteid töödelda vastavalt farmakopöale või muudele standarditele; võltsimine või võltsimine ei ole töötlemise ajal lubatud. Seega on välja töötatud erinevaid kvaliteedikontrolli meetodeid, nagu mitmesüdameline kahemõõtmeline vedelikkromatograafia (Yao et al., 2015), lähi-infrapuna peegeldusspektroskoopia (Zhang ja Su, 2014; Zhang et al., 2015). ) ja vedelikkromatograafia-massispektromeetria (Wang et al., 2016b). Hiina farmakopöa komisjonis (2015) praegu kasutusel olevaid analüütilise keemia meetodeid ei saa aga kasutada Hiina patendiravimite kõigi koostisosade autentimiseks ega rikkuvate koostisosade tuvastamiseks. Veelgi enam, uuringud on näidanud, et sihtmärgiks olevad metaboliidid taimedes muutuvad toote töötlemise käigus, mille tulemuseks on märkimisväärne varieeruvus katsetulemustes või katsemeetodite täielik ebaõnnestumine (Ananingsih et al., 2013). Seega on molekulaarsed tööriistad, nagu liigispetsiifilised nukleotiidisignatuurid, valmis tugevdama kvaliteedikontrollisüsteeme toote võltsimise ja võltsimise ning märgistamata koostisosade lisamise ohu vastu.

Kuigi ITS/ITS2 peetakse taimsete ravimite identifitseerimisel tõhusaks vahendiks, ei saa neid järjestusi kõrgelt töödeldud proovidest amplifitseerida (Newmaster et al., 2013; de Boer et al., 2015). Wang et al. teatas, et ITS2 ei saa amplifitseerida Angelicae Sinensis Radix ekstraktist ega keetmisest, mida keedeti üle 120 minuti (Wang et al., 2016a). Traditsiooniliste tehnoloogiate ja Hiina farmakopöa komisjoni (2015) kohaselt on Cistanches Herba alati kõrgelt töödeldud, et suurendada selle meditsiinilist efektiivsust; need protsessid hõlmavad ahjus kuivatamist, soolamist ja aurutamist veiniga (Zou et al., 2017), mis viivad DNA lagunemiseni. Lisaks lisatakse töötlemise käigus erinevaid abiaineid, nagu mesi, tärklis, dekstriin. Kui neid abiaineid täielikult ei eemaldata, mõjutab see DNA puhtust. Näiteks Cistanches Herbat sisaldavate Sanbao kapslite valmistamiseks kasutatakse järgmist tootmisprotsessi: "Keeda meditsiinilisi viile kaks korda 1,5 tundi, ühendage keetmised ja filtreerige segu. Kontsentreerige filtraat suhtelise tiheduseni 1,20–1,25 (80 °C juures). ◦C). Lisage muud jahvatatud pulbrid ja ühendage need homogeense segu saamiseks. Seejärel kuivatage segu temperatuuril 60 °C ja jahvatage see peeneks

Kuid pärast ülalkirjeldatud tootmisprotsessi võib Hiina patendiravimite DNA ekstraheerimisel tekkida raskusi ja lagunenud DNA-st ei pruugita amplifitseerida pikki fragmente, mis takistaks rikkujate tuvastamist. Seega, et tagada DNA kvaliteeti ja puhtust, lisasime enne genoomse DNA ekstraheerimist täiendavaid samme, sealhulgas pesemine eelpesupuhvriga ja kümne paralleelse tuubi elueerimine ühte katsutisse iga partii kohta.

Kuigi kõik käesolevas uuringus kasutatud Hiina patendiravimid sisaldasid 6–25 koostisainet, võisid välja töötatud praimeripaarid spetsiifiliselt võimendada nende Hiina patendiravimite segajate järjestusi. PCR-toodete otsene järjestamine näitas puhtaid jäljefaile. Seega on see nukleotiidide allkirja meetod võimeline tuvastama nii autentseid liikide koostisosi kui ka rikkujaid ning peaks laiendama DNA-põhiste molekulaardiagnostika vahendite kasutamist turujärelevalve jaoks.

