1. osa RNA-Seq 1. OSA De Novo transkriptoomi koostamisel ja Cistanche Deserticola lihava tüve geenide avastamisel

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com

Abstraktne

Taustad

Cistanche deserticolaon täiesti mittefotosünteetiline parasiitaim, millel on suur raviväärtus ja mis on levinud peamiselt Loode-Hiina kõrbes. Selle kuivatatud lihakas vars on traditsioonilises hiina meditsiinis ülioluline toonik, mille roll on peamiselt meeste seksuaalfunktsiooni parandamine ja immuunsuse tugevdamine, kuid osaliselt on genoomiliste ja transkriptoomiliste ressursside puudumise tõttu läbi viidud vähe mehhaanilisi uuringuid.

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

Tulemused

Selles uuringus teostasime sügava transkriptoomilise sekveneerimise lihakas varresC. deserticola, ja umbes 80 miljonit lugemist genereeriti, kasutades HiSeq2000 platvormil Illumina paariotsa järjestust. Trinity assembleri abil saime 95 787 transkripti järjestust transkripti pikkusega 200 kuni 15 698 aluspaari, mille keskmine pikkus oli 950 alust ja N50 pikkus 1519 alust. 63 957 transkripti tuvastati aktiivselt ekspresseeritud FPKM-iga, mis on väiksem või võrdne 0,5, milles 30 098 transkripti märgiti geenikirjelduste või geeniontoloogia terminitega järjestuste sarnasuse analüüside abil mitme avaliku andmebaasi (Uniprot, NR ja Nt NCBI-s ja KEGG) põhjal. Lisaks tuvastasime peamised ensüümi geenid, mis osalevad ligniini ja fenüületanoidglükosiidide (PhG) biosünteesis, mis on teadaolevalt peamised toimeained. Järjestuste võrdluse ja fülogeneetilise analüüsi põhjal tuvastati neli fenüülalaniini ammoniaaklüaasi (PAL) geeni, mis on esimene võtmeensüüm ligniini ja PhG biosünteesis. Esimest korda pakuti välja ka kaks PhG-de biosünteesi rada.

Järeldused

Kokkuvõttes lõpetasime globaalse analüüsiC. deserticolalihava varre transkriptoom, kasutades RNA-seq tehnoloogiat. Kokkupandud ja annoteeritud transkriptidest tuvastati ligniini ja fenüületanoidglükosiidide biosünteesiga seotud ensüümgeenide kogu ning ennustati ka PAL-i geeniperekonda. Selle uuringu järjestusandmed pakuvad väärtuslikku ressurssi tulevaste fenüületanoidglükosiidide biosünteesi uuringute ja funktsionaalsete genoomiliste uuringute läbiviimiseks selles olulises ravimtaimes.

Sissejuhatus

C. deserticolaon ülemaailmne mitmeaastaste kõrbetaimede perekond Orobanchaceae perekonnast ja on täiesti mittefotosünteetiline liik ja tavaliselt kasvab maa-aluseid holoparasiitseid taimi [1]. See parasiteerub psammofüüdi Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae) [1, 2] juurtel, mis asustab peamiselt kõrbeid ja poolkõrbeid, kuna talub põuda ja soolsust [1, 3].C. deserticolanäitab tugevat vastupidavust karmidele keskkonnatingimustele ja on levinud peamiselt Loode-Hiinas [4–6], eriti Sise-Mongoolias, Gansus ja Xinjiangis. Seda peetakse viimastel aastatel inimeste suurenenud tarbimise tõttu ohustatud looduslikuks liigiks [5, 6]. C. deserticola, mida sageli nimetatakse kõrbe ženšenniks, on üldtuntud kui kõrbehari ning kuivatatud lihakat vart on Hiinas ja Jaapanis juba aastaid laialdaselt kasutatud traditsiooniliselt olulise toonikuna [4, 7–10]. See salvestati algselt väljaandes Shen Nong Ben Cao Jing (Hiina Materia Medica sõnaraamat, 1977) [11] umbes 1800 aastat tagasi ja seda peeti Hiina ravimtaime Cistanche üheks peamiseks allikaks.

