2. OSA: Cistanche Deserticola polüsahhariid pärsib hiirtel OVX-indutseeritud luukadu ja RANKL-indutseeritud osteoklastogeneesi

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Osteoporoos on tõsine luuhaigus, mis mõjutab vananevat elanikkonda. Cistanche deserticola (CD), toonik ja meditsiiniline toit, mida Hiinas laialdaselt kasutatakse, on tõestatud, et see pakub osteoporoosi tõhusat ravi.Cistanche deserticola polüsahhariid(CDP), mis on ekstraheeritud CD-lt, omab erinevaid farmakoloogilisi omadusi, kuid selle roll osteoklastilises moodustumises ja funktsioonis, samuti osteoporoosis, jääb teadmata, Selle uuringu eesmärk oli CDP ekstraheerimine ja puhastamine.(Cistanche deserticola polüsahhariid)uurida täiendavalt selle võimalikku osteoporoosivastase toime mehhanismi. Tulemused näitasid, et CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid) ravi takistas OVX-i indutseeritud osteoporoosi ja leevendatud luukadu osteoklasti aktiivsuse ja funktsiooni represseerimise teel. Lisaks cdp(Cistanche deserticola polüsahhariid)ravi pärssis oluliselt RANKL-indutseeritud osteoklastogeneesi. luu resorptsioon ja osteoklasti spetsiifiline geeniekspressioon. Mehhanistlikult, CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)inhibeeritud RANKL-indutseeritud NF-xB ja MAPK signaaliradade aktiveerimine ja mõjutas seega allavoolu NEATc1 aktiveerimist. Selle uuringu tulemused näitavad, et CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)on potentsiaalselt ohutu ravim osteoporoosi raviks.

Osteoporoosi ravi: Cistanche Deserticola polüsahhariid

KLÕPSAKE SIIN, ET BARK PRAT 1

3. Tulemused

3.1. CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)hoiab ära OVX-indutseeritud luukao in vivo

Kasutasime CDP mõju uurimiseks OVX-indutseeritud osteoporoosi hiire mudelit(Cistanche deserticola polüsahhariid)osteoporoosi in vivo ravi. Võrreldes näilise rühmaga suurenes OVX-hiirte kehakaal märkimisväärselt, samas kui emaka indeks vähenes, mis näitab, et osteoporoosi mudel ehitati edukalt (joonised 1B ja D). OVX-rühma sääreluu mikro-CT analüüs näitas ulatuslikku luukadu. Võrreldes OVX-rühmaga suurenes CDP-L rühmas luutrabeculae arv, samas kui CDP-H ja E2 rühmade suurenemine oli olulisem ning trabeculae kahes viimases rühmas muutus jämedamaks ja lõhe muutus väiksemaks. Kvantitatiivne analüüs kinnitas, et mitmed luu histomorfomeetrilised parameetrid, sealhulgas BMD, BV/TV, BS/TV ja Tb. N, olid oluliselt suurendanud väärtusi, samas kui Tb. Sp näitas CDP-H rühmas (joonised 1E ja F) väärtuste vähenemist. Histopatoloogiline uuring H&E värvimise abil näitas, et luutrabeculae arv CDP-H ja E2 rühmades oli oluliselt suurem kui OVX-rühmas, samas kui CDP-L rühmas (joonis 1G) ei toimunud olulist paranemist. Lisaks näitas TRAcP värvimine, et osteoklastide arv suurenes märgatavalt OVX-rühmas, kuid vähenes CDP-H ja E2 rühmades (joonis 1H). CDP-L, CDP-H ja E2 rühmad näitasid, et OVX-indutseeritud P-sisalduse suurenemine pärssis, kuid suurendasid Ca sisaldust vereseerumis. Luude imendumise markerid RANKL ja TRAcP-5b näitasid CDP-L-i vähenemist.