neerukahjustusi ja -haigusi saab ravida cistanche'iga

Nukleotiidallkirjad Cistanches Herba toodete tõhusaks tuvastamiseks

PCR-tehnoloogiat kasutavad molekulaarsed tööriistad on ravimite autentimiseks kvaliteedikontrollisüsteemides väga paljutõotavad. Praimerite edukas kasutamine Cistanches Herba DNA-lagunenud ainete tuvastamiseks viitab sellele, et PCR-põhist tuvastamismeetodit võiks laialdaselt kasutada. Hiina taimsete ravimite turul on autentsete Cistanches Herba liikide koostisosade hind enam kui viis korda kõrgem kui selle rikkujate hinnad. Meie tulemused näitasid, et Cy. songaricum on turul kõige levinum Cistanches Herba rikkuja, millele järgneb Ci. Sinensis. Cy. songaricum lisati, kuna neil ravimitel on sarnased morfoloogilised omadused. Lisaks on Ci keemiline koostis. sinensis on sarnane Cistanches Herba omaga. Kvaliteedikontrolli markeritenaCistanches Herbaekstrakte, ehhinakosiidi ja akteosiidi saab odavalt ekstraheerida Ci-st. sinensis. Seega kasutavad mõned farmaatsiatehased Ci. sinensis aseainena Cistanches Herba ekstraktide tootmisel. Kokkuvõttes näitavad selle uuringu tulemused, et ravimite turul esineb märkimisväärseid pettusi.

Hiina patendimeditsiinis on võltsimine sarnane teiste riikidega. Sarnased võltsimise tasemed on registreeritud Põhja-Ameerikas (Newmaster et al., 2013), Euroopas (Raclariu jt, 2017) ja Aasias (Cheng et al., 2014; Shanmughanandhan jt, 2016; Gao jt. , 2017). Selles uuringus oli Hiina patendiga ravimite võltsimise määr ligikaudu 48,4 protsenti, kusjuures 31 proovist ainult 16 olid autentsed Cistanches Herba. Lisaks oletasime, et sama tootja toodetega saadud erinevad tulemused võivad olla tingitud Hiina meditsiini materjalide erinevate partiide kvaliteedi erinevustest. Seetõttu tuleks Hiina patendiga ravimite kvaliteedi kontrollimiseks enne toodeteks töötlemist toormaterjalid autentida.

VõltsimineCistanches Herbaon traditsiooniliselt seostatud tooraine pakkumise ja nõudlusega.Ci. deserticolajaCi. tubulosaon kaks algset tehast, mida praegu kasutatakse valmistamiselCistanches Herba. Siiski, Ci. deserticola on Hiina farmakopöa komisjonis (2000) loetletud traditsiooniliste autentsete Cistanches Herba ainus originaalliik, milles Ci. tubulosa on tuvastatud kui rikkuja. Ci puuduse tõttu. deserticola ressursid,Ci. tubulosaon alates 2005. aastast kantud Hiina farmakopöa toidulisandina (Jiang ja Tu, 2009). Kuni viimase ajani on nende ürtide hinnad märkimisväärselt erinenud; Ci. tubulosa on olnud palju odavam kui Ci. deserticola, sest esimest on palju suurem pakkumine. Siin näitasid meie tulemused, et Ci. tubulosat kasutatakse laialdasemalt kaubanduslikult saadavates Cistanches Herba toodetes.

Kokkuvõtteks võib öelda, et nukleotiidide signatuurid ja PCR-põhised

Selles uuringus välja töötatud meetodid võivad olla kasulikud vahendid ravimitööstusele koostisosade autentimiseks ja rikkujate tuvastamiseksCistanchesHerba tooted. Vastavalt tundlikkuse tulemusele saab seda qRT-PCR abil tuvastada isegi juhul, kui lahutusaine osakaal oli üks kümnest tuhandest. See tähendab, et kui nukleotiidi allkiri on tuvastatudCistanchesHerba sisaldavate funktsionaalsete toodete puhul võib seda tuvastada võltsitud koostisosana. Võltsitud koostisosade või võltsitud Cistanches Herba tuvastamiseks pakuti uudset lahendust, mida Hiina farmakopöa keemiliste tuvastamismeetodite abil varem ei olnud. Lisaks võiks seda meetodit kasutada üha enam kasutatavate ravimite valideerimiseks ja DNA-põhiste molekulaardiagnostika vahendite kasutusala laiendamiseks turujärelevalve jaoks.

Et leevendadakroonilineneerudhaiguskooscistanche

AUTORI KAASALAD

JH kavandas uuringu ja osales selle kavandamises. XW, RX ja JC andsid proovid ja viisid läbi katsed. XW analüüsis andmeid. XW, JH, ZZ, S-GN, JS ja SC koostasid käsikirja. Kõik autorid on lõpliku käsikirja läbi lugenud ja heaks kiitnud.

