Osa 1: Cistanche tubulosast eraldatud ehhinakosiid stimuleerib oletatavasti kasvuhormooni sekretsiooni greliini retseptori aktiveerimise kaudu

Cistanche tubulosa'st eraldatud ehhinakosiid stimuleerib oletatavasti kasvuhormooni sekretsiooni greliini retseptori aktiveerimise kaudu

Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4* ja Jason TC Tzen 1,*

1 Riikliku Chung-Hsingi ülikooli biotehnoloogiainstituut, Taichung 402, Taiwan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)

2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taiwan; rd1@koda.com.tw

3 Riikliku Chung-Hsingi ülikooli veterinaarmeditsiini osakond, Taichung 402, Taiwan; wychen@dragon.nchu.edu.tw

4 Graduate Institute of Farmacognosy, Taipei Medical University, Taipei 110, Taiwan

* Kirjavahetus: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: pluss 886-4-22840328 (välim. 776) (JTCT); Faks: pluss 886-4-22853527 (JTCT)

Akadeemiline toimetaja: Pinarosa Avato

Saabunud: 22. jaanuar 2019; Vastu võetud: 14. veebruar 2019; Avaldatud: 17. veebruaril 2019

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktne:Cistancheliigil, kõrbe ženšennil, on traditsioonilises Hiina farmakopöas registreeritud palju bioloogilisi toimeid ja seda on kasutatud vananemisvastase ravimina. Kolm fenüületanoidglükosiidi -ehhinakosiid, tubulosiid A ja akteosiid – tuvastati veeekstraktisCistanchetubulosa(Schenk) R. Wight ja põhikoostisosa,ehhinakosiid, puhastati edasi.ehhinakosiidkontsentratsiooniga kõrgem kui 10_6 M näitas märkimisväärset aktiivsust roti hüpofüüsi rakkude kasvuhormooni sekretsiooni stimuleerimisel. Sarnaselt kasvuhormooni vabastavale hormoonile -6, greliini sünteetilisele analoogile, pärssis kasvuhormooni sekretsiooni stimuleerimist ehhinakosiidi poolt [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-aine P , greliini retseptori pöördagonist. Molekulaarne modelleerimine näitas, et kõik kolm fenüületanoidglükosiidi interakteerusid piisavalt greliini retseptori sidumistaskuga ja ehhinakosiidil oli retseptoriga veidi parem interaktsioon kui tubulosiid A ja akteosiid. Tulemused viitavad sellele, et fenüületanoidglükosiidid, eritiehhinakosiid, on aktiivsed koostisosad, mis eeldatavasti vastutavad C. tubulosa vananemisvastase toime eest ja neid võib pidada greliini mittepeptidüülanaloogideks.

Märksõnad: cistanchetubulosa;ehhinakosiid; greliin; kasvuhormooni sekretsioon; fenüületanoidglükosiidid

Palun klõpsake siin 2. osa juurde

ehhinakosiidin cistanche saab parandadaimmuunsussüsteem

1. Sissejuhatus

Cistancheliik (Orobanchaceae), niinimetatud kõrbe ženšenn, on holoparasiitne taim, mida leidub Loode-Hiina kõrbepiirkonnas. Traditsioonilises Hiina farmakopöas on sellel taimsel ravimil mitmeid bioloogilisi toimeid, nagu kõhukinnisuse leevendamine, pikaealisus ja afrodisiaakumid [1]. Erinevaid Cistanche liike nimetatakse tavaliselt nende peremeeste ja kasvukeskkonna järgi, näiteks Cistanche deserticola YC Ma jaCistanchetubulosa(Schenk) R. Wight. C. deserticola, mille peremeesorganismis on peamiselt Sise-Mongoolias leiduv Haloxylon ammodendron, peeti Hiina farmakopöas algselt standardseks Cistanche allikaks, kuid see on Hiinas alates 1984. aastast ohustatud taimeliigina. C. tubulosa, mille peremeesorganismiks on Xinjiangis kasvatatud Tamarix ramosissima Hetian, kipub omama kiiret kasvutempot ja seega selle põllumajandusliku kasvatamise Molekulid 2019, 24, 720; doi:10.3390/molecules24040720 liiki annab palju parema saagi kui traditsiooniline C. deserticola. Tänapäeval on mõlemad ülalnimetatud kaks liiki kogutud Hiina farmakopöasse [2].

C. deserticolajaC. tubulosaon leitud, et neil on sarnased keemilised koostisosad ja farmakoloogiline toime, seega peetakse neid mõlemaid potentsiaalseks taimseks ravimiks vananemisega seotud haiguste korral [3–5]. Fenüületanoolglükosiidid on nendes kahes liigis levinud toimeained ja ehhinakosiidi peetakse C. tubulosa peamiseks fenüületanoolglükosiidiks [6]. Viimasel kümnendil on ehhinakosiidil ja ehhinakosiidirikkal C. tubulosa ekstraktil näidatud mitmeid farmakoloogilisi toimeid, nagu vananemisvastane, neuroprotektsioon, õppimisvõime ja mälu parandamine, südamefunktsiooni parandamine, hüperlipideemia ja hüperglükeemia vähendamine ning rasvumisest põhjustatud diabeedi ja metaboolse sündroomi ennetamine [7–12].

"Näljahormoonina" tuntud greliin on peptiidhormoon, mis koosneb 28 aminohappejäägist, milles kolmas seriinijääk on atsüülitud n-oktanoüülrühmaga, mis on selle bioloogiliste funktsioonide jaoks oluline [13]. On näidatud, et greliin on endogeenne ligand G-valguga seotud retseptorile, mida nimetatakse kasvuhormooni sekretsiooni suurendavaks retseptoriks (GHS-R1a), mida ekspresseeritakse peamiselt hüpotalamuses ja hüpofüüsis [14]. GHS-R1a aktiveerimine greliini poolt põhjustab kasvuhormooni sekretsiooni stimuleerimist ja mitmete füsioloogiliste reaktsioonide reguleerimist [15]. Kliinilised uuringud näitavad, et eksogeenne kasvuhormoonide lisamine võib leevendada eakate vananemisega seotud haiguste sümptomeid, näiteks suurendada lihasjõudu ja luutihedust ning parandada unekvaliteeti ja kognitiivseid võimeid [16,17]. Siiski on eksogeensete kasvuhormoonidega ravimisel esile tõstetud tõsiste kõrvaltoimete (nt eesnäärmevähk, liigesevalu, insuliiniresistentsus, vedelikupeetus, karpaalkanali sündroom ja günekomastia) muret [18,19]. Seetõttu on kasvuhormooni sekretsiooni stimuleerimist greliini poolt GHS-R1a aktiveerimise kaudu peetud alternatiivseks terapeutiliseks lähenemisviisiks eakate vananemisega seotud haigustele ja selle terapeutiline toime eeldatakse olevat parem kui kasvuhormooni eksogeenne lisamine.

Hiljuti näidati, et teaghreliinid ja ginkgogreliinid, ainulaadsed atsüülitud flavonoidglükosiidid, mida leidub Chin-shin oolongi tees ja Ginkgo biloba L. (Ginkgoaceae) lehtedes, kutsuvad esile kasvuhormooni sekretsiooni roti primaarsetes hüpofüüsi eesmises osas, seondudes ghrelin-22 retseptoriga [20–22 retseptoriga. ]. Arvestades Cistanche spp. Kuna vananemisega seotud haigused olid sarnased Chin-shin oolongi tee ja Ginkgo biloba lehtede vananemisvastase toimega, siis mõtlesime, kas fenüületanoolglükosiidide farmakoloogilist toimet saab teostada samal viisil kui teaghreliinide ja ginkgoghreliinide omasid, seondudes greliini retseptor. Esiteks tuvastati C. tubulosa veeekstraktis kolm fenüületanoidglükosiidi – ehhinakosiid, tubulosiid A ja akteosiid. Peamist koostisosa, ehhinakosiidi, puhastati täiendavalt ja uuriti selle võimet stimuleerida roti hüpofüüsi rakkude kasvuhormooni vabanemist greliini retseptori aktiveerimise kaudu. Viidi läbi ehhinakosiidi, tubulosiidi A ja akteosiidi greliini retseptoriga dokkimise molekulaarne modelleerimine ja võrreldi võimalikke koostoimeid sidumistaskus.

2. Tulemused

2.1. Kolme peamise fenüületanoolglükosiidi eraldamine ja identifitseerimine kahe Cistanche liigi veeekstraktis

Kahe Cistanche liigi HPLC analüüsis leiti, et C. tubulosa fenüületanoolglükosiidide sisaldus on palju suurem kui C. deserticola (joonis 1A, B). C. tubulosas täheldati kolme peamist fenüületanoolglükosiidi, mis identifitseeriti massispektromeetrilise analüüsi abil ehhinakosiidiks, tubulosiid A-ks ja akteosiidiks (joonis 2), võrreldes eelnevalt avaldatud HPLC profiilide ja teadaolevate ühendite MS andmetega [23,24]. Vastavalt molekulaarsele fragmentatsioonile 785 m/z MS1-s ja 623 m/z MS2-s identifitseeriti C. tubulosa veeekstrakti peamine piik ehhinakosiidina (joonis 2A). Sarnaselt määrati tubulosiid A selle molekulaarse fragmentatsiooni järgi MS1-s 827 m/z ja MS2-s 665, 623 ja 782 m/z (joonis 2B); akteosiidi olemasolu kinnitas molekulaarne fragmentatsioon 623 m/z MS1-s ja 461 m/z MS2-s (joonis 2C). Ehhinakosiidi puhastati täiendavalt peaaegu homogeensuseni (joonis 1C) ja seda kasutati järgmistes bioloogilistes testides.

Joonis 2. Jätk.

Joonis 2. Ehhinakosiidi (A), tubulosiidi A (B) ja akteosiidi (C) massispektromeetrilised analüüsid MS1 (vasakpoolsed paneelid) ja MS2 (parempoolsed paneelid) fragmentatsioonis.

2.2. Ehhinakosiidi toimekasvuhormooni sekretsiooni esilekutsumisest roti hüpofüüsi rakkudes

Et hinnata, kas ehhinakosiid võib olla kasvuhormooni sekretsiooni stimuleeriva retseptori (GHSR) agonist, uuriti sellega kasvuhormooni sekretsiooni esilekutsumist roti hüpofüüsi esiosa rakkudest. Sarnaselt sünteetilisele GHSR-i agonistile GHRP-6 suutis ehhinakosiid stimuleerida kasvuhormoonide sekretsiooni roti hüpofüüsi rakkudest (joonis 3). Kasvuhormooni sekretsiooni märkimisväärne suurenemine tuvastati, kui roti hüpofüüsi rakke töödeldi ehhinakosiidiga, mille kontsentratsioon oli suurem kui 10_6 M 15 ja 30 minutit. Leiti, et ehhinakosiidiga töötlemine (alates 10_8 kuni 10_5 M) 15 ja 30 minuti jooksul stimuleerib annusest sõltuval viisil kasvuhormooni sekretsiooni roti hüpofüüsi rakkudes. Lisaks pärssis GHSR-i pöördagonist [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-aine P ilmselgelt GHRP-6 ja ehhinakosiidi stimuleerivat toimet kasvuhormooni sekretsiooni esilekutsumisel roti hüpofüüsi rakud (joonis 4). Tulemused viitavad sellele, et ehhinakosiid on GHSR-i potentsiaalne agonist.

Joonis 3. Ehhinakosiidi toimemanustamine hüpofüüsi rakkude kasvuhormooni sekretsioonile. Mõõdeti kasvuhormooni (GH) sekretsiooni roti primaarsetest hüpofüüsi rakkudest

pärast inkubeerimist söötmega (kontroll), GHRP-6 (GHSR agonist, 10_7 M) ja erinevate kontsentratsioonidega (alates 10_8 kuni10_5 M) ehhinakosiidi (ECH) 15 (A) ja 30 minutit (B),

vastavalt. Andmed esitati keskmisena o SD koos n=6. Olulisuse tasemed, mida näebT-test olid * p < 0.05 ja ** p < 0,005 võrreldes kontrolliga.