VäljavõttedC. deserticolaomavad laia valikut meditsiinilisi funktsioone, eriti kasutamiseks seksuaalfunktsiooni parandamisel, neerude toniseerimisel, maksa kaitsmisel, aperientse aktiivsuse parandamisel, mälu parandamisel, immunomoduleerival, antioksüdatiivsel, põletikuvastasel, viirusevastasel toimel jne [7–10, 12– 15]. C. deserticola peamised bioaktiivsed komponendid on fenüületanoidglükosiidid (PheG-d, PhG-d) [2, 9, 10, 14, 15]. Praeguseks on mahlakust varrest eraldatud üle 20 fenüületanoidglükosiidi.C.deserticola[9, 14, 16]. Nende hulgas on akteosiid ja ehhinakosiid kaks peamist komponenti, millel on märkimisväärne farmakoloogiline toime [2, 16] ja mis on dokumenteeritud kvaliteedistandarditena.C. deserticolaHiina farmakopöas (2005. ja 2010. aasta väljaanded). PhG-de kolm keemilist komponenti on orgaaniline hape, sahhariid ja fenüületanoid, kuid üksikasjad fenüületanoidi biosünteesi radade kohta on endiselt halvasti mõistetavad.C.deserticola.

Vaatamata kaubanduslikule ja meditsiinilisele tähtsuseleC.deserticola, on selle liigi genoomilised ja transkriptoomilised andmed väga piiratud. NCBI andmebaasis ei ole EST-e saadaval ja selle liigi täielik genoomiteave jääb kättesaamatuks, välja arvatud kloroplasti genoomi järjestus [1]. Piiratud transkriptoomilised andmed takistavad PhG biosünteesimehhanismide uurimist. RNA-seq tehnoloogia abil saab genereerida sihitud genoomi ekspresseeritud osade järjestusi [17] ja tuvastada geene [18], kasutades NGS tehnoloogiaplatvorme (nagu Applied Biosystems SOLiD, Illumina HiSeq ja Roche 454). See on muutumas üha populaarsemaks transkriptsioonide de novo kokkupanekus [19–22], kuna see on kulutõhus ja võimas lähenemisviis kõrge eraldusvõime ja laia dünaamilise ulatusega [23–25], eriti kuna selle eeliseks on madala arvukusega transkriptide uurimine. [26]. Erinevate eeliste tõttu on RNA-seq eriti atraktiivne piiratud geneetiliste ressurssidega mittemudelorganismide jaoks [27–29]. Kuid C. deserticola transkriptoomi RNA-seq.

Selles uuringus sekveneerisime ülemaailmselt C. deserticola tüve transkriptoomi, kasutades Illumina Hiseq2000 platvormi ja saime 7,9 G algandmeid. Koostamise ja annotatsiooni abil kaevandasime PhG biosünteesis osalevad geenid ja kogu ligniini biosünteesi eest vastutavad geenid.

Meie RNA-seq analüüs genereeris esimeseC. deserticolakonsensuse transkriptsioon ja andis uusi teadmisi selle meditsiinilise väärtuse terviklikust mõistmisestC. deserticola.Lisaks saab siin kirjeldatud meetodit laialdaselt rakendada profiili transkriptoomide jaoks, et hõlbustada spetsiifiliste ravimite komponentide biosünteesi radades osalevate geenide avastamist teises väga piiratud genoomsete ressurssidega ravimtaimes.

Cistancheon palju funktsioone

Materjalid ja meetodid

Taimse materjali kogumine

Värske mahlane varsC. deserticolakaevamisetapis koguti Sise-Mongoolias, Loode-Hiinas asuvast Alexa League BayanHot City tehasest. Kogumisluba saadi tehasebaasi omanikult (HongKui CongRong Group). Vautšeri näidis deponeeriti Hiina Teaduste Akadeemia Pekingi Genoomika Instituudi genoomikasutusse. Pärast puhastamist lõigati mahlakad varrekoed väikesteks tükkideks ja külmutati kohe vedelas lämmastikus ning säilitati seejärel -80 kraadi juures kuni edasise töötlemiseni.

RNA ekstraheerimine, cDNA raamatukogu ehitamine ja Illumina sekveneerimine

Kogu RNA ekstraheeriti mahlakust varrest, kasutades TRIzol Reagenti (Invitrogen Inc., California, USA) vastavalt tootja juhistele. Saadud proove töödeldi genoomse DNA eemaldamiseks DNaas I-ga. Ekstraheeritud RNA-de kvantifitseerimiseks kasutati bioanalüsaatorit Agilent 2100 (Agilent Technologies) ja nende terviklikkust kontrolliti denatureeriva agaroosgeelelektroforeesi ja etiidiumbromiidiga värvimisega. Järgnevates analüüsides kasutati RNA proove, mille A260/A280 suhe oli vahemikus 1,9 kuni 2,1, RNA 28S:18S suhe oli suurem kui 1,0 ja RNA terviklikkuse arv (RIN) oli väiksem või võrdne 8,5.

RNA-seq raamatukogud loodi Illumina Truseq RNA proovide ettevalmistamise komplektide abil. Polü(A) pluss RNA eraldati kogu RNA-st, kasutades Dynal oligo(dT)25 helmeid vastavalt tootja juhistele. Pärast puhastamist lisati fragmentatsioonipuhver, et purustada mRNA lühikesteks fragmentideks. Esimese ahela cDNA sünteesimiseks kasutati neid lühikesi fragmente mallidena koos SuperScript III pöördtranskriptaasi ja N6 juhusliku heksameeri praimeriga. Seejärel sünteesiti teise ahela cDNA, kasutades puhvrit, dNTP-sid, RNaasH ja DNA polümeraas I. Saadud kaheahelalise cDNA ots parandati, kasutades T4 DNA polümeraasi, DNA polümeraas I Klenowi fragmenti ja T4 polünukleotiidkinaasi ning ligeeriti adapterid, kasutades T4 DNA ligaasi. Adapteriga ligeeritud fragmendid puhastati Quick PCR ekstraheerimiskomplekti abil ja elueeriti EB puhvriga. Pärast agaroosgeelelektroforeesiga analüüsi valiti sobivad fragmendid PCR amplifikatsiooni matriitsiks. Saadud cDNA raamatukogu sekveneerimine viidi läbi Illumina HiSeq 2000 süsteemiga.

Transkriptide de novo kokkupanek ja geeniekspressiooni kvantifitseerimine

Sekveneerimisel genereeritud töötlemata lugemised puhastati adapterjärjestuste (ATCTCGTATGCCGTC) eemaldamisega, kasutades ettevõttesisest meetodit. Seejärel viisime läbi range madala kvaliteediga filtreerimisprotsessi. Esiteks kärbitakse aluseid, mille Phredi kvaliteediskoor on alla 20, järjestuse 3' otsast kuni ühe kõrgema kvaliteediga aluseni (vähem kui 20 või sellega võrdne). Kui lugemise pikkus on lühem kui 50 bp, jäetakse see kõrvale. Teiseks filtreeritakse lugemisi veelgi kriteeriumi alusel, et 70 protsendil ühe lugemise alustest on kõrge kvaliteediskoor (vähem kui 20). Kolmandaks kasutati edasiseks kokkupanekuks ainult paarisotsa lugemisi. De novo transkriptsiooni kokkupanek viidi läbi kasutades Trinity versiooni{10}} [30], mis koosnes kolmest järjestikusest tarkvaramoodulist: Inchworm, Chrysalis ja Butterfly. Koosteparameetrid määrati järgmiselt:—seqType fq—JM 300G —min_contig_length 200—CPU 20—inchworm_cpu 20—bflyCPU 20.

Transkriptsioonide arvukuse kvantifitseerimiseks joondati järjestatud paarilõpu lugemised uuesti kokkupandud transkriptidega, kasutades skripti rakenduses Trinity [31]. Kaardistatud lugemisi kasutati kvantifitseerimiseks RSEM-i (RNA-Seq by Expectation Maximization) tarkvaraga [32]. Geeni või isovormi arvukust väljendati fragmendina transkripti kilobaasi kohta miljoni kaardistatud fragmendi (FPKM) väärtusega, need transkriptid, mille FPKM väärtus on võrdne või suurem kui 0,05, määrati ekspresseerituks.

Ekspresseeritud ärakirjade funktsionaalne annotatsioon

Sest C. deserticola geeniannotatsioonikomplekte pole, välja arvatud kloroplasti genoom [1]. Annoteerisime väljendatud ärakirjad, võrreldes Genbank Nt, Genbank Nr ja TAIR10_ pep_20101214_uuendatud andmekogumitega eraldi, kasutades programmi BLAST (E< =="" 1e-20).="" meanwhile,="" all="" expressed="" transcripts="" were="" translated="" into="" potential="" proteins="" according="" to="" orf="" prediction="" by="" transdecoder="" [30]="" and="" predicated="" for="" the="" conserved="" domains="" based="" on="" the="" pfam="" database="">

toimeaine akteosiidcistanche

Geeni ontoloogia ja KEGG raja annotatsioon

Järjestuste sarnasuse joondamise teel Uniproti andmebaasiga (//www.uniprot.org/) saadi kõigi kokkupandud transkriptide geeniontoloogia (GO) annotatsioon, kasutades seostusfaili, mis laaditi alla aadressilt (ftp://ftp.ebi.ac. uk/pub/databases/GO/goa/UNIPROT/gene{0}}assotsiatsioon. goa_uniprot.gz). Ekspresseeritud geenide GO-terminite rühmitamine viidi läbi kohandatud skriptide abil ja me märkisime geenid neljandal tasemel CC, BP ​​ja MF kategooriate jaoks eraldi.

KEGG rajateave määrati kõigi ennustatud valkude järjestuste jaoks, kasutades veebitööriista KAAS (KEGG automaatne annotatsiooniserver) [34]. Fasta-vormingus järjestused esitati KAAS-i päringule ja tulemuseks olevad failid kõigi C. deseticola tüve transkriptoomiga seotud radade kohta laaditi alla. Annoteerimiseks kasutati BBH (bi-directional best hit) meetodit kasutades 13 taimeorganismi geeniandmekogumit KEGG-s.

RT-qPCR analüüs

Pärast DNaas I-ga lõhustamist konverteeriti ligikaudu 5 ug kogu RNA-st esimese ahela cDNA-ks pöördtranskriptsioonireaktsiooni kaudu oligo(dT)15 praimeritega ja NoScript pöördtranskriptsioonisüsteemiga (Promega). Seejärel lahjendati cDNA produktid 10-kordselt nukleaasivaba deioniseeritud veega enne kasutamist reaalajas PCR-is matriitsina. Spetsiifilisi cDNA-sid amplifitseeriti GoTaq 2-Step RT-qPCR süsteemiga (Promega) mahus 20 ul. PCR amplifikatsioon viidi läbi anniilimistemperatuuril 60 kraadi 7500 reaalajalise PCR tuvastamissüsteemiga (Applied Biosystems) vastavalt tootja juhistele. Suhteline transkriptsioonide arvukus arvutati tsükli läve võrdleva meetodi abil, kasutades sisestandardina geeni "comp10579_c0", kasutades tarkvara 7500 Manager.

RT-PCR jaoks mõeldud praimerite paarid loodi võrgutarkvara (http://primer3.ut.ee/) põhjal ja on loetletud S1 andmestikus.

Tulemused

C. deserticola lihava varre RNA sekveneerimine ja de novo transkriptoomi kokkupanek

C. deserticola vart on Hiinas ja Jaapanis traditsiooniliselt olulise toonikuna laialdaselt kasutatud juba aastaid. Et saada globaalset ülevaadet geeniekspressioonist C. deserticola lihakas varres, kogusime 2013. ja 2014. aastal sama taimebaasi C. deserticola tüveproove. Kogu RNA-d ekstraheeriti ja polüA pluss RNA-d puhastati paarisotsa RNA-seq raamatukogude konstrueerimiseks. Illumina HiSeq 2000 järjestuse abil saadi 79 433 734 ja 86 019 176 paarilõpu lugemist, mis vastavad peaaegu 8 miljardile ja 8,6 miljardile järjestuse alusele

platvorm 2013-aasta ja 2014-aasta proovides (tabel 1). Pärast adapterjärjestuste eemaldamist ja madala kvaliteediga lugemiste filtreerimist (vt üksikasju jaotises Meetodid) kasutati de novo transkriptoomi kokkupanekuks 2013-aasta proovis 64 831 040 kvaliteetset paarilõpu lugemist. Kasutades Trinity järjestuse komplekteerijat [30], genereeriti 51 719 geeni ja 95 787 transkriptsioonijärjestust transkripti pikkusega 200 aluspaari kuni 15 698 aluspaari. Kokkupandud ärakirjade keskmine pikkus on 950 alust ja N50 pikkus 1519 alust. Erineva pikkusega transkriptide arv näitas, et 57,32 protsenti kokkupandud ärakirjast oli umbes 500- aluspaari või pikemad (joonis 1A). Kvaliteetsed paarilõpu lugemised 2014-aasta proovis kaardistati kokkupandud transkriptoomiga. Lisaks avastasime, et iga kokkupandud geeni transkriptsioonide arv varieerus ja 69 protsenti geenidest ekspresseeris ühte isovormi, samas kui 31 protsenti geenidest ekspresseeris kahte või enamat transkripti (joonis 1B).

Kokkupandud ärakirjade ekspressiooni kvantifitseerimine ja funktsionaalne annotatsioon

Geeni või transkripti arvukus kvantifitseeriti RSEM-paketi abil, milles järjestatud lugemised joondati Bowtie abil kokkupandud geenide või transkriptide järjestustega ja neid kaardistatud lugemisi kasutati kvantifitseerimiseks. Arvutati iga geeni või transkripti FPKM väärtus ja lõpuks tuvastasime 63 957 ja 52 857 aktiivselt ekspresseeritud transkripti (FPKM väärtus Väiksem või võrdne 0,5) C. deserticola lihakates varreproovides 2{{17} }13 ja 2014 vastavalt. Tavaliselt väljendati kahes korduses 44 776 ärakirja (70,01 protsenti 2013-aasta valimis, 84,71 protsenti 2014-aasta valimis) ja nende ekspressiooniandmete korrelatsioon (Pearson korrelatsioonikordaja: 0,91979) oli näidatud S1 joonisel. Järjestuse algandmed laaditi üles NCBI SRA andmebaasi (juurdepääsunumbrid: SRX857402 ja SRX858938). Edasiseks analüüsiks kasutasime 2013-aasta proovis tuvastatud ekspresseeritud geene. Funktsionaalne annotatsiooniteave kõigi väljendatud ärakirjade jaoks saadi kahe meetodi abil. Esiteks joondati kõik ekspresseeritud transkriptid BLAST-algoritmi abil eraldi teadaolevate nukleotiidide (GenBank mitte) ja peptiidijärjestuse andmebaasidega (GenBank nr ja Arabidopsis peptiid). 63 957 väljendatud ärakirjast

29 220 (45,7 protsenti) olid annoteeritud ja näitasid homoloogiat järjestustega mis tahes kolmest subjekti andmebaasist E-väärtuse piirväärtusega 1e-20. Vahepeal ennustati TransDecoder tarkvara abil kõigi ekspresseeritud transkriptsioonijärjestuste kodeerivaid kandidaatpiirkondi ja Pfam domeeni otsimiseks kasutati iga transkripti pikimaid ORF-e. Selle tulemusena märgiti Pfami andmebaasi põhjal 21 358 (33,4 protsenti) ärakirja. Kokku sobitati 30 098 (47,1 protsenti) ärakirja avalikes andmebaasides olevate teadaolevate geenidega, kombineerides kahte ülaltoodud meetodit. Täielik väljendatud ärakirjade loend koos funktsiooni annotatsiooniga näidati lisaandmetes (S2 andmestik).

Uurisime 20 kõige kõrgema ekspressiooniga transkripti (tabel 2), mis vastab 18,99 protsendile kõigist järjestuslugemistest, ja leidsime, et enamik neist on abiootilisele reaktsioonile reageerivad geenid.

stressi stiimulid. Dehüdriin (DHN), hüdrofiilsete ja termostabiilsete stressivalkude klass, millel on suur arv laetud aminohappeid ja mis kuuluvad II rühma hilise embrüogeneesi rikkalikku (LEA) perekonda, on kõige kõrgema ekspressiooniga geen. Kolm erinevat Dehyrini transkripti (komp{0}}c0_seq1/2/4) tuvastati lihakas varres tugevalt ekspresseerituna, mis võivad olla seotud rakkude kaitsmisega põuastressi põhjustatud kahjustuste eest. Samuti leiti, et teised stressiga seotud geenid, nagu kuumašoki valk, patogeeniga seotud valk ja metallotioneiin, olid tugevalt ekspresseeritud, mis võib olla seotud selle raske ellujäämiskeskkonnaga. Lisaks on mõned konstitutiivsed geenid, sealhulgas 26S ribosomaalse RNA geen (komp22329_c2_seq1), auksiiniga represseeritud/seotud valk (comp20999_c0_seq1), ADP-ribosüülimisfaktor (comp20499_ c0_seq1) oli samuti tugevalt transkribeeritud.

Kõigi ekspresseeritud transkriptide funktsionaalne klassifikatsioon geeniontoloogia ja KEGG andmebaaside põhjal

Gene Ontology (GO) annotatsioon saadi Uniproti annotatsiooni ja identiteedi assotsiatsiooni failist. Kokku määrati 1745 funktsionaalsele terminile 20 907 transkripti, mis moodustasid 32, 69 protsenti kõigist ekspresseeritud järjestustest. Funktsionaalsetest GO-terminitest moodustasid suurema osa määramised bioloogilisele protsessile (1116, 63,95 protsenti), millele järgnesid rakuline komponent (329, 18,85 protsenti) ja molekulaarne funktsioon (300, 17,20 protsenti). Ekspresseeritud transkriptide määratud funktsioonid hõlmasid laia valikut GO kategooriaid ja tabelis 3 on loetletud 10 kõige enam kommenteeritud transkriptsiooniga GO terminit. Ja me pakume kõigi väljendatud transkriptide jaotust kolmes geeniontoloogia kategoorias (molekulaarfunktsioon, rakukomponent, ja bioloogiline protsess) lisafailis (S3 Dataset). Seondumisfunktsioonide ja transferaasi aktiivsusega seotud GO terminid olid valdavalt esindatud molekulaarse funktsiooni kategoorias. Seondumisfunktsioonide osas oli kõige rohkem katioonide sidumine (4394 transkripti), millele järgnesid nukleotiidide/nukleosiidide seondumine (keskmiselt 3404 transkripti) ja valkudega seondumine (2422 transkripti). Transferaasi aktiivsuse rühmas on enim neid, kellel on ülekantavad fosforit sisaldavad rühmad (2256 transkripti, 65,77 protsenti). Rakuliste komponentide kategoorias paiknesid transkriptid rohkem intratsellulaarses (keskmiselt 10 581 transkripti), samas kui bioloogiliste protsesside kategoorias osalesid transkriptid rohkem biopolümeeri metaboolses protsessis (keskmiselt 6683 transkripti), millele järgnes rakulise protsessi reguleerimine (4 841). transkriptsioonid), geeniekspressioon (4678 transkripti) ja transport (3512 transkripti).

Ligniini ja PhG biosünteesis osalevate geenide kaevandamiseks otsiti KEGG andmebaasis 21 358 mitteliigset potentsiaalset valgujärjestust 13 taimeorganismi geenijärjestuste vastu ning need määrati 275 KEGG rajale vähemalt 5 tabamusega. Tabelis 4 on loetletud 10 kõige enam joondatud järjestustega rada. Enamik radu olid seotud primaarsete metaboolsete protsessidega, nagu aminohapete või valkude metabolism (ko01230, ko04141 ja ko04120), süsivesikute metabolism (ko01200 ja ko00500) ja nukleotiidid või nukleosiidide metabolism (ko03018, ko00230 ja ko00240). Lisaks on olemas 27 sekundaarset metabolismiga seotud rada (joonis 2), nagu terpenoidi selgroo biosüntees, fenüülpropanoidi biosüntees, karotenoidide biosüntees, isokinoliini alkaloidide biosüntees ning tropaani, piperidiini ja püridiini alkaloidide biosüntees. Need tulemused näitavad täiendavalt, et C. deserticola tüvekoes toimusid aktiivsed metaboolsed protsessid. Kõik KEGG radadega seotud ekspresseeritud transkriptid olid loetletud täiendavas failis (S4 Dataset). Kuigi C. deserticola ja teiste taimede, näiteks riisi [35] (S5 andmestik) vahel on mõned oluliselt muutunud teed, on meie selle uuringu peamine eesmärk paljastada kogu C. deserticola varre transkriptsiooniprofiil ja kujutada seotud PhG-de biosünteesi radadega, mis võivad olla kasulikud kasvatamise juhtimiseks.

Kandidaatgeenid, mis kodeerivad ligniini biosünteesis osalevaid ensüüme

Ligniin on taimeriigis suuruselt teine ​​looduslik maapealne polümeer, mis moodustab kuni ühe kolmandiku taime rakuseintes leiduvast materjalist [36, 37]. Rakuseinte olulise komponendina aitavad ligniinid veetransporti, pakuvad mehaanilist tuge ja struktuurset terviklikkust ning kaitsevad patogeenide ja taimtoiduliste eest [38–40]. Need ligniini rollid on maa-aluse erektsiooni kasvu toetamiseks palju väärtuslikudC. deserticolakõrbes. Selles uuringus esitasime täieliku pildi ligniini biosünteesi radadestC. deserticola(joonis 3), kus ligniini monomeerid biosünteesitakse fenüülalaniinist läbi ensümaatiliste reaktsioonide, sealhulgas hüdroksüülimise, metüülimise, redutseerimise ja oksüdatiivse polümerisatsiooni protsessi. Ligniini biosünteesiga seotud ensüümid tuvastati kolme peamiselt sünteesitud vormi puhul veresoontes

kude (p-hüdroksüül-fenüül (H), guajaatsüül (G) ja syringüül (S) ligniin) ja 5-hüdroksüül-guajaatsüülligniin, mis tuvastati ainult COMT-s (kofeiinhappe 3-O-metüültransferaas, EC 2.1.1.68) puudulikkusega (näiteks knock-down) taimed [41, 42].

Fenüülalaniini ammoniaaklüaas (PAL, EC 4.3.1.24) on esimene võtmeensüüm ligniini biosünteesi rajas (joonis 3), mis muudab fenüülalaniini mitteoksüdatiivse deamineerimise teel kaneelhappeks [43, 44]. Kokku sekveneeriti 6297 PAL-i lugemist ja kokku pandi 7 PAL-i transkripti.C. deserticola(Tabel 5). Järjestuste sarnasuste võrdlemisel leidsime, et neljal neist (comp28550_c1_seq1/2/3/5) oli rohkem kui 95 protsenti sarnasus teadaoleva C. deserticola (gi|) mRNA järjestusega. 289595227|gb|ADD12041.1|), samas kui comp28550_}c1_seq4 ja comp25940_c0_seq1 sarnasused olid vastavalt 77% ja 82%. ORF-i ennustus näitas, et 5 transkriptil oli potentsiaali kodeerida valke ja need olid kantud aromaatse aminohappe lüaasi domeeniga (PF00221.14). Nende hulgas võib ainult comp28550_c1_seq4 transkript kodeerida 718 aminohappejäägist koosnevat täielikku valgujärjestust. On teatatud, et enamikus taimeliikides kodeeris PAL-i väike mitmegeeniline perekond, näiteks 4 Arabidopsis thaliana [39, 45], 5 Populus trichocarpa [46, 47], 3 Scutellaria baicalensis [48] ja 7. Cucumis sativus [43, 49] jne. Meie fülogeneetiline analüüs näitas, et C.deserticola-s oli 4 PAL-i kodeerivat geeni ja me nimetasime need vastavalt CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 ja CdPAL4 (S2 joonis fig.). 4-kumaraat-CoA ligaas (4CL, EC 6.2.1.12) ja trans-tsinnamaat 4-monooksügenaas (CYP73A, EC 1.14.13.11) on kaks ensüümi, mis vastutavad kaneelhappe muutmise eest p-kumaroüül-CoA-ks kaks vastupidist järjestust. Need on ka selgroos ja nende ekspressiooni FPKM väärtused on vastavalt 39,57 ja 51,93.

Neli tüüpi ligniini biosünteesiti erinevatel radadel, mida kontrollisid kolm peamist ensüümi, cinnamoüül-CoA reduktaas (CCR, EC 1.2.1.44), šikimaat o-hüdroksükaneel-metüültransferaas (HCT, EC 2.3.1.133) ja ferulaat{{11. }}hüdroksülaas (F5H, EC 1,14.-.-). CCR-ist teatati ligniiniraja kontrollpunktina [50, 51], mis katalüüsis X-CoA (X, sealhulgas p-kumaroüül, kofeoüül, feruloüül, 5-hüdroksüül-feruloüül ja sinapoüül) Y-aldehüüdiks (Y). k Need kaks ensüümi, nagu lüliti, reguleerisid P-hüdroksüül-fenüülligniinide või ülejäänud kolme tüüpi ligniinide biosünteesi.

F5H oli veel üks harulüliti, mis reguleeris süringüülligniini ja 5-hüdroksüülguajaatsüülligniini. Teiste oluliste ensüümide hulka kuuluvad kofeiinhappe 3-O-metüültransferaas (COMT, EC 2.1.1.68), kofeoüül-CoA O-metüültransferaas (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) ja tsinnamüülalkoholdehüdrogenaas ( CAD, EC 1.1.1.195) tuvastati samuti väljendatuna. Üksikasjalik ekspressiooniteave on loetletud tabelis 6. Need selles uuringus tuvastatud ensüümigeenid pakuvad väärtuslikku ressurssi selle olulise ravimtaime funktsionaalsete genoomiuuringute jaoks. Tabelis 6 toodud ligniinide biosünteesi rajaga seotud 10 geeni valiti RT-qPCR kontrollimiseks, et kinnitada meie RNA-seq tulemusi (joonis 4) ja nende kõrged korrelatsioonid (Pearson korrelatsioonikoefitsient: 0,90343) näitasid meie transkriptoomianalüüsi suurt täpsust ja reprodutseeritavust. . S1 Dataset loetleb selles analüüsis kasutatud praimerite järjestused.

Cistancheon palju mõjusid

Kandidaatgeenid, mis kodeerivad PhG-de biosünteesis osalevaid ensüüme

Fenüületanoidglükosiidid (PhG-d) on teadaolevalt peamised toimeainedC. deserticolaseksuaalse potentsi parandamise, vabade radikaalide eemaldamise ja vananemisvastase tegevusega [7–10]. PhG-de kolm keemilist komponenti on orgaaniline hape, sahhariid ja fenüületanooli aglükoon (joonis 3). Orgaaniline hape, sealhulgas kofeiinhape, feruulhape ja kumarhape, on fenüülpropanoidi biosünteesiraja saadused. Sahhariidide komponendid, sealhulgas glükoos ja ramnoos, on süsivesikute ainevahetuse produktid, nagu tärklise ja sahharoosi metabolism, aminosuhkru ja nukleotiidsuhkru metabolism, fruktoosi ja mannoosi metabolism jne. Fenüületanooli osa biosünteesi rada pole aga veel selge. Siin pakkusime välja kaks võimalikku fenüületanooli biosünteesi rada, mis põhinevad meie järjestuse andmetel. Üks neist on teatatud kofeiinhappe või feruulhappe rada, mida tuntakse ka kaneelhappe rajana, mis on sarnane ligniini biosünteesi põhirajale. Teine põhineb fenüülalaniini metabolismi rajal (joonis 3), mille käigus fenüülalaniin fenüületanooliks saavutati teadaoleva Enrlichi raja kaudu, mis leiti esmakordselt pärmist sajand tagasi ja valideeriti petuunia õitel [52, 53], tomatil [52, 53]. 54] ja tõusis [55, 56]. C. deserticola vars tuvastati neli ensüümi geeni, mis kodeerivad aspartaat/türosiinaminotransferaasi, histidinoolfosfaataminotransferaasi ja primaarset amiini oksüdaasi, mis vastutavad fenüülalaniini muundamise eest fenüületanooliks. Fenüületanooli produkti võib edasi oksüdeerida monooksügenaasi toimel või metüültransferaasi abil metüülida selle derivaatideks (fenüületanooli aglükooniks), mis osalesid PhG biosünteesis. Kokkuvõttes pakuti C. deserticola jaoks välja kaks oletatavat fenüületanooli aglükooni biosünteesi rada, kuid need vajavad veel täiendavat uurimist.