RAHASTAMINE

Seda tööd toetas Hiina riiklik loodusteaduste sihtasutus [grandi number 81673552], CAMS Innovation

Meditsiiniteaduste fond [grandi number 2016-I2 M- 3-016] ja Hiina riikliku loodusteaduste fondi United Fund Key Project [grandi number U1403224].

TUNNUSTUS

Soovime tänada oma kolleege, kes aitasid proovide kogumisel, tuvastamisel, laboritöödel ja käsikirjade ettevalmistamisel, sealhulgas Chaokui Sun, Dianyun Hou ja Piao Zhang.

LISAMATERJAL

Selle artikli lisamaterjali leiate veebist aadressil https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/täis#lisamaterjal

Täiendav joonis S1|Kuue liigi ITS2 järjestuse joondamise tulemus.

Täiendav joonis S2|Kõigi proovide agaroosgeeli elektroforees.

Täiendav tabel S1|Proovide võtmine Cistanches Herba ja selle rikkujate kohta.

Täiendav tabel S2|GenBankist alla laaditud seotud liikide järjestusteave.

Täiendav tabel S3|Erinevate Hiina patendimeditsiini näidiste deklareeritud koostised.

Täiendav andmeleht S1|Kõik selles uuringus saadud järjestused.

Cistanchedeserticolal on palju mõjusid

VIITED

Ananingsih, VK, Sharma, A. ja Zhou, W. (2013). Rohelise tee katehhiinid toidu töötlemise ja ladustamise ajal: stabiilsuse ja tuvastamise ülevaade. Food Res. Int. 50, 469–479. DOI: 10.1016/j.foodres.2011.03.004

Chen, H., Jing, FC, Li, CL, Tu, PF, Zheng, QS ja Wang, ZH (2007). Ehhinakosiid hoiab ära monoamiini striataalse rakuvälise taseme

neurotransmitterite vähenemise tõttu 6-hüdroksüdopamiinikahjustusega rottidel. J. Ethnopharmacol. 114, 285–289. DOI: 10.1016/j.jep.2007.07.035

Chen, S., Yao, H., Han, J., Liu, C., Song, J., Shi, L. jt. (2010). ITS2 piirkonna valideerimine uudse DNA vöötkoodina ravimtaimeliikide tuvastamiseks. PLoS ONE 5:e8613. DOI: 10.1371/journal.pone.0008613

Cheng, X., Su, X., Chen, X., Zhao, H., Bo, C., Xu, J. jt. (2014). Traditsioonilise hiina meditsiini preparaadi bioloogiline analüüs, mis põhineb suure läbilaskevõimega sekveneerimisel: Liuwei Dihuang Wani lugu. Sci. Rep. 4:5147. DOI: 10.1038/srep05147

Hiina farmakopöa komisjon. (2000). Hiina Rahvavabariigi farmakopöa. I osa. Peking: Hiina meditsiiniteaduste ajakirjandus.

Hiina farmakopöa komisjon. (2015). Hiina Rahvavabariigi farmakopöa. I osa. Peking: Hiina meditsiiniteaduste ajakirjandus.

de Boer, HJ, Ichim, MC ja Newmaster, SG (2015). Taimsete ravimite DNA vöötkodeerimine ja ravimiohutuse järelevalve. Narkootikumide Saf. 38, 611–620. DOI: 10,1007/s40264-015-0306-8

Dubey, B., Meganathan, PR ja Haque, I. (2011). DNA mini-vöötkood: lähenemisviis mõne ohustatud India mao liigi kohtuekspertiisi tuvastamiseks. Kohtuekspertiisi. Sci. Int. Genet. 5, 181–184. DOI: 10.1016/j.fsigen.2010.03.001

Edgar, RC (2004). LIHAS: mitme järjestuse joondamine suure täpsuse ja suure läbilaskevõimega. Nucleic Acids Res. 32, 1792–1797. DOI: 10.1093/var/gkh340

Fu, L. (1991). Hiina taimede punane raamat. I osa. Peking: Science Press, 502.

Gao, Z., Liu, Y., Wang, X., Song, J., Chen, S., Ragupathy, S. jt. (2017). DNA vöötkodeerimise tuletistehnoloogia (nukleotiidsignatuuri ja SNP topeltpiigi meetodid) tuvastab Hiina patendiga ravimites esinevad ained ja asendused. Sci. Rep. 7:5858. DOI: 10,1038/s 41598-017-05892-a

Gu, CM, Yang, XY ja Huang, LF (2016). Cistanches Herba: neurofarmakoloogia ülevaade. Esiosa. Pharmacol. 7:289. DOI: 10.3389/fphar.2016.00289

Hajibabaei, M., Smith, MA, Janzen, DH, Rodriguez, JJ, Whitfield,

JB ja Hebert, PDN (2006). Minimalistlik vöötkood suudab tuvastada isendi, mille DNA on lagunenud. Mol. Ecol. Märkused 6, 959–964. DOI: 10.1111/j.{6}}.2006.01470.x

Jaapani farmakopöa konventsioon. (2016). Jaapani farmakopöa, 17. väljaanne. Tokyo: Jaapani tervishoiu-, töö- ja heaoluministeerium, 1831–1832.

Jiang, Y. ja Tu, PF (2009). Cistanche liikide keemiliste koostisosade analüüs. J. Chromatogr. 1216, 1970–1979. DOI: 10.1016/j.chroma.2008.07.031

Keller, A., Schleicher, T., Schultz, J., Müller, T., Dandekar, T. ja Wolf, M. (2009). 5.8S-28S rRNA interaktsioon ja HMM-põhine ITS2 annotatsioon. Gene 430, 50–57. doi: 10.1016/j.gene.2008.10.012

Lei, L., Yang, F., Zhang, T., Tu, P., Wu, L. ja Ito, Y. (2001). Cistanches salsa (CA Mey.) G. Becki akteosiidi ja 2'-atsetüülakteosiidi ettevalmistav eraldamine ja puhastamine kiire vastuvoolukromatograafia abil. J. Chromatogr. A 912, 181–185. DOI: 10.1016/S0021-9673(01)00583-0

Li, Z., Lin, H., Gu, L., Gao, J. ja Tzeng, CM (2016). Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): üks traditsioonilise hiina meditsiini parimaid farmaatsia kingitusi. Esiosa. Pharmacol. 7:41. DOI: 10.3389/fphar.2016.00041

Liu, XM, Li, J., Jiang, Y., Zhao, MB ja Tu, PF (2013). Cistanche Sinensis (Orobanchaceae) keemilised koostisosad. Biochem. Syst. Ecol. 47, 21–24. DOI: 10.1016/j.bse.2012.09.003

Liu, Y., Wang, X., Wang, L., Chen, X., Pang, X. ja Han, J. (2016). Nukleotiidallkiri Ameerika ženšenni ja selle toodete tuvastamiseks. Esiosa. Plant Sci. 7:319. DOI: 10.3389/fpls.2016.00319

Lo, YT, Li, M. ja Shaw, PC (2015). Ženšenni keetmise koostises olevate ürtide tuvastamine DNA-markerite abil. Lõug. Med. 10:1. DOI: 10,1186/s 13020-015-0029-x

Meusnier, I., Singer, GA, Landry, JF, Hickey, DA, Hebert, PD ja Hajibabaei, M. (2008). Universaalne DNA mini-vöötkood bioloogilise mitmekesisuse analüüsiks. BMC Genomics 9:214. DOI: 10.1186/1471-2164-9-214

Newmaster, SG, Grguric, M., Shanmughanandhan, D., Ramalingam, S. ja Ragupathy, S. (2013). DNA vöötkoodi abil tuvastatakse Põhja-Ameerika taimsete toodete saastumine ja asendus. BMC. Med. 11:222. DOI: 10.1186/1741-7015-11-222

Raclariu, AC, Mocan, A., Popa, MO, Vlase, L., Ichim, MC, Crisan, G. jt. (2017). Veronica officinalis'e toote autentimine DNA metabarkodeerimise ja HPLC-MS abil paljastab Veronica chamaedrys'iga laialt levinud võltsimise. Esiosa. Pharmacol. 8:378. DOI: 10.3389/fphar.2017.00378

Shanmughanandhan, D., Ragupathy, S., Newmaster, SG, Mohanasundaram, S. ja Sathishkumar, R. (2016). Taimsete toodete autentimise ja võltsimise hindamine Indias kviitungiga DNA-põhise bioloogilise võrdlusmaterjali raamatukogu abil. Narkootikumide Saf. 39, 1211–1227. DOI: 10,1007/s40264-016- 0459-0

Sun, ZY, Song, JY, Yao, H. ja Han, JP (2012). Cistanches Herba ja selle lisaainete molekulaarne identifitseerimine nrITS2 järjestuse põhjal. J. Med. Plants Res. 6, 1041–1045. DOI: 10.5897/JMPR11.1115

Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M. ja Kumar, S. (2011). MEGA5: molekulaarevolutsiooniline geneetika analüüs, kasutades maksimaalse tõenäosuse, evolutsioonilise kauguse ja maksimaalse parsimoonia meetodeid. Mol. Biol. Evol. 28, 2731–2739. DOI: 10.1093/molbev/msr121

Wang, Q., Song, W., Qiao, X., Ji, S., Kuang, Y., Zhang, ZX jt. (2016b). Traditsioonilise hiina meditsiini valemi Gegen-Qinlian keetmise 50 bioaktiivse ühendi samaaegne kvantifitseerimine, kasutades ülikõrge jõudlusega vedelikkromatograafiat koos tandem-massispektromeetriaga. J. Chromatogr. 1454, 15–25. DOI: 10.1016/j.chroma.2016. 05.056

Wang, T., Zhang, XY ja Xie, WY (2012). Cistanche deserticola

YC Ma, "Kõrbe ženšenn": ülevaade. Olen. J. Chin. Med. 40, 1123–1141. DOI: 10.1142/S0192415X12500838

Wang, X., Liu, Y., Wang, L., Han, J. ja Chen, S. (2016a). Nukleotiidsignatuur Angelicae Sinensis Radix (Danggui) ja selle toodete tuvastamiseks. Sci. Rep. 6:34940. DOI: 10.1038/srep34940

Yao, CL, Yang, WZ, Wu, WY, Dai, J., Hou, JJ, Zhang, JX,

et al. (2015). Viie Panaxi notoginšenni saponiini samaaegne kvantifitseerimine mitme südant lõikava kahemõõtmelise vedelikkromatograafia abil: meetodi väljatöötamine ja rakendamine kaheksa notoginšenni sisaldava Hiina patenditud ravimi kvaliteedikontrollis. J. Chromatogr. 1402, 71–81. DOI: 10.1016/j.chroma.2015.05.015

Zhang, C. ja Su, J. (2014). Lähis-infrapuna spektroskoopia rakendamine traditsiooniliste Hiina ravimite analüüsiks ja kiireks kvaliteedihindamiseks. Acta. Pharm. Patt. B 4, 182–192. DOI: 10.1016/j.apsb.2014.04.001

Zhang, W., Qu, Z., Wang, Y., Yao, C., Bai, X., Bian, S. jt. (2015). Lähis-infrapuna peegeldusspektroskoopia (NIRS) ginsenosiidi Rg1 ja Re kiireks määramiseks Hiina patendimeditsiinis Naosaitong pill. Spectrochim. Acta. A Mol. Biomol. Spectrosc. 139, 184–188. DOI: 10.1016/j.saa.2014.11.111

Zou, P., Song, Y., Lei, W., Li, J., Tu, P. ja Jiang, Y. (2017). 1H NMR-põhise metaboloomika rakendamine erinevate osade eristamiseks ja Cistanche deserticola uue töötlemise töövoo väljatöötamiseks. Acta. Pharm. Patt. B 7, 647–656. DOI: 10.1016/j.apsb.2017.07.003

Huvide konflikti avaldus: autorid kinnitavad, et uuring viidi läbi ilma igasuguste äriliste või finantssuhete puudumisel, mida võiks tõlgendada potentsiaalse huvide konfliktina.

Autoriõigus © 2018 Wang, Xu, Chen, Song, Newmaster, Han, Zhang ja Chen. See on avatud juurdepääsuga artikkel, mida levitatakse Creative Commonsi omistamislitsentsi (CC BY) tingimuste alusel. Kasutamine, levitamine või reprodutseerimine muudes foorumites on lubatud, eeldusel, et on märgitud originaalautor(id) ja autoriõiguste omanik(id) ning tsiteeritakse käesolevas ajakirjas avaldatud originaalväljaannet vastavalt aktsepteeritud akadeemilisele tavale. Nendele tingimustele mittevastav kasutamine, levitamine ega reprodutseerimine ei ole lubatud.