1. osa Cistanches Herba (Rou Cong Rong) ravimite tuvastamine, kasutades liigispetsiifilisi nukleotiidisignatuure

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* ja Shi-lin Chen 3

1 Hiina ravimtaimede bioaktiivsete ainete ja ressursside kasutamise võtmelabor, haridusministeerium, ravimtaimede arendamise instituut, Hiina meditsiiniakadeemia ja Pekingi liidu meditsiinikolledž, Peking, Hiina, 2 NHP uurimisliit, Ontario bioloogilise mitmekesisuse instituut (BIO) ), Guelphi ülikool, Guelph, ON, Kanada,

3 Pekingi Hiina meditsiini tuvastamise ja ohutuse hindamise võtmelabor, Hiina Materia Medica instituut, Hiina Hiina meditsiiniteaduste akadeemia, Peking, Hiina

Cistanche deserticolal on palju mõjusid, lisateabe saamiseks klõpsake siin

Cistanches Herbaon ravimtaim, millel on võõrutusomadused ja mida kasutatakse laialdaselt Aasias. Pakkumise ja nõudluse vahelise tasakaalustamatuse tõttu lisatakse kasumi eesmärgil sageli rikkujaid. Siiski puudub regulatiivne järelevalve, kuna kvaliteedikontrolli vahendid ei ole tugevalt töödeldud toodete tuvastamiseks piisavad. Seega töötati välja uudne molekulaarne tööriist, mis põhineb nukleotiidide signatuuridel ja liigispetsiifilistel praimeritel. ITS2 piirkonnad alates 251Cistanches Herbaja võltsitud proovid sekveneeriti. SNP saitide põhjal töötati välja neli nukleotiidi allkirja vahemikus 30–37 aluspaari ja kuus liigispetsiifilist praimerit ning need valideeriti kunstlike eksperimentaalsete segudega, mis koosnesid kuuest erinevast liigist ja erinevatest suhetest. Seda meetodit kasutati ka 66 tuvastamiseksCistanches Herbaturul olevad tooted, sealhulgas ekstraktid ja Hiina patendiga ravimid. Tulemused näitasid nukleotiidide signatuuride kasulikkust segudes esinevate ainete tuvastamisel. Turu-uuring näitas 36,4 protsenti võltsimist: 19,7 protsenti hõlmas võltsimist Cynomorium songaricum võiCistancheSinensis ja 16,7 protsenti hõlmasid asendamist Cy-ga. songaricum, Ci. sinensis ehk Boschniakia rossica. Tulemused näitasid ka, et Cy. songaricum oli turul kõige levinum rikkuja. Seega soovitame võltsimise reguleerimiseks ja ravimite tarneahelate kvaliteedi tagamise kontrollimiseks kasutada liigispetsiifilisi nukleotiidsignatuure, eriti töödeldud toodete puhul, mille DNA on lagunenud.

Märksõnad: Cistanches Herba, Hiina patentmeditsiin, nukleotiidide signatuur, lagunenud DNA, ravimite kvaliteedikontroll

SISSEJUHATUS

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) on ​​Aasias tuntud farmakopöas registreeritud ravim (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015; Jaapani farmakopöa konventsioon, 2016); see ravim on saadud kuivatatud mahlakastest vartestCistanche deserticolaYC Ma võiCistanche tubulosatoonik, kuna see ei ole mürgine ja seda võib võtta pikka aega (Li et al., 2016). LisaksCistanchesHerba pälvis au saada nimeks "Kõrbe ženšenn" selle suure raviväärtuse tõttu, eriti meeste seksuaalfunktsiooni tugevdamisel (Zhang ja Su, 2014; Gu et al., 2016). Hiina farmakopöa komisjonis (2015) ja teistes kohalikes ametlikes väljakuulutatud standardites (Wang et al., 2012) on registreeritud enam kui 100 Hiina patenditud ravimit. Kuna eakate inimeste arv suureneb, on nõudlus nende järele märkimisväärneCistanches Herbaja selle ravimid. Tooraineressursid aga muutuvad üha napimaks. Tegelikult kaks algset liikiCistanches Herbaon lisatud Hiina taimede punasesse raamatusse kui riiklikult kaitstud looduslikud taimed (II kategooria) (Fu, 1991). Turul olevaid ravimmaterjale kasvatatakse peamiselt Loode-Hiinas.

Pakkumise ja nõudluse vahelise märkimisväärse tasakaalustamatuse tõttuCistanchesHerba, paljud abielurikkujad on turule tulnud; need rikkujad ei ole standarditega kooskõlas ja võivad ohustada uimastijulgeolekut. Tuntud rikkujate hulka kuuluvad Cynomorium songaricum Rupr kuivatatud mahlakad varred. (Cynomorii Herba, hiina keeles Suo Yang),Cistanchesinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan ja Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (Sun et al., 2012). Nendel rikkujatel on sarnased morfoloogilised omadusedCistanchesHerba, mis muudab traditsioonilise taksonoomilise tuvastamise keeruliseks, eriti pärast materjali töötlemist ravimiteks. Mikroskoopiline tuvastamine pole saadaval, kunaCistanchesHerbaei oma lõplikke ega ainulaadseid mikroskoopilisi omadusi. Praegused analüütilise keemia vahendid ei ole Cistanches Herba võltsimise tuvastamiseks piisavad, kuna sarnaseid ühendeid leidub ka teadaolevates lisandites Ci. salsa (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) ja Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Seetõttu on Hiina patendimeditsiini ja teiste ravimitööstuse nõuetekohaste kvaliteedikontrollisüsteemide jaoks kiiresti vaja välja töötada kiire molekulaarne meetod Cistanches Herba ja selle toodete autentimiseks.

Chen et al. pakkusid esmakordselt välja sisemise transkribeeritud vahetüki 2 (ITS2) universaalse vöötkoodina ravimtaimede jaoks (Chen et al., 2010). Sun et al. kontrollis ITS2 piirkonda identifitseerimiseks eelistatava DNA vöötkoodinaCistanchesHerba ja selle rikkujad (Sun et al., 2012). Siiski ei saa ITS2 abil eristada Hiina patendimeditsiini lagunenud DNA-st. Viimasel ajal on üha rohkem uuringuid näidanud, et "mini vöötkood" on kasulik meetod lagunenud DNA võimendamiseks (Hajibabaei et al., 2006; Meusnier et al., 2008; Dubey et al., 2011; Lo et al., 2015). Nukleotiidisignatuurid on siiski sobivamad kui mini-vöötkoodid, kuna esimesed viitavad ühele või mitmele nukleotiidile, mis on ühele liigile ainulaadsed ja mida saab tõhusalt kasutada paljude molekulaarsete tehnikate, näiteks DNA sondide, mikrofluidika ja ahela vahendatud isotermilise amplifikatsiooni abil ( de Boer et al., 2015). Han et al. töötas välja Panaxi ženšenni, Angelica Sinensise ja Lonicera japonica nukleotiidisignatuurid ning tuvastas edukalt seotud Hiina patendiga ravimid (Liu et al., 2016; Wang et al., 2016a; Gao et al., 2017).

sisaldavad funktsionaalsed tootedCistanchesHerba. Täpsemalt (1) töötasime välja neli nukleotiidisignatuuri ja kuus spetsiifilist praimeripaari autentsete eristamiseks.CistanchesHerba ja teadaolevad rikkujad (2) kinnitasid katsetes nelja nukleotiidi signatuuri, sealhulgas tuntud taksonoomiliste vautšerite segusid, mida kasutati Cistanches Herba toodete valmistamiseks, mis sisaldavad nii autentseid kui ka võltsitud koostisosi, ja (3) viisid läbi 66 turu-uuringu.CistanchesHerba tooted nende nukleotiidide allkirjade kaudu.

Cistanchesellel on palju toimeid ja see võib parandada neerufunktsiooni

MATERJALID JA MEETODID

Proovide kogumine ja ettevalmistamine

Kokku koguti 251 proovi muu hulgas Sise-Mongooliast, Xinjiangist ja Ningxiast; need proovid sisaldasid 214Cistanches Herbaja 37 rikkujat ning need on üksikasjalikult kirjeldatud täiendavas tabelis S1. Vastavad vautšeriproovid kinnitasid taksonoomid ja deponeeriti Hiina Meditsiiniteaduste Akadeemia ravimtaimede arendamise instituudi herbaariumis, Pekingis, Hiinas. Kokku 35 partiid pulbreid, vürtse ja ekstrakteCistanchesHerbat osteti Pekingi ja Chengdu veebipoodidest ja tavalistest apteekidest (tabel 1). Kokku 31 partiid Hiina patendiga ravimeid, mis sisaldavadCistanchesHerba osteti erinevatest apteekidest (tabel 2) ja erinevate Hiina patendiravimite deklareeritud koostised on näidatud täiendavas tabelis S3. Erinevate annustamisvormide erinevad morfoloogilised omadused on näidatud joonisel 1.

Segaproovid: Ci pulbrid.deserticola, Ci.tubulosa, Cy. songaricum, Ci. sinensis, B. rossica ja O. coerulescens segati enne ekstraheerimist kunstlikult erinevates kombinatsioonides (vahekorras 1:1). Nende segaproovide üksikasjad on näidatud joonise 3 legendis. Lisaks segati nelja lahustuva aine pulbrid ehtsa Ci-ga. deserticola erinevates kaalusuhetes: 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 ja 60000:1 (tabel 3). Ja kaks ehtsat toodet segatakse samades vahekordades.

Keetmine: Ci viilud. deserticola ja Cy. keetmise valmistamiseks kasutati songaricumit. Viile (10 g) keedeti 300 ml topeltdestilleeritud vees 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 ja 240 minutit ning seejärel kasutati DNA ekstraheerimiseks.

DNA ekstraheerimine, polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) amplifikatsioon ja sekveneerimine

Proovid, keetmine ja segaproovid: proovid (40–50 mg) jahvatati peeneks pulbriks Retsch MM400 laborisegistiga (Retsch Co., Saksamaa) sagedusel 30 Hz. Seejärel ekstraheeriti genoomne DNA vastavalt tootja juhistele Plant Universal Genomic DNA Kitiga (Tiangen Biotech Beijing Co., Hiina). ITS2 amplifitseeriti universaalsete praimerite 2F/3R abil (Chen et al., 2010).

paralleelselt partii kohta. Hiina patenditud meditsiini pulbrit pesti 700 µL eelpesupuhvriga [100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 20 mM etüleendiamiintetraäädikhape (EDTA), pH 8,0;

700 mM NaCl; 2 protsenti polüvinüülpürrolidooni (PVP)-40; ja 0,4 protsenti -merkaptoetanooli] mitu korda, kuni supernatant oli selge ja värvitu, misjärel segu tsentrifuugiti 7500 x g juures 5 minutit toatemperatuuril. Seejärel kasutati sadet genoomse DNA ekstraheerimiseks Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co.) kaudu vastavalt tootja juhistele. Lõpuks kontsentreeriti iga partii DNA ühte katsutisse. Kuus liigispetsiifilist praimeripaari – SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR ja LDF/LDR – kavandati Primer Premieri kaudu

6.0 tarkvara (Premier Co., Kanada) Cistanches Herba ja selle lisaainete võimendamiseks (üksikasjad on näidatud tabelis 4). PCR viidi läbi 50 µl mahuga reaktsioonis, mis sisaldas 1 µl

KOD FX (Toyobo Co., Jaapan), 25 µL 2 × PCR puhvrit, 10 µL dNTP-sid (2 mM), 1,5 µL iga praimerit (10 µM) ja 4 µL (~50 ng) DNA matriitsi; ülejäänud maht koosnes topeltdestilleeritud veest. Reaktsioonid viisid läbi

termotsükler (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., USA); termilised programmid on loetletud tabelis 4. PCR tooteid uuriti 3% agaroosgeelelektroforeesiga ja puhastati kahesuunaliseks sekveneerimiseks ABI 3730XL sekvenaatoriga (Applied Biosystems Co.) vastavalt Sangeri sekveneerimismeetodile. Seejärel testiti kuue praimeri tundlikkust kvantitatiivse reaalajas PCR (qRT-PCR) testiga CFX96 Real-time Systemiga (Bio-rad Lab., USA). Süsteem arvutas tsükli läved automaatselt "PCR Baseline Subtracted Curve Fit" mudeli abil. qRT-PCR viidi läbi 15 µl mahuga reaktsioonis, mis sisaldas 7,5 µL SYBRⓍR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co., Jaapan), 1.0 µL iga praimerit (10 µM) ja 1,0 µL DNA matriitsi, ülejäänud maht koosneb topeltdestilleeritud veest. qRT-PCR viidi läbi kolme tehnilise kordusega, mille põhjal arvutati standardviga.

Järjestuste analüüs: järjestusi redigeeriti ja pandi käsitsi kokku CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., USA) abil.

GenBanki ITS-järjestused märgiti ITS2 järjestuste saamiseks Hidden Markovi mudeli (HMM) abil (Keller et al., 2009). Seejärel joondati järjestused MEGA 5.0 tarkvara abil "Muscle" joondusmeetodi abil (Edgar, 2004; Tamura et al., 2011).

Cistanchesellel on palju mõjusid ja see võib tugevdadaneerudfunktsiooni

TULEMUSED

Nukleotiidisignatuuride ja liigispetsiifiliste praimeripaaride väljatöötamine tsistankide herba ja adulterantsi jaoks

251 proovi PCR amplifikatsiooni ja sekveneerimise edukuse määrad olid 100 protsenti, kui kasutati praimerite paari 2F/3R. Cy joondatud pikkus. songaricum ITS2 järjestused olid 229 bp (täiendav joonis S1). GenBankist saadud herbaariumiliikide ja tihedalt seotud liikide järjestuste analüüs (täiendav tabel S2) näitas Cy jaoks kaks ühe nukleotiidi polümorfismi (SNP) saiti. songaricum. SNP-de põhjal on üks Cy. Töötati välja songaricumi spetsiifiline 30- bp nukleotiidi signatuur (5'-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') (joonis 2A). Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) tulemused NCBI-s näitasid, et see nukleotiidisignatuur oli Cy jaoks ainulaadne. songaricum (tabel 5). Tihedalt seotud liikide järjestuste sarnase analüüsiga avastati Ci-st üks kuni kaks SNP-d. sinensis, B. rossica ja O. coerulescens. SNP-de põhjal töötati sarnaselt välja ka ülejäänud kolme lahutaja nukleotiidsignatuurid, sealhulgas 34 aluspaari pikkune signatuur (5'-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3') Ci jaoks. Sinensis, 37 bp signatuur (5'- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') B. rossica jaoks ja 31 bp signatuur (5'-gtctgtcgtg cocens (Joonised 2BD). BLAST analüüs NCBI-s näitas ka, et need nukleotiidide signatuurid olid spetsiifilised ja neid ei esinenud üheski teises liigis (tabel 5).

Cistanches Herbaja selle rikkujaid saab amplifitseerida üheaegselt segudest universaalse praimeripaari 2F/3R kaudu. Seega kujundasime ITS2 järjestuste joondamise teel nukleotiidide signatuuri amplifitseerimiseks liigispetsiifilised praimerid. Cy nukleotiidsignatuuride võimendamiseks kavandati neli spetsiifilist praimeripaari - SYF1 / SYR1, CCRF / CCRR, SCRF / SCRR ja LDF / LDR. songaricum, B. rossica, Ci. sinensis ja O. coerulescens (tabel 4). Amplikonite pikkused olid vastavalt 123, 72, 131 ja 71 aluspaari.

Lisaks analüüsiti kokku 214 ITS2 järjestust eksperimentaalsetest Cistanches Herba materjalidest. Kaks lühikest spetsiifilist praimerit – HMRCF/HMRCR ja GHRCF/GHRCR Ci jaoks. deserticola ja Ci. tubulosa – olid mõeldud lagunenud proovide lühikeste piirkondade võimendamiseks (tabel 4). Amplikonite pikkused olid vastavalt 132 ja 134 aluspaari.

Nukleotiidisignatuuri ja liigispetsiifilise praimeri meetodi valideerimine kunstlike segude ja keetmise põhjal

Uute praimeripaaride amplifikatsiooniefektiivsused valideeriti segust. PCR-produktid saadi iga praimeripaari kaudu iga sihtliigi jaoks, nagu näidatud

B. rossica või O. coerulescensi cq väärtused saadi isegi proovide osakaaluks 30000:1 või 40000:1 ning Ci amplifikatsioonitulemused. sinensis, Ci.tubulosa, ja Ci deserticola võis tuvastada, kui suhe oli 20000:1. Kuid Cy puhul ei saadud tuvastatavaid tulemusi. songaricum, kui see moodustas suhte 20000:1.

Kontrollimaks, kas nukleotiidide signatuuri meetod töötab töödeldud materjalidega, Ci keetmisega. deserticola ja Cy. olid ette valmistatud songaricum. Tulemused näitasid, et Ci. deserticola sai amplifitseerida isegi pärast proovide 210-minutilist keetmist. Lisaks Cy nukleotiidsignatuur. songaricum'i sai amplifitseerida pärast proovide 150-minutilist keetmist, samas kui proovide 210 või 240-minutise keetmise järel PCR-produkte ei tuvastatud (joonis 4). Sekveneerimise tulemused näitasid, et lühikese nukleotiidi signatuur saadi keedist edukalt.

Nukleotiidsignatuuri ja spetsiifiliste praimerite kaudu võltsimise turu-uuring

Eespool kirjeldatud meetodit kasutati tuvastamiseksCistanchesHerba tooted turul. Kolmkümmend viis partiidCistanchesHerba viilud, pulbrid ja ekstraktid amplifitseeriti ja sekveneeriti kuue kavandatud spetsiifilise praimeriga (agaroosgeeli elektroforeesi tulemused on näidatud lisajoonisel S2 ja järjestused on loetletud täiendaval andmelehel 1). Järjestuste analüüs nende nukleotiidsignatuuride kaudu näitas, et viis viilude partiid olid autentsed. Üks viilupartii ja üks pulbripartii asendati Cy-ga. songaricum ja üks ekstrakt asendati Ci-ga. sinensis. Ülejäänud kuus pulbripartiid olid segud: viis olid võltsitud Cy-ga. songaricum ja Ci. sinensis ja üks oli võltsitud Cy-ga. songaricum (tabel 1). Lisaks asendati üks viilupartii Salvia miltiorrhizaga.

Hiina patenditud ravimites sisalduv Cistanches Herba allutatakse erinevatele protsessidele, mis muudavad autentimise keeruliseks. Testiti kuue praimeripaari võimet amplifitseerida Hiina patendiravimitest pärit liigispetsiifilisi nukleotiidide signatuuripiirkondi (agaroosgeeli elektroforeesi tulemused on näidatud lisajoonisel S2). Enamik Hiina patendiga ravimeid sisaldab eri liiki komponente. Näiteks Shihu Yeguangi pillid (ZCY34) sisaldavad 25 koostisosa, sealhulgas Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu) ja Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). Nendest koostisosadest saab Cistanches Herbat amplifitseerida spetsiaalselt praimeripaari GHRCF / GHRCR kaudu. PCR-produktide otsene sekveneerimine näitas väga puhtaid jälgi. Siiski ei õnnestunud praimeripaari HMRCF/HMRCR korral saada nähtavat riba.

Teine näide on Kangguzhi Zengshengi pillid (ZCY44). Lisaks on kaheksa koostisosaCistanchesHerba selles Hiina patendimeditsiinis, kuid ei GHRCF/GHRCR ega HMRCF/HMRCR saadud nähtavaid ribasid, mis tähendas, etCistanches Herbakohal oli. Kuid Cy. songaricum amplifitseeriti edukalt spetsiifilise praimeripaari SYF1 / SYR1 abil. Sekveneerimise tulemused näitasid Cy lühikest nukleotiidsignatuuri. songaricum saadi edukalt.

Cistancheon palju funktsioone ja onpõletikuvastanemõjusid