Xican Li 1,2,*,† ID , Yulu Xie 1,2,†, Ke Li 3,4, Aizhi Wu 1,2,*, Hong Xie 1,2, Qian Guo 1,5,

Penghui Xue 1, Yerkingul Maleshibek 1, Wei Zhao 6, Jiasong Guo 7 ja Dongfeng Chen 3,4

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

1 Hiina ravimtaimede kool, Guangzhou Hiina meditsiini ülikool, Guangzhou 510006, Hiina; xieyulu1900@163.com (YX); xiehongxh1@163.com (HX); 15622178307@163.com (QG); 15228738137@163.com (PX); pandiphd@163.com (YM)

2 Guangzhou Hiina Meditsiini Ülikooli TCM-i uuenduslik uurimis- ja arenduslabor,

Guangzhou 510006, Hiina

3 Meditsiini põhiteaduste kool, Guangzhou Hiina meditsiini ülikool, Guangzhou 510006, Hiina; ys1090992678@163.com (KL); chen888@gzucm.edu.cn (DC)

4 Guangzhou Hiina meditsiini ülikooli integreeriva põhimeditsiini uurimiskeskus,

Guangzhou 510006, Hiina

5 Meditsiiniteaduste põhikool, Guangdongi Farmaatsiaülikool, Guangzhou 510007, Hiina

6 Zhongshani meditsiinikool, Sun Yat-seni ülikool, nr 74 Zhongshan Road. 2, Guangzhou 510080, Hiina; zhaowei23@mail.sysu.edu.cn

7 Southern Medical University histoloogia ja embrüoloogia osakond, Guangzhou 510515, Hiina;

† Need autorid panustasid sellesse töösse võrdselt.

Saabunud: 24. jaanuar 2018; Vastu võetud: 20. veebruar 2018; Avaldatud: 23. veebruaril 2018

Abstraktne: Uuringus püüti uurida suhkrujääkide rolli ja fenooli mehhanismefenüülpropanoidantioksüdandid. Akteosiid, koos selle apiosiidiga forsütosiidiga B ja ramnosiidiga

poliumosiidi, uuriti võrdlevalt erinevate antioksüdantsete testide abil. Kolmes elektroniülekandel (ET) põhinevas testis (FRAP, CUPRAC, PTIO·-püüdmine pH 4,5 juures) määrati suhteline antioksüdantide tase ligikaudu järgmiselt.akteosiid >forsütosiid B > poliumosiid. Sellist korda täheldati ka aastal

H pluss ülekandega seotud PTIO·- püüdmise test pH väärtusel 7,4 ja kolme mitme rajaga radikaali püüdmise testis, st ABTS pluss ·-püüdmine, DPPH·-püüdmine ja ·O2-püüdmine. UV-spektrites näitas igaüks neist punanihket 335 364 nm juures ja kahte nõrka piiki (480 ja 719 nm), kui neid segati Fe2 plussiga; Kuid,akteosiidandis nõrgima imendumise.

Ultraperformance-vedelikkromatograafias, mis on ühendatud elektropihustusionisatsiooni kvadrupool-lennuaja tandem-massispektromeetria (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS) analüüsiga, ei leitud radikaali-addukti moodustumise (RAF) piiki. MTT test näitas, et poliumosiidil oli oksüdatiivse stressