1. OSA ehhinakosiid pärsib glutamaadi vabanemist, pärssides pingest sõltuvat Ca2 pluss sisenemist ja proteiinkinaas C roti tserebrokortikaalsetes närvilõpmedes

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 ja Su Jane Wang 3,*

1 Anestesioloogia osakond, Kaug-Ida memoriaalhaigla, Pan-Chiao piirkond, New Taipei linn 22060, Taiwan; drluchengwei@gmail.com (CWL); drlin1971@gmail.com (TYL);nskh9450n@yahoo.com.tw (SKH)

2 Yuan Ze ülikooli masinaehituse osakond, Taoyuan 32003, Taiwan

3 Meditsiinikool, Fu Jeni katoliku ülikool, nr 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuangi piirkond, New Taipei 24205, Taiwan.

Abstraktne:Glutamatergiline süsteem võib olla seotud neuroprotektiivsete ravimeetoditega. Ehhinakosiid, fenüületanoidglükosiid, mis on ekstraheeritud Hiina ravimtaimestHerba Cistanche,omab neuroprotektiivset toimet. Selles uuringus uuriti ehhinakosiidi mõju 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemisele roti tserebrokortikaalsetes närvilõpmetes (sünaptosoomides). Ehhinakosiid inhibeeris Ca^{2 pluss}-sõltuv, kuid mitte Ca^{2 pluss}-sõltumatu, 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemine kontsentratsioonist sõltuval viisil. Ehhinakosiid vähendas ka 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud tsütoplasma vaba Ca suurenemist^{2 pluss}kontsentratsiooni, kuid ei muutnud sünaptosomaalse membraani potentsiaali. Ehhinakosiidi inhibeerivat toimet 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemisele hoidis ära cu-konotoksiin MVIIC, mis on Cav2.2 (N-tüüpi) ja Cav2.1 (P/Q-tüüpi) kanalite laia toimespektriga blokeerija. , kuid oli rakusisese Ca suhtes tundlik^{2 pluss}vabanemise inhibiitorid dantroleen ja 7-kloro-5-(2-klorofenüül)-1, 5-dihüdro-4, 1-bensodiasepiin{{ 8}}(3H)-oon (CGP37157). Lisaks vähendas ehhinakosiid 4-aminopüridiini poolt indutseeritud proteiinkinaas C fosforüülimist ja proteiinkinaas C inhibiitorid kaotasid ehhinakosiidi mõju glutamaadi vabanemisele. Nende tulemuste kohaselt soovitame, et ehhinakosiidi inhibeeriv toime esilekutsutud glutamaadi vabanemisele on seotud pingest sõltuva Ca vähenemisega^{2 pluss}proteiinkinaas C aktiivsuse sisenemine ja sellele järgnev pärssimine.

Märksõnad:ehhinakosiid; glutamaadi vabanemine; tserebrokortikaalsed närvilõpmed; pingest sõltuv Ca²pluss kanalid; Parkinsoni tõve, Alzheimeri tõve ja keskmise ajuarteri oklusiooni proteiinkinaas C[9-12]. Kuid mehhanism, mille kaudu ehhinakosiid kutsub esile neuroprotektsiooni, ei ole täielikult teada.

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com

ehhinakosiidcistanche'is on palju funktsioone

1. Sissejuhatus

ehhinakosiidon peamine fenüületanoidglükosiidHerba Cistanche, tuntud traditsiooniline hiina meditsiin, mida kasutatakse unustamise, impotentsuse ja kroonilise kõhukinnisuse raviks [1].ehhinakosiidomab mitmesuguseid bioaktiivsusi, nagu antioksüdatsioon, põletikuvastane, vähivastane, hepatoprotektsioon ja immuunmodulatsioon [2–4]. Eelkõigeehhinakosiidomab neuroprotektiivset toimet; Näiteks võib see kaitsta oksüdatiivse stressi või neurotoksiinide põhjustatud neurotoksilisuse eest primaarsetes roti kortikaalsetes neuronites, inimese neuroblastoomi SH-SY5Y rakkudes ja feokromotsütoomi (PC12) rakkudes [5–8]. Lisaksehhinakosiidnõrgendab ajukahjustusi ja parandab kognitiivset funktsiooni Parkinsoni tõve, Alzheimeri tõve ja keskmise ajuarteri oklusiooni loommudelites [9–12]. Küll aga mehhanism, mille kauduehhinakosiidindutseerib neuroprotektsiooni, pole täielikult teada.

Neuroprotektsioon on keeruline protsess neuronite struktuuri ja funktsiooni säilitamiseks toksiliste solvangute korral. Glutamaadi eksitotoksilisuse vähendamist peetakse potentsiaalseks mehhanismiks, mis on seotud aju neuroprotektsiooniga. Glutamaadil, ergastav aminohapete neurotransmitter, on otsustav roll mitmes ajufunktsioonis [13]. Glutamaadi retseptorite üleaktiveerumine kõrge glutamaadi kontsentratsiooni korral põhjustab aga intratsellulaarset Ca2 pluss ülekoormust, mitokondriaalset düsfunktsiooni, vabade radikaalide tootmist ja neuronite surma [14,15]. See patoloogiline protsess on seotud paljude ajuhäiretega, sealhulgas ajuisheemia, traumaatiline ajukahjustus, epilepsia ja neurodegeneratiivne haigus [16,17]. Seetõttu peetakse patofüsioloogilist glutamatergilist ülekannet blokeerivaid inhibiitoreid potentsiaalseteks neuroprotektiivseteks ravimiteks. Märkimisväärsed näited nendest on glutamaadi retseptori antagonistid [18,19]; nende ravimite kliinilised uuringud on aga ebaõnnestunud väiksema efektiivsuse ja soovimatute või isegi tsütotoksiliste kõrvaltoimete tõttu [20,21]. Lisaks otsesele glutamaadi retseptori blokaadile võib glutamaadi vabanemise pärssimine olla tõhus neuroprotektsiooni strateegia. Mitmed neuroprotektorid (nt memantiin ja rilusool) võivad vähendada glutamaadi vabanemist roti ajukoes [22–24].

Arvestades glutamaadi rolli eksitotoksilisuses ja neuroprotektiivses profiilisehhinakosiid, kasutati käesolevas uuringus roti ajukoorest puhastatud isoleeritud närvilõpmeid (sünaptosoome), et uuridaehhinakosiidglutamaadi vabanemise kohta ja täiendavalt uuritud võimalikke mehhanisme. Eraldatud närvilõpme preparaat on väljakujunenud mudel neurotransmitterite vabanemise presünaptilise regulatsiooni uurimiseks ravimite poolt postsünaptiliste mõjude puudumisel [25]. Seda mudelit kasutades hindasime selle mõjuehhinakosiidglutamaadi vabanemise, membraanipotentsiaali, presünaptilise Ca2 pluss sissevoolu ja proteiinkinaasi C aktiivsuse kohta. Meie kirjanduse ülevaate kohaselt on see esimene aruanne, mis dokumenteerib mehhanismi, mille kauduehhinakosiidpärsib endogeense glutamaadi vabanemist presünaptilisel tasemel.

Ehhinakosiid võib oksüdatsioonivastase toimega

2. Tulemused

2.1. ehhinakosiidInhibeerib 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemist roti tserebrokortikaalsetest närvilõpmetest, vähendades vesikulaarset eksotsütoosi

Joonis 1 illustreerib kontsentratsioonist sõltuvat toimetehhinakosiid{{0}}aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemise kohta roti puhastatud tserebrokortikaalsetest sünaptosoomidest. 1 mM CaCl2-ga inkubeeritud sünaptosoomides kutsus 1 mM 4-aminopüridiin esile glutamaadi vabanemise 7,4 ˘ 0,1 nmol/mg/5 min, mis vähenes 1, 5, 10, 30 ja 50 µM võrra.ehhinakosiidkuni 6,5 ˘ 0,2, 5,8 ˘ 0,3, 4,8 ˘ {{10}},2, 4,1 ˘ 0,1 või 2,3 ˘ 0,4 nmol/mg/5 min, vastavalt (F(5,24)=67.1, p=0.000). IC50 väärtusehhinakosiid-vahendatud 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemise inhibeerimine, mis tuletati annuse-vastuse kõverast, oli 24 µM. Veelgi enam, glutamaadi vabanemine, mille kutsub esile 1 mM 4-aminopüridiin ekstratsellulaarses Ca2 pluss-vabas lahuses, mis sisaldab 300 µM etüleenglükool-bis(-aminoetüüleeter)-N,N,N1,N{{ 13}}tetraäädikhape (EGTA) oli 2,1 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min (F(2,12)=310,65, p=0.000) ja see Ca2 20 µM ei mõjutanud 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemise pluss sõltumatut komponentiehhinakosiid(1,8 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,58; joonis 1). Sünaptosoomides, mida töödeldi vesikulaarse transporteri inhibiitoriga 0,1 µM bafifilomütsiin A1 [26], vähenes 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemine märkimisväärselt (2,2 ˘ 0,2 nmol/mg/ 5 min; F (2,12)=249,518, p=0.000). Bafifilomütsiin A1 juuresolekul ei suutnud 20 µM ehhinakosiid märkimisväärselt inhibeerida glutamaadi vabanemist (2,1 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; p=0,94; joonis 1). Seevastu 10 µM DL-treo-beeta-bensüüloksüaspartaat (DL-TBOA, glutamaadi tagasihaarde inhibiitor) [27] suurendas 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemist 11,8 ˘ 0,4 nmol/mg/5 min ( t(8)=´11.31, p=0.000). Isegi DL-TBOA juuresolekul 20 uMehhinakosiidinhibeeris märkimisväärselt {{0}}aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemist (7,7 ˘ 0,2 nmol/mg/5 min; F(2,12)=87.23, p=0.{{ 12}}; joonis 1)

2.2. ehhinakosiidVähendab tsütosoolset Ca²plussKontsentratsioon, kuid ei muuda sünaptosoomi

Membraani potentsiaal

1 mM 4-aminopüridiinist põhjustatud sünaptosoomi depolarisatsioon suurendas Ca²pluss keskendumine(p= 0.000; Tabel 1). 20 |vM rakendamineehhinakosiidei mõjutanud oluliselt baraali Ca²pluss kontsentratsioon (t(8) = 0.06, p= 0.95), kuid vähendas oluliselt 4-aminopüridiinist põhjustatud iia Ca suurenemist²pluss kontsentratsioon (t(10) = 6.16, p =0.000). Lisaks suurenes 1 mM 4-aminopüridiini 3',3',3'-dipropüültiadikarbotsüaniinjodiidis [DiSC₃(5)] fluorestsents (p= 0.000). Lisand o⁽20 fdM ehhinakosiid ei muutnud puhkemembraani potentsiaali (t(8)=0.976,p= 0.36) või muuta oluliselt 4-aminopüridiini poolt vahendatud DiSC suurenemist₃(5) fluorestsents (t(8) = —0.014, p= 0.99; Tabel 1).

Cistancheehhinakosiidvõib ravida neeruhaigusi

2.3. Vähendatud- CO2 plussCav2.2 (N-tüüpi) ja Cav2.1 (P/Q-tüüpi) kanalite sissevool võib olla seotud 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemise pärssimisegaehhinakosiid

Joonis 2 näitab, et 2 cu-konotoksiini MVIIC, N-ja P/Q-tüüpi Ca²pluss kanalite blokeerija,

vähendas {{0}}aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemist 7,4 土 0,2-lt 2-le.0 土 0,1 nmol/mg/5 min (t(9) = 25.35, p{{0}}.000). Cu-konotoksiini MVIIC juuresolekul oli 20 pM ehhinakosiidi mõju 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemisele ebaoluline (1,8 ± 0,2 nmol/mg/5 min;t(8) = 1.06, p= 0.32). Dantroleen (10 ^M), intratsellulaarse Ca inhibiitor²pluss vabanemine Endoplasmaatilisest retikulumist [28] vähendas 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemist (5,6 土 0,3 nmol/mg/5 min; F(2,14)=104. 95,p= 0.000). Kuid dantroleeni juuresolekul 20 pJMehhinakosiidvõib siiski oluliselt inhibeerida glutamaadi vabanemist (3,3 土 0,2 nmol/mg/5 min;p= 0.000). Sarnased tulemused saadi 100 pM 7-kloro-5-(2-klorofenüü)-1, 5-dihüdro-4, 1-bensotiasepiini kasutamisel -2(3H)-oon (CGP37157), membraani läbilaskev mitokondriaalse Na blokeerija^pluss/Ca²pluss vahetus. Viies uuritud sünaptosomaalses preparaadis oli 20 pMehhinakosiidkombineerituna 100 pM CGP37157-ga vähendas 4-aminopüridiinist põhjustatud glutamaadi vabanemist 48,3 protsenti 土 5,2 protsenti (F(2,13) ​​= 136,79,p= 7.000), mis sarnaneb ainult ehhinakosiidi inhibeerimisega (46,2 protsenti 土 2,3 protsenti ;p = 0.89;

2.4. ehhinakosiidInhibeerib 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud (glutamaadi vabanemist proteiini kinaasi C kaudu

Nagu on näidatud joonisel 3, 10 kraadi jlM 2-[1-(3-dimetüülaminopropüül)indool-3-üül]-3-(indool-3-üül) maleimiid (GF109203X), üldine proteiinkinaasi C inhibiitor [29], vähendas 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemist (F(2,13) ​​= 19.46, p=0 .000). GF109203X-ga töödeldud sünaptosoomides vähendas 20 pM ehhinakosiid 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemist vaid 5,5% 土 1,8% (p=0.89), vähem kui ehhinakosiidiga üksi (42,2 %). protsenti ; p=f.000). Sarnased tulemused saadi 5,6,7,13-tetrahüdro-13-metüül-5-okso-12H-indolo[2,3-a]pürrolo[3-ga ,4-c]karbasool-12-propaannitriil (Go6976), selektiivne Ca2 pluss-sõltuvate proteiinkinaasi C isovormide (a, |3I, |3II, y) suhtes [29]. 3 pM Go6976 juuresolekul 20 pMehhinakosiidvähendas glutamaadi vabanemist 11,9 protsenti 土 2,9 protsenti (p=0,59), mis tähendab olulist vähenemist võrreldes ainult ehhinakosiidiga (42,4 protsenti 土 2,3 protsenti ; p=0.000); Joonis 3). Seevastu 3 pM rottleriini, Ca2 plussist sõltumatu proteiinkinaasi C6 inhibiitor [30], ei muutnud oluliselt 4-aminopüridiini (1 mM) poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemist (p=0.45). Sellegipoolest põhjustas 20 pM ehhinakosiid rottleriini juuresolekul keskmiselt 37,1% ± 5,6% vabanemise inhibeerimise (F(2,13) ​​= 19.72, p=0).{33 }}), sarnane ainult ehhinakosiidiga (p=0.41; joonis 3). Lisaks mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi inhibiitor 2-(2-amino-3-metoksüfenüül)-4H-1-bensopüraan-4-oon) (PD98059 ) (50 pM) ja proteiinkinaasi A inhibiitor N-[2-(p-bromotsinnamüülamino)etüül]-5-isokinoliinsulfoonamiid (H89) (100 pM) vähendasid 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemist (p=0.000). Isegi PD98059 või H89 juuresolekul 20 pMehhinakosiidvähendas tõhusalt vabanemist (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.000; joonis 3).

Joonisel 4 on näidatud, et tha11 mM 4-aminopüridiin suurendas proteiinkinaas C fosforüülimist sünaptosoomides (t(4) = —6.871, p= 0.002). Kui sünaptosoome töödeldi 20 pM ehhinakosiidiga 10 minutit enne 4-aminopüridiini lisamist, vähenes 4-aminopüridiini poolt indutseeritud proteiinkinaas C fosforüülimine märkimisväärselt (F(2)_a6) = 29.202, p = 0.00 1).

ehhinakosiidsissecistanchevõib suurendadaimmuunsussüsteem

2.5. ehhinakosiid- Glutamaadi vabanemise vahendatud inhibeerimine ei hõlma A-tüüpi gamma-aminovõihapet (GAB)³A_A) Retseptor

Joonisel 5 on kujutatud ehhinakosiidi mõju 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemisele SR95531 (GABA antagonist) puudumisel või juuresolekul_Aretseptor) võrreldi. Lisaks ei muutnud 100 pM SR95531 oluliselt 4-aminopüridiini (1 mM) poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemist. Aastal

SR95531--ga töödeldud sünaptosoomide korral inhibeeris 20 pM ehhinakosiidi kasutamine 43% 4-aminopüridiini poolt esile kutsutud glutamaadi vabanemist (F(2,12)=42.63,p= 0.000), mis ei erinenud oluliselt ainult ehhinakosiidi tekitatud inhibeerimisest (40 protsenti;p= 0.000). Sarnane tulemus saadi teise GABAa retseptori antagonisti bikukuliiniga (50 pM). Vabanemist mõõdeti bikukuliini ja