3.2. CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid) pärsib RANKL-indutseeritud osteoklastogeneesi in vitro

Jälgisime rakkude vohamistCDP-töödeldud BMMM-id, kasutades pikaajalist reaalajas dünaamilist reaalajas dünaamilist live-rakkude pildistamise analüsaatorit. Kontrollgrupiga võrreldes on lahtrite kokkulangevusCDP-ravitud rühmad ei muutunud annuses<10 µg/ml,="" but="" was="" significantly="" reduced="" at="" the="" 20="" and="" 40="" µg/ml="" dosages="" (fig.="" 2a).="" to="" investigate="" the="" effect="" of="">CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)RANKL-indutseeritud osteoklastogeneesi korral stimuleeriti BMM-e RANKL-i ja M-CSF-igaCDP7 päeva. Osteoklastide iseloomulikku ensüümi TRAcP-d peetakse osteoklasti funktsiooni näitajaks (Minkin, 1982). TRAcP värvimine näitas, et osteoklastid raviti>1,25 μg/mlCDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)see on oluliselt vähenenud suurus ja arv. Need tulemused näitasid, et CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)pärssis tõhusalt eeldatavat RANKL-indutseeritud osteoklastogeneesi, mõjutamata rakkude elujõulisust.

3.3. CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)pärsib RANKL-indutseeritud osteoklastilist resorptsiooniaktiivsust ja osteoklastispetsiifilist geeniekspressiooni

Täpsustasime veelgi CDP mõju(Cistanche deserticola polüsahhariid)osteoklastide luu resorptsiooni aktiivsuse ravi hüdroksüapatiidiga kaetud plaatide abil. Luu resorptsioon on osteoklastide aktiivsuse ja võime mõõtmise peamine funktsioon ja standard (Novack & Faccio, 2011). Tulemused näitasid, et CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)võib annusest sõltuval viisil oluliselt vähendada osteoklastide luu-resorptiivset piirkonda, mis näitab, et CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)pärssis RANKL-i (joonised 3A ja B) poolt indutseeritud luu resorptsiooni aktiivsust. Eelkõige vähenes osteoklastiline luu-resorptiivne piirkond pärast ravi ligikaudu 6,3%ni pärast ravi 10 μg/ml CDP-ga.(Cistanche deserticola polüsahhariid). Cdp takistuste paremaks väljaselgitamiseks(Cistanche deserticola polüsahhariid)osteoklastogeneesi puhul mõõtsime osteoklastiga seotud geenide transkriptsiooni taset. Ilma CDP-ga ravita(Cistanche deserticola polüsahhariid), induktsioon RANKL-iga soodustas NFATc1, CTSK, Acp5, Atp6v0d2 ja Mmp9 geenide ekspressiooni. Vastupidi, CDP ja RANKL-i samaaegne rakendamine reguleeris neid viit geeni oluliselt.

3.4. CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)pärsib RANKL-indutseeritud NFATc1 aktiveerimist

TRAcP värvimine näitas, et CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)ravi vähendas oluliselt küpsete osteoklastide arvu eeldatavat suurenemist pärast RANKL-i stimuleerimist 3–7 päeva jooksul (joonised 4A ja B). Lisaks uurisime, kas CDP-ravi võib tõhusalt kahjustada osteoklastide diferentseerumist, pärssides NFATc1 ekspressiooni. Tulemused näitasid, et NFATc1 oli pärast RANKL-i stimulatsiooni 5 päeva jooksul väga väljendatud, mis oli pärast CDP-d oluliselt inhibeeritud.(Cistanche deserticola polüsahhariid)ravi (joonised 4C ja D). Lisaks pärssis CDP-ravi normaalse osteoklasti moodustumiseks ja funktsioneerimiseks vajaliku valgu CTSK ekspressioonitaset (Bossard et al., 1996) (joonis 4E ja F). Valisime RANKL-i stimulatsiooni ajahetkel esituse 5 päeva jooksul, et täiendavalt uurida 10 μg / ml CDP mõju(Cistanche deserticola polüsahhariid)NFATc1 translokatsiooni ravi. Nagu oodatud, CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)ravi pärssis oluliselt RANKL-indutseeritud NFATc1 tuumatranslokatsiooni.

3.5. CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid) pärsib RANKL-indutseeritud NF-κB ja MAPK signaaliradade aktiveerimist

Osteoklasti diferentseerumise CDP poolt indutseeritud inhibeerimisega seotud mehhanismide selgitamiseks uurisime CDP mõju(Cistanche deserticola polüsahhariid)ravi NF-κB ja MAPKs radadel. Tulemused näitasid, et CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)ravil oli pärssiv toime IκB-α lagunemisele ja p65 fosforüülimisele annusest sõltuval viisil. Kolme MAPK pereliikme fosforüülimine, täpsemalt rakuväline signaaliga reguleeritud kinaas (ERK), c-Jun N-termin kinaas (JNK) ja p38 olid ülesreguleeritud.

Cistanche Deserticola

4. Arutelu

Osteoporoos on levinud ja degeneratiivne luuhaigus. Praegu on osteoporoosi kliinilistes ravimeetodites, nagu östrogeen ja bisfosfonaat, palju keemilisi sünteesiravimeid. Kuid nende ravimite pikaajaline kasutamine nõrgendab järk-järgult kliinilist efektiivsust ja põhjustab isegi palju tõsiseid kõrvaltoimeid, sealhulgas munasarja-, rinna- ja endomeetriumivähi suurenenud riski ning lõualuu osteonekroosi (Beral, 2003; Khan jt, 2009; Lacey et al., 2002). Selles uuringus valisime CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid), efektiivne komponent, mis on ekstraheeritud CD-st kui terapeutilisest ainest ja mis näitas, et CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)oli kaitsev toime

luukadu OVX hiirtel ja inhibeeritud RANKL-indutseeritud osteoklasti moodustumine ja funktsioon. Samal ajal on traditsioonilise Hiina meditsiini teooria "neeru valitseva luu" kohaselt luukadu tingitud neerupuudusest. Neerusid tonifitseeriva meditsiinilise toiduna on tõestatud, et CD pakub osteoporoosi tõhusat ravi (Fan et al., 2019; Jiang, Wang, Li ja Zhang, 2016). Seega, CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)sellest looduslikust ürdist ekstraheeritud on parem ja ohutum ravimivalik.

Praegu on OVX hiire mudel klassikaline menopausijärgse luukao mudel naistel, uurides luukao põhjuseid ja viies läbi sekkumise (Wehrle et al., 2015). Sellest tulenevalt viisime läbi kahepoolse oophorectomy C57BL / 6J emastel hiirtel osteoporoosi mudeli ehitamiseks. Varasemates uuringutes olid loomadele antud CDP annused 50–200 mg/kg (väike annus) ja 1800 mg/kg (suur annus) (Guo et al., 2016; Zhang jt, 2018). Siin on CDP suur annus(Cistanche deserticola polüsahhariid)hiirtel oli 600 mg/kg, mis põhines 30 g CD suurel kliinilisel annusel keetmisel; Seega on see sarnane praeguse kliinilise praktikaga. Selles uuringus ravi CDP-ga(Cistanche deserticola polüsahhariid)oluliselt inhibeeritud OVX-indutseeritud kehakaalu tõus, mis on tavaline nähtus, mida täheldatakse OVX hiirtel (Davis et al., 2019). Kasutades mikro-CT skaneerimist ja 3D rekonstrueerimist, leidsime, et OVX tõi kaasa BMD, BV / TV, BS / TV ja Tb. N märgatava vähenemise ning Tb. Sp suurenemise, samas kui CDP-töötlemine muutis kõik need muutused vastupidiseks. Eelkõige võib CDP võrreldes positiivse ravimiga oluliselt parandada OVX hiirte BMD-d, mis on oluline luukvaliteedi marker ja mida kasutatakse osteoporoosi astme kajastamiseks (Fuggle et al., 2019), mis näitab, et CDP-l on BMD parandamisel positiivse ravimi ees eelis. Lisaks näitasid histoloogilised tulemused, et CDP-ravi võib vähendada OVX-i poolt indutseeritud TRAcP-positiivsete osteoklastide suurenenud kogust. Need tulemused näitavad, et CDP manustamine leevendas ovx-indutseeritud osteoporoosi luukadu tõhusalt, võib-olla osteoklasti moodustumise pärssimisega. Kooskõlas ülaltoodud tulemustega leidsime CDP annusest sõltuvalt inhibeeritud RANKL-indutseeritud osteoklastilise moodustumise ja funktsiooni, samas kui CDP-l oli vähe mõju M-CSF-indutseeritud osteoklasti lähterakkude levikule meie in vitro katsetes.

RANKLi ja RANK-i sidumine võib viia TRAF6 värbamiseni ja sellele järgnenud mitme järgneva signaaliraja aktiveerimiseni, nagu NF-κB ja MAPK (Boyle et al., 2003; Huang jt, 2006). NF-κB signalisatsioonirada mängib osteoklasti diferentseerumise reguleerimisel olulist rolli ning selle raja võtmevalkude kodeerivate geenide vaigistamine võib põhjustada ebanormaalset luu arengut (Leibbrandt & Penninger, 2008). On hästi teada, et NF-κB esineb stimuleerimata rakkude tsütoplasmas kompleksis, millel on IκB, kuid siseneb kiiresti tuuma pärast RANKL-i stimuleerimist (Boyle et al., 2003). Vabanenud IκB laguneb seejärel kiiresti, samas kui NF-κB aktiveerib spetsiifilise geeni transkriptsiooni, soodustades seega osteoklastide diferentseerimist, küpsemist ja apoptoosi (Abdelmagid et al., 2015). Selles uuringus näitasid tulemused, et CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)ravi pärssis RANKL-indutseeritud NF-κB signaalraja aktivatsiooni, mida näitab IκBα lagunemise pärssimine ja p65 fosforüülimine annusest sõltuval viisil, mis võib hõlmata selle osteoklastogeenset toimet. Lisaks on MAPK-ide signaalirada, sealhulgas ERK, JNK ja p38, tihedalt seotud RANKL-indutseeritud osteoklastogeneesiga (Li et al., 2002). Lisaks võivad p38 ja JNK domineerivad inhibiitorid vältida RANKL-indutseeritud osteoklastogeneesi (Chang et al., 2008; Kim et al., 2019), samas kui ERK mängib osteoklasti ellujäämisel olulist rolli (Miyazaki et al., 2000). On hästi teada, et RANKL aktiveerib MAPK-ide signaaliraja, suurendades ERK, JNK ja p38 fosforüülimist (Mizukami et al., 2002). Oma uuringus näitasime, et CDP pärssis MAPK-i signaalirajal peamiste valkude RANKL-indutseeritud fosforüleerimist. Kokkuvõttes näitavad need tulemused, et NF-κB ja MAPK signaaliradade aktiveerimise pärssimine aitab kaasa CDP inhibeerivale toimele osteoklastogeneesi vastu.

NF-κB ja MAPK signaaliradade aktiveerimine soodustab mitmete peamiste transkriptsioonifaktorite ekspressiooni, nagu rakuline onkogeenfne fos, aktivaatorvalk 1 ja NFATc1 (Huang et al., 2006; Wagner & Matsuo, 2003). NFATc1, NFAT perekonna oluline liige, on seotud terminaalse osteoklasti diferentseerumisega peamise transkriptsiooniregulaatorina (Asagiri et al., 2005). On teatatud, et NFATc1- puudulikud embrüonaalsed tüvirakud ei saa RANKL-i stimuleerimisel disferentseeruda osteoklastideks ja NFATc1 ektoopiline ekspressioon põhjustab lähterakkude diferentseerumist RANKL-i signaalidest mööda, mis viitab sellele, et NFATc1-l on osteoklastide diferentseerumisel kriitiline roll (Takayanagi et al., 2002). Meie uuringu tulemused näitasid CDP allasuruvat toimet(Cistanche deserticola polüsahhariid)NFATc1 ekspressioonil ja sellele järgneval valgul CTSK. Huvitav on see, et täheldasime, et NFATc1 valgu ekspressiooni tase tõusis ja seejärel vähenes, jõudes kõrgeimale tasemele 5. päeval pärast RANKL-i stimuleerimist. See oli kooskõlas Baek jt (2014) tulemustega, kes täheldasid M-CSF-i indutseeritud NFATc1 lagunemist hilises staadiumis osteoklastogeneesi ajal NFATc1 cbl-indutseeritud ubiquitinatsiooni kaudu Src kinaasist sõltuval viisil. Immunofluorestsentsanalüüsi tulemused toetasid järjekindlalt CDP inhibeerivat toimet(Cistanche deserticola polüsahhariid)NFATc1 transkriptsiooni aktiveerimisel. Lisaks on osteoklastispetsiifilised geenid, sealhulgas CTSK, Acp5, Mmp9 ja Atp6v0d2, kõik otseselt reguleeritud NFATc1-ga (Y. Kim et al., 2005), cdp poolt allasurutud. Need leiud näitavad, et NFATc1 on CDP inhibeeriva toime sihtmärk(Cistanche deserticola polüsahhariid)NF-κB ja MAPK signaaliradadel.

Cistanche deserticola polüsahhariid

5. Järeldus

Kokkuvõttes ekstraheerisime ja puhastasime cd-lt aktiivse polüsahhariidi ja näitasime, et CDP(Cistanche deserticola polüsahhariid)näitas kaitsvat toimet OVX-i indutseeritud osteoporoosile ja leevendatud luukadu osteoklasti aktiivsuse ja funktsiooni represseerimise teel. Lisaks cdp(Cistanche deserticola polüsahhariid)võib pärssida RANKL-indutseeritud osteoklasti diferentseerumist ja funktsiooni, häirides NF-κB ja MAPK signaaliradasid ning mõjutades seega allavoolu NFATc1 aktiveerimist. Kokkuvõtteks võib öelda, et meie leiud annavad aluse CDP laienemisele ja rakendamisele osteoporoosi ravis.

Viited

1. Abdelmagid, S. M., Sondag, G. R., Moussa, F. M., Belcher, J. Y., Yu, B., Stinnett, H., ... Safadi, F. F. (2015). Mutatsioon osteoaktiviinis soodustab NFkappaB ligandi retseptori aktivaatorit (RANKL)-vahendatud osteoklasti diferentseerumist ja ellujäämist, kuid pärsib osteoklasti funktsiooni. Bioloogilise keemia ajakiri, 290(33), 20128–20146. https://doi.org/10.1074/jbc.M114.624270.

2. Baek, J. M., Kim, J. Y., Cheon, Y. H., Park, S. H., Ahn, S. J., Yoon, K. H., ... Lee, M. S.(2014). Aconitum pseudolaeve var. erectum inhibeerib tuumafaktori kappa-B ligandi indutseeritud osteoklastogeneesi retseptori aktivaatori aktiveeritud T-rakkude c-Fos/tuumafaktori, tsütoplasma 1 signalisatsiooniraja kaudu ja hoiab ärapolüsahhariid-indutseeritud luukadu hiirtel. Molekulid, 19(8), 11628–11644. https://doi.org/ 10,3390/molekulid190811628.

3. Must, D. M., Bauer, D. C., Schwartz, A. V., Cummings, S. R., & Rosen, C. J. (2012). Jätkuv bisfosfonaadi raviOsteoporoosiKellele ja kui kauaks? New England Journal of Medicine, 366(22), 2051–2053. https://doi.org/10.1056/ NEJMp1202623.

4. De Martinis, M., Di Benedetto, M. C., Mengoli, L. P., & Ginaldi, L. (2006). SeniilneOsteoporoosiKas see on immuunvahendatud haigus? Põletikuuuringud, 55(10),399–404. https://doi.org/10.1007/s00011-006-6034-x.

5. Fuggle, N. R., Curtis, E. M., Ward, K. A., Harvey, N. C., Dennison, E. M., & Cooper, C.(2019). Luumurru ennustamine, pildistamine ja sõelumineOsteoporoosi. Loodusarvustused Endokrinoloogia, 15(9), lk 535–547. https://doi.org/10.1038/s41574-019-0220-8.

6. Hu, Y., Huang, J., Li, Y., Jiang, L., Ouyang, Y., Li, Y., ... Zeng, Q. (2020).Cistanche deserticola polüsahhariidindutseerib melanogeneesi melanotsüütides ja vähendab oksüdatiivset stressi NRF2/HO-1 raja aktiveerimise kaudu. Raku- ja molekulaarmeditsiini ajakiri, 24(7), 4023–4035. https://doi.org/10.1111/jcmm.15038.

7. Huang, H., Ryu, J., Ha, J., Chang, E. J., Kim, H. J., Kim, H. M., ... Kim, H. H. (2006). Osteoklastide diferentseerumine nõuab TAK1 ja MKK6 NFATc1 induktsioon ja NF- kappaB transaktiveerimine RANKL-i poolt. Raku surm ja diferentseerumine, 13(11), 1879–1891.

8. Liu, Y., Wang, C., Wang, G., Sun, Y., Deng, Z., Chen, L., ... Xu, J. (2019). Loureirin B pärsib RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesi ja ovariektomeeriseeritutOsteoporoosiNFATc1 ja ROS tegevuste nõrgendamise kaudu. Theranostics, 9(16), lk 4648–4662. https://doi. org/10.7150/thno.35414.

9. Rachner, T. D., Khosla, S., & Hofbauer, L. C. (2011).OsteoporoosiNüüd ja tulevikus. Lancet, 377(9773), lk 1276–1287. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(10)62349-5.

10. Strom, O., Borgstrom, F., Kanis, J. A., Compston, J., Cooper, C., McCloskey, E. V., & Jonsson, B. (2011).Osteoporoosi: Koormus, tervishoiuteenuste osutamine ja võimalused ELis: aruanne, mis on koostatud koostöös rahvusvaheliseOsteoporoosiSihtasutus (IOF) ja Euroopa Farmaatsiatööstuse Liitude Föderatsioon (EFPIA). ArhiividOsteoporoosi, 6, 59–155. https://doi.org/10.1007/ s11657-011-0060-1.

11. A-d identifitseerimine ja iseloomustaminepolüsahhariidMorinda officinalis'e juurtest kui luu moodustumise indutseerija sihtgeeni ekspressiooni up-reguleerimise teel. Rahvusvaheline bioloogiliste makromolekulide ajakiri, 133, 446–456.

12. Zhang, A., Yang, X., Li, Q., Yang, Y., Zhao, G., Wang, B., & Wu, D. (2018). Vee ekstraheeritava vee immunostimuleeriv aktiivsuspolüsahhariididCistanche deserticolast kui taime adjuvant in vitro ja in vivo. PLoS One, artikli 13 lõige 1, artikkel e0191356. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0191356.

13. Zhang, K., Ma, X., Ta, W., Li, H., Han, S., Jiang, Y., ... Tu, P. (2014). Tsistanche deserticola ekstraktid võivad antagoniseerida immunosenestsentsi ja pikendada eluiga vananemise kiirendatud hiirel, kes kalduvad 8 (SAM-P8) hiirele. Tõenduspõhine täiendav ja alternatiivne meditsiin, 2014. aasta lõige 2, artikkel 601383. https://doi.org/10.1155/2014/601383.

14. Zhang, S., Zhang, Q., Zhang, D., Wang, C., & Yan, C. (2018).Osteoporoosivastane aRomaani "Achyranthes Biden tata" kliipsuspolüsahhariidstimuleerides luude moodustumist. Süsivesikute polümeerid, 184, 288–298. https://doi.org/10.1016/j.

15. Zheng, H., Tema, B., Wu, T., Cai, J., & Wei, J. (2020). Ekstraheerimine, puhastamine ja osteoporootiline aktiivsuspolüsahhariidEpimedium Maximilt. in vitro. Rahvusvaheline bioloogiliste makromolekulide ajakiri, 156, 1135–1145. https://doi. org/10.1016/j.ijbiomac.2019.11.145.

Cistanche deserticola toidulisandid