Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Katharina Artinger, Alexander H. Kirsch, Agnes A. Mooslechner, Daniel J. Cooper23, Ida Aringer, Max Schuller, Corinna SchabhüttI, Konstantin A. Klötzer, Kerstin Schweighofer, Philipp Eller, Hideo Yagita, Anna L. Illert', Alexander R. Rosenkranz', Peter J. Lane2 ja Kathrin Eller

Cistanche võib väga hästi aidata neerutalitlust

„Clinical Division of Nephrology, Internal Medicine Department, Medical University of Graz, Graz, Austria; Meditsiiniuuringute Nõukogu Immuunregulatsiooni keskus, Biomeditsiiniuuringute Instituut, Birminghami Ülikool, Birmingham, Ühendkuningriik; Globaalse ja troopilise tervise osakond, Menziesi terviseuuringute kool ja Charles Darwini ülikool, Darwin, Northern Territory, Austraalia; Intensiivravi osakond, Grazi Meditsiiniülikooli sisehaiguste osakond, Graz Austria: Immunoloogia osakond, Juntendo ülikooli meditsiinikool, Tokyo, Jaapan; ja kraad meditsiiniosakond l, Freiburgi ülikooli meditsiinikeskus, Freiburgi ülikooli arstiteaduskond, Freiburg, Saksamaa

Kaasstimulatsioon on T-rakkude poolt vahendatud haiguste patogeense aktiivsuse eeltingimus ja on näidatud, et see saavutab terapeutilise sihtmärgina tolerantsuse elundispetsiifilise autoimmuunsuse suhtes. Siin hindasime kasvaja nekroosifaktori perekonnaliikmete CD30 ja OX40 osalemist immuunkomplekside vahendatud protsessis.neerud haigus. In vitro stimulatsiooni ja proliferatsiooni uuringud viidi läbi CD4 pluss rakkudega metsiktüüpi ja CD30/OX40 topeltknock-out (CD30OX40) hiirtelt. In vivo uuringud viidi läbi nefrotoksilise seerumi nefriidi esilekutsumisega metsiktüüpi, CD30OX40, CD30', OX40 kraadi, taastatud Rag1~ ja C57Bl/6J hiirtel, keda raviti CD30L aOX40L antikehadega. CD30, OX40 ja nende ligandid olid nefrotoksilise seerumi nefriidi korral erinevatel leukotsüütidel ülesreguleeritud. CD30OX40 hiired, kuid mitte CD30/või OX40 hiired olid kaitstud nefrotoksilise seerumi nefriidi eest. Sarnane kaitse leiti Rag1 hiirtel, kellele süstiti CD4 pluss T-rakke CD30OX40' hiirtelt, võrreldes Rag1" hiirtega, kellele süstiti metsiktüüpi hiirte CD4T-rakke. Lisaks vähendasid CD30OX40/kuvatud CD4 pluss T-rakud CCR6 ekspressiooni in vivo. CD30OX40*rakud olid selleks täielikult võimelised

diferentseerudes haigusi vahendavateks T-abistajarakkude alamhulkadeks, kuid näitas metsiktüüpi rakkudega võrreldes oluliselt vähenenud proliferatsiooni taset in vivo ja in vitro. CD30L ja OX40L vastaste antikehade blokeerimine leevendas nefrotoksilist seerumi nefriiti, mõjutamata pan-efektori või mälu T-rakkude populatsioone. Seega näitavad meie tulemused haiguse edendamist CD30 ja OX40 signaaliülekande kaudu, mis on tingitud T-rakkude liialdatud proliferatsiooni ja T-abistaja 17 rakkude migratsiooni hõlbustamisest nefrotoksilise seerumi nefriidi korral. Seega võib CD30 ja X40 signaaliradadele suunatud kaasstimulatsiooni blokaad pakkuda uudset ravistrateegiat autoimmuunhaiguste korral.neeruhaigus.

Tõlkeavaldus

Selles artiklis kirjeldatakse CD30 ja OX40 signaaliradade rakendatavust tulevaste terapeutiliste sihtmärkidena immuunkompleksi poolt vahendatud glomerulaarhaiguse korral, kasutades nefrotoksilise seerumi nefriidi hiire mudelit. CD30 ja OX40 kostimuleerivate radade kombineeritud blokaad on viis autoimmuunsuse perifeerse tolerantsuse saavutamiseks, vähendades patogeenset hüperproliferatsiooni sekundaarsetes lümfoidorganites ja patogeensete T-abistajarakkude 17 migratsiooni.neerud. Kuna traditsiooniliste ravivõimalustega kaasnesid tõsised kõrvaltoimed, võib kombineeritud CD30 ja OX40 blokaadi tulemuseks olla vähem eluohtlikke infektsioone võrreldes traditsiooniliste immunosupressiivsete ravimeetoditega.

Kostimuleeriv signaalimine on T-rakkude aktiveerimise, diferentseerumise, efektorfunktsiooni ja ellujäämise eeltingimus. Kostimulatsiooni blokeerimine on määratletud kui strateegia immuuntolerantsuse saavutamiseks. Lisaks Ig superperekonnale, sealhulgas CD28 ja B7, on kõige kostimuleerivad molekulid evolutsiooniliselt iidse ja väga konserveerunud tuumori nekroosifaktori (TNF) superperekonna liikmed." CD30 ja OX40 on TNF-i superperekonna põletikuvastased liikmed, mis mitte ainult ei jaga ühiseid signaaliülekandeteid, vaid toimivad ka funktsionaalselt sünergiliselt TNF retseptoriga seotud tegurid interakteeruvad rakusiseste retseptori piirkondadega ja soodustavad mõlemal juhul rakkude ellujäämist nu-dear factor-KB signaaliülekande kaudu CD30 ja OX40, aga ka nende ligandid CD30L ja OX40L võivad ekspresseerida T ja OX40L B-rakkudel ja mitmesugustel antigeeni esitlevatel rakkudel.

CD30 mängib kriitilist põletikueelset rolli hiire autoimmuunse diabeedi, koliidi ja entsefalomüeliidi korral.-1 Eksperimentaalsete mudelite uurimisel on leitud OX40 patogeenset rolli autoimmuunse uveiidi, artriidi ja allergilise põletiku korral,12-1 samas kui hiljutine aruanne pakkus välja OX40 / OX40L raja, mis kaitseb poolkuulise glomerulonefriidi eest, stimuleerides regulatiivset T-rakkude proliferatsiooni. Siiski on mõlemad molekulid sõltumatult seotud süsteemse erütematoosluupuse (SLE) patogeneesiga. Lahustuv CD30 on SLEl6,17a haiguse aktiivsuse marker ja OX40L haplotüüp on seotud haiguse suurenenud riskiga.8 Lisaks ekspresseerivad T-abistajarakud 17(Th17)rakud SLE-patsientidel suurenenud OX40 taset ja OX40 ekspressioon on tuvastatav luupusnefriidi perivaskulaarsetel leukotsüütidel.

Tõhusad ravivõimalused glomerulonefriidi raviks on seotud suurenenud haigestumuse ja suure kõrvaltoimete riskiga1; seega on vajalik konkreetsemalt suunatud ravi. Üha kasvav lähenemine immuunvastuste suunamisel on tolerantsuse esilekutsumine.] Perifeerse tolerantsuse saavutamiseks kasutatavad terapeutilised võimalused hõlmavad kloonide deletsiooni, teadmatust, immuunregulatsiooni ja lõpuks energiat, mis on juba osutunud väärtuslikuks immunosupressiivseks strateegiaks tsütotoksiliste T-lümfotsüütide korral. sisestati seotud valgu 4-lg liitvalgud.

OX40L blokaad on praegu kliinilises hindamises; CD30 ja OX40 kombineeritud sihtimist ei ole aga seni põhjalikult uuritud. CD4-sõltuv autoimmuunsus sõltub kriitiliselt mõlema retseptor-ligandi paari interaktsioonist, mida näitab vajadus kombineeritud CD30 ja OX40 signaalide tühistamises, et kaitsta kahvlipea kasti P3(FoxP3) puudulikkusega hiiri varajase surmava arengu eest. autoimmuunhaigus. Nefrotoksiline seerumi nefriit (NTS) on immuunkompleksi glomerulonefriidi hiire mudel, mis on osutunud rangelt sõltuvaks T-rakkudest, sealhulgas T-abistajarakkudest 1 (Th1) ja Th17 rakkudest. Antigeeni esitlus selles mudelis toimub peamiselt sekundaarsetes lümfoidorganites, aga ka lokaalseltneerud. Seega oletasime, et CD30 ja OX40 kostimuleerivate radade aktiveerimine soodustab arvatavasti NTS-i.

MEETODID Loomad

CD30OX407 topeltknockout hiired, kellel puudus CD30 ja OX40, loodi vastavalt eelnevalt kirjeldatule. CD30OX40-ja CD30OX40 plus /pesakonnakaaslased, samuti CD30~ ja OX40~ olid aretatud ettevõttesiseselt. CD30√-hiiri hankis ka Dr. Alert, Freiburg, Saksamaa. C57BL/6J hiired saadi ettevõttest Charles River Laboratories (Sulzfeld, Saksamaa). Ragland B6.Thyl.1 hiired saadi firmast Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Kõik hiired olid C57BL/6J taustal.

NTS mudel

NTS indutseeriti nagu eelnevalt kirjeldatud. Lühidalt, hiired eelimmuniseeriti subkutaanselt 2 mg/ml küüliku lgG-ga (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), mis oli lahustatud mittetäielikus Freundi adjuvandis (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) koos kuivatatud, mitteelujõulise Mycobacterium tuberculosis H37a (D,if) Detroit, MI) 3 päeva enne nefrotoksilise küüliku hiirevastase seerumi manustamist. Hindamine viidi läbi 4 või 14 päeva pärast NTS seerumi süstimist, nagu näidatud.

Rakkude ülekanne Rag{0}}/hiirtes

Rag{0}}hiirtele süstiti 1,5 × 10 kraadi CD4 pluss T-rakke kas metsikut tüüpi (WT) või CD30OX40--hiirte põrnadest või CD90.1 WT rakkudest ja CD90.2 knockout rakud adopteeritud vahekorras 1:1. Üks päev pärast adoptiivset ülekandmist indutseeriti NTS ja seda hinnati 4 või 14 päeva pärast. CD4 pluss T-rakud eraldati põrnadest, kasutades hiire CD4 pluss raku eraldamise komplekti (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Saksamaa).

Antikehakatsete blokeerimine

Nefriitilisi C57BL/6 hiiri raviti hiire OX40L(kloon RM134L) ja CD30L(kloon RM153) vastaste blokeerivate antikehadega kas kombinatsioonis või eraldi, alustades immuniseerimise päevast või 3 päeva pärast seda. NTSinduktsioon. Hiirtele süstiti ip kas 0,5 mg x-OX40L ja/või 0,5 mg a-CD30L monoklonaalseid antikehi või 1 mg kontroll-IgG (Sigma-Aldrich) 3 korda nädalas.

Uriini albumiini, kreatiniini ja supernatandi tsütokiini mõõtmine

Albumiini uriiniga eritumise määramiseks kasutati topeltkihiga ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (Abcam, Cambridge, MA), nagu varem teatatud (tuvastusvahemik, 0.781-200 ng/ml). Uriini kreatiniini määrati fotomeetriliselt, kasutades kaubanduslikult saadavat pikriinhappel põhinevat komplekti (Sigma-Aldrich). Tsütokiinide tuvastamine supernatantides viidi läbi nagu on näidatud täiendavates meetodites.

Autoloogsete antikehade vastuse hindamine

Plaate inkubeeriti üleöö 100 ug/ml küüliku IgG-ga (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Seejärel inkubeeriti seerumit tsirkuleeriva hiire küülikuvastase Ig tuvastamiseks kahekordistatavates lahjendustes. Kasutades mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud kitse hiirevastast IgG-d (Jackson ImmunoResearch Laboratories), tuvastati hiire küülikuvastane IgG.

Vere uurea lämmastik

Vere uurea lämmastik

Seerumi (BUN) tasemed saadi kaubanduslikult saadava BUN-i kolorimeetrilise tuvastamise komplekti (Invitrogen) abil.

Histopatoloogia ja immunopatoloogia hindamine

Perioodilise happega (PAS) värvimise hindamineneerudlõigud tehti nii, nagu on kirjeldatud eelnevalt 1, 2 ja täiendavates meetodites.

Kudedesse infiltreeruvate rakkude hindamiseks kasutati 3-kihilist immunoperoksidaasi värvimise tehnikat (täiendavad meetodid).

Immunofluorestsents ja konfokaalne mikroskoopia

Külmutatud koeproovid värviti fluorestseeruvalt märgistatud antikehadega (täiendavad meetodid) ja hinnati LSM510 metaga (Zeiss, Oberkochen, Saksamaa).

Joonis 1| Nefrotoksilise seerumi nefriidi (NTS) korral ekspresseeritakse põrna leukotsüütidel erinevalt CD30, OX40, CD30 ligandi (CD30L) ja OX40 ligandit (OX40L). CD30, OX40, CD30L ja OX40L ekspressioon CD4 pluss T-rakkudel tervetel ja nefriitilistel C57Bl/6J hiirtel 12 tunni, 24 tunni, 72 tunni, 7 päeva ja 14 päeva pärast NTS-i (n =5 hiirt/ Vastavate retseptorite ja ligandide ekspressiooni hinnati (a) CD4 pluss T-rakkudel, (b) CD8T-rakkudel, (c) B-rakkudel, (d) CD11 cdendriitrakkudel, (e) CD11bLv6G pluss SSChi neutrofiilidel, (f）CD11btLy6GCD115). pluss Ly6C pluss klassikalised monotsüüdid ja (g) CD11btLy6G-CD115 pluss Ly6C mitteklassikalised monotsüüdid.Kõik andmed näitavad mediaan- ja interkvartiilseid vahemikke. Esitatakse statistiline olulisus võrreldes tervete hiirtega.*P<><><0.001,><>

Voolutsütomeetria

Punaste vereliblede lüüs, kasutades 1 × RBC lüüsipuhverlahust (eBioscience), viidi läbi vereproovidega, enne kui verest, põrnast ja lümfisõlmedest saadi üherakuline suspensioon, kasutades {{2}um rakusõela. Rakkude isoleerimineneerudviidi läbi Percolli tihedusgradiendi tsentrifuugimisega pärast peeneks hakitud tüki seedimistneerudRoswell Park Memorial Institute 1640 söötmes (Thermo Fisher Scientific), millele on lisatud kollagenaas D ja DNAase I 37 kraadi juures, nagu eelnevalt kirjeldatud.

Voolutsütomeetria värvimised ja hindamised viidi läbi nagu on kirjeldatud täiendavates meetodites.

CD4 pluss T-rakkude proliferatsiooni test

CD4 pluss T-rakke inkubeeriti Celltrace Violet'iga (CellTrace Violet Cell Proliferation Kit; Invitrogen) vastavalt tootja protokollile ja külvati kontsentratsiooniga 2,5 × 10/ml inkubeerimiseks kas 5 ug/ml koncanavaliin-A-ga (Sigma-Aldrich) või 5 ug/ml fütohemaglutiniini (Sigma-Aldrich). 7 päeva pärast kasutati nendes rakkudes Celltrace Violet'i intensiivsuse hindamiseks voolutsütomeetriat.

Splenotsüütide stimulatsioon

Isotüübi antikehadega või xCD30LxOX40L antikehadega töödeldud nefriithiirte splenotsüüdid koguti pärast 14-päevast NTS-i. Splenotsüüdid külvati kontsentratsiooniga 2 × 10% /ml küüliku IgG-ga eelnevalt kaetud süvenditesse ja neid stimuleeriti uuesti 24 tundi enne voolutsütomeetriat. Nefriitiliste WT ja CD30OX40~ hiirte (14. päev) splenotsüüdid külvati 2 x 1097 ml ja stimuleeriti xCD3 (5 ug/ml) ja xCD28 (1 ug/ml) (mõlemad eBioscience'ist) 3 päeva enne rakukultuuri supernatandi hindamist. .

CD4 pluss T-rakkude polarisatsioonikatsed

CD4 pluss CD62L pluss T-rakud eraldati põrnadest, kasutades CD4 pluss CD62L pluss isolatsioonikomplekti II (Miltenyi Biotec) ja stimuleeriti, nagu on näidatud täiendavates meetodites.

Pöördtranskriptsioon reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon Kogu RNA ekstraheeriti lümfisõlmedest janeerudkasutades TRI reagenti (Sigma-Aldrich) ja seejärel sünteesiti cDNA, kasutades Superscript II Transcription Kit (Invitrogen) ja juhuslikke praimereid (Invitrogen) 2 ug kogu RNA pöördtranskriptsiooniks. Reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon viidi läbi kahes eksemplaris CFX96 reaalajasüsteemis (BioRad, Hercules, CA). TaqMan geen

Joonis 2| CD30OX40- hiired on kaitstud nefrotoksilise seerumi nefriidi (NTS) eest. CD30OX40-/-hiirtele, CD30 ühekordse knockout-ga hiirtele ja OX40 ühekordse knockout-ga hiirtele, samuti metsikut tüüpi (WT) kontrollrühmadele (n =5-6 hiirt rühma kohta) rakendati 14 päeva NTS-i Hinnati (a) albuminuuriat ja (b) seerumi uurea lämmastiku (BUN) taset. (ce) Tüüpiline perioodiline happe-Schiffi (PAS) värvimineneerud, samuti on näidatud PAS-i skoor, (f) poolkuu skoor, (g) intralaminaarsete trombide skoor, (h) torukeste moodustumine ja (i) ägeda torukujulise vigastuse skoor. () Esitatakse neerude kaudu infiltreeruvad CD68 pluss T-rakud, (k) neutrofiilid, () CD4T-rakud ja (m) CD8 pluss T-rakud. Rakkude koguarvu ja CD45 pluss CD4 T-rakkude arvu (n) lümfisõlmedes ja (o) WT ja CD30OX40-/-hiirte põrnas hinnati voolutsütomeetria abil. (p) Neeru leukotsüütide koguarv voolutsütomeetriaga hinnatud ja (g) CD4 pluss T-rakkude, CD8 pluss T-rakkude, Ly6G pluss SSChi neutrofiilide, Ly6C pluss monotsüütide ja Ly6C monotsüütide protsendidneerudCD30OX40 ja W hiirtel. (r) Hinnati hiire küülikuvastast lgG-d (n=10 hiirt rühmas). (s) Näidatud on nefriitilise WT (n=7 hiirt) ja CD30OX40-/ (n =5 hiirt) CD4 pluss CD28 pluss rakkude/lümfisõlmede koguarv. Algne suurendus ×40. Andmed näitavad (a,b,r,s) keskmist ± SEM; (c,fg) mediaanid on tähistatud horisontaalse joonega. Andmed esindavad 4 sõltumatut katset. Statistilised olulisused on esitatud võrreldes WT hiirtega.*P<><0.01,><0.001,and>< 0.0001.hpf,="" high-power="" field;="" od,="" optical="" density.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">

Kasutati ekspressiooniteste (Applied Biosystems, Foster City, CA) ja SYBR rohelist (BioRad) (täiendavad meetodid).

Statistiline analüüs

Kõik statistilised hinnangud (täiendavad meetodid) viidi läbi, kasutades GraphPad Prism 6.0 Macintoshi jaoks (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Eetikaavaldus

Kõik loomkatsed kiitis heaks Austria ministeeriumi loomkatsete eetika komitee (BMWFW-66.010/0054-WF/V/3b/2015).

TULEMUSED

CD30 ja OX40 ja nende ligandide ekspressioon muutub NTS aja jooksul kaasasündinud ja adaptiivse immuunsusega rakkudel CD30 ja OX40 ekspressioon suurenes põrna CD4 pluss T-rakkudel NTS aja jooksul (joonis la). Nii CD30L kui ka OX40L ekspressioonitasemed suurenesid 7 ja 14 päeva pärast märkimisväärselt nefriitiliste hiirte põrna CD4 pluss T-rakkudes (joonis la). CD4 * CD25 Foxp3 pluss regulatiivsetel T-rakkudel (Tregs) leiti aja jooksul sarnane CD30, CD30L ja OX40 ekspressiooni suurenemine (täiendav joonis S1A). CD30, OX40 ja OX40L suurenesid märkimisväärselt Th17 rakkudel (täiendav joonis S1D) pärast 14-päevast NTS-i, võrreldes tervete hiirtega. Samuti suurenesid CD30 ja OX40 märkimisväärselt CD8 T-rakkudel, alustades 12 tundi pärast NTS-i indutseerimist, võrreldes tervete hiirtega (joonis 1b). B-rakkudel oli sarnane ekspressiooniprofiil kui CD4 pluss T-rakkudel (joonis 1c). OX40L reguleeriti alla juba pärast 12-tunnist NTS-i ja jäi seejärel dendriitrakkudel vähenema (joonis 1d). Sarnaselt olid CD30L ja OX40L alla-CD11b pluss Ly6G pluss SSChineutrofiilid, mida reguleeriti Ly6G-CD115 pluss Ly6Ct ja Ly6G-CD115Ly6C monotsüütidega NTS aja jooksul (joonis jalg). Neutrofiilidel kaldusid dendriitrakkude ja monotsüütide CD30 ja OX40 NTS-is suurenema (joonis ld-g). CD30L ekspresseeriti üha enam 2. tüüpi kaasasündinud lümfoidrakkudel 12 tundi pärast NTS indutseerimist ning CD30L ja OX40L suurenesid ka pärast 14-päevast NTS-i (täiendav joonis S1B). CD30, CD30L, OX40 ja OX40L ekspresseerivate leukotsüütide arv suurenes NTS-is, mis oli kooskõlas põrnarakkude leidudega (täiendav joonis SIE-G). Cd30 ja Ox40l mRNA ekspressioon ei olnud tuvastatavneerudpärast 7 ja 14 päeva NTS-i (täiendav joonis S1H). Kuid Cd30l mRNA suurenes pärast 7 ja 14 päeva NTS-i, samas kui Ox40 mRNA ekspressioon jäi muutumatuks pärast 14-päevast NTS-i.neerud(täiendav joonis S1H).

NTS-fenotüübi arendamiseks on vajalik vastastikune CD30 ja OX40 signaalimine

Leiame albuminuuria ja BUN vähenemise nefriitilistel CD30OX40-/ hiirtel võrreldes WT kontrollidega (joonised 2a ja b), samas kui albuminuuria CD30- ja OX40- hiirtel oli võrreldav WT kontrollhiirtega (Joonis 2a). Märkimisväärset langust täheldati ka aastalneerudPAS-i positiivsus, poolkuu moodustumine, intraluminaalsete trombide skoor, torukeste moodustumine ja ägeda torukujulise vigastuse skoor CD30OX40-/hiirtel võrreldes WT hiirtega (joonis 2c-i). Kõik need histoloogilised tunnused ei muutunud üksikutel knockout hiirtel WT kontrollidega võrreldes oluliselt (joonis 2c ja fi). Leidsime CD30OX40-- hiirte neerudes oluliselt väiksema CD68 makrofaagide arvu võrreldes WT kontrollidega (joonis 2j). Ilmnes suundumus nende arvu vähenemiseleneerud-infiltreeruvad CD68 pluss makrofaagid CD30- ja OX40-/- ühekordse knockoutiga hiirtel (joonis 2j). Neutrofiilid ja CD8 T-rakud leiti oluliselt väiksemas arvus aastalneerudCD30OX40- hiirtel, võrreldes nefriitiliste WT kontrollidega ning CD30-- ja OX40- hiirtega, oli väiksem neutrofiilide ja C8 pluss T-rakkude arv, mis imbusid neerudesse (joonis 2k ja m). CD4 pluss T-rakke leiti nefriidi korral oluliselt vähemneerudCD30OX40--(joonis 2l). Neerude voolutsütomeetria näitas sarnaseid tulemusi infiltreeruvate rakkude arvu vähenemise kohta (joonis 2p ja q). Pange tähele, et naiivsetel ühe- ja kahekordse väljalangemisega hiirtel ei ilmnenud põrna leukotsüütide koostises mingeid erinevusi võrreldes tervete WT hiirtega, kui hinnati CD4 pluss ja CD8 pluss T-rakke, neutrofiile ja monotsüüte (täiendav joonis S2). Icos ja Gitr ekspressioon vähenesneerudnefriitiliste CD30OX40-hiirte (täiendav joonis S3B). B-raku vastused, mõõdetuna hiire küülikuvastase IgG-ga, vähenesid CD30OX40- hiirtel võrreldes WT kontrollidega (joonis 2r).

CD4 pluss T-rakkude arv ei vähene CD30OX40-/-hiirte lümfisõlmedes

Voolutsütomeetria ei näidanud erinevust kogu lümfisõlmede ja põrna rakulisuses (joonis 2n ja o) ega CD4 pluss rakkude arvus. Huvitaval kombel ei tuvastanud me ka WT ja CD30OX40- hiirte Tregide erinevusi (täiendav joonis S3). Tsütokiinid (TNF-d, interleukiin-6, interferoon-Y, interleukiin-17, interleukiin-4 ja interleukiin-10) mõõdeti taasstimuleeritud splenotsüütide supernatantides, mis on eraldatud WT- ja CD30OX{12}}hiired 14 päeva pärast NTS-i ei näidanud erinevust (andmeid pole näidatud).

CD30 ja OX40 puudulikud CD4 pluss T-rakud ei soodusta NTS-i Et uurida CD30 ja OX40 ekspressiooni rolli CD4 pluss rakkudel NTS-is, süstiti Rag{6}} CD4 pluss rakke (täiendav joonis S4) kummagi põrnast. WT või CD30OX{10}}hiirte kohta. Põrna CD4 pluss rakkude koguarv ja surnud rakkude määr olid võrreldavad 4. päeval pärast NTS indutseerimist (täiendav joonis S5). Kuigi Rag1~ hiirtel, kes said WT hiirtelt CD4 pluss rakke, tekkis pärast 14-päevast NTS-i märkimisväärne albuminuuria ja BUN, siis CD30OX40 hiirtelt saadud CD4 pluss rakkudega taastatud Rag1-/ hiirtel (joonis 3a) mitte. Histoloogiline kahjustus vähenes märkimisväärselt Ragl1-hiirtel, kes said CD30OX40-- hiirtelt CD4 pluss T-rakke, võrreldes WT-rakkudega, määratuna PAS-skoori, poolkuu skoori, intraluminaalsete trombide skoori, ägeda tubulaarse vigastuse skoori, ja torukujulised valud (joonis 3b-g). Rakud infiltreeruvadneerudRagl-hiirte, sealhulgas CD4 pluss rakkude, CD68 makrofaagide ja Ly6G pluss neutrofiilide arv vähenes samuti oluliselt, kui ülekantud CD4 pluss rakud ei ekspresseerinud CD30 ja OX40 (joonis 3h-k). CD4 pluss T-rakud, mis eraldati CD90 ekspresseerivatest WT hiirtest .1 ja CD30OX40- hiired, kes ekspresseerisid CD90.2, kanti edasi Rag1-/hiirtele vahekorras 1:1. Siin vähenes CD90.2 ekspresseerivate CD30OX40-- CD4 pluss T-rakkude absoluutarv põrnas võrreldes CD90.1 WT CD4 pluss T-rakkudega (joonis 4t ja u), kuid Ifn-Y protsendid (joonis 4a) ja b), l4 (joonis 4d ja e) ja Il17 (joonis fig 4g ja h) tootvad rakud olid oluliselt kõrgemad CD90.2 ekspresseerivates knockout rakkudes. Kuid samal ajal leiti, et CD90.2 knockout rakkude protsendil on neerudes Th17 fenotüüp võrreldes CD90.1 WT rakkudega (joonis 4i), samas kui The ja T abistajaraku 2 (Th2) puhul leiti vastupidine. ) rakud sisseneerud(Joonis 4c ja f). Siiski on ülekantud CD90.2 knockout rakkude absoluutarvudneerudolid oluliselt madalamad võrreldes CD90.1 WT rakkudega (andmeid pole näidatud).

CD30 ja OX40 puudulikkus häirib Th17 migratsiooni sekundaarsetest lümfoidorganitest neerudesse

CXC kemokiini retseptor (CXCR)3 (joonis 4j ja k) suurenes CD90.2 CD30OX40-/- rakkudel võrreldes CD90.1 WT rakkudega, samas kui CXCR6 (joonis 4l ja m) ekspressioonis erinevusi ei tuvastatud . Veelgi olulisem on see, et leidsime CC kemokiini retseptori (CCR) 6 olulise vähenemise CD90.2 knockout rakkudel (joonis 4n ja o). Järgmises etapis stimuleeriti naiivseid CD4 pluss T-rakke in vitro Th1 või Th17 diferentseerumistingimustes. Täiendav joonis S6). Täheldasime CD30OX40-/- hiirtelt eraldatud naiivsete CD4 pluss T-rakkude suuremat potentsiaali Th17 (joonis 5a ja) ja Th1 diferentseerumise (joonis 5c ja d) poole, võrreldes WT hiirtega in vitro. Eelkõige leiti, et CD28 ekspresseerivate CD4 pluss T-rakkude arv on oluliselt suurenenud

Joonis 3| Rag1-/ hiired, kes saavad CD4 pluss T-rakke CD30OX40-/on kaitstud nefrotoksilise seerumi nefriidi (NTS) eest. Rag1-/hiirte kohta, kes saavad CD4 T-rakke mõlemalt metsiktüübilt (WT) ) või CD30OX40-hiirtele tehti NTS ja neid jälgiti 14 päeva (n =6 kuni 7 hiirt rühmas).(a) Hinnati albuminuuriat ja vere uurea lämmastiku (BUN) taset seerumis.( e) Tüüpiline perioodiline happega värvitud Schiffi (PAS) värvimineneerudsamuti on näidatud (b) PAS-i skoor, (C) poolkuu skoor, (d) trombide skoor, (t) torukujulised kiibid ja (g) ägeda torukujulise vigastuse skoor. (h) CD4T-rakkude arv (i)CD68 pluss makrofaagid ja (j) Ly6Gt neutrofiilid ning (k) tüüpilised pildid on näidatud. Algne suurendus × 40 (PAS, CD4, [jätkub] arvud nefriitiliste CD30OX40- lümfisõlmedes hiirte kohta võrreldes WT hiirtega (joonis 2s).

Palun klõpsake siin 2. osa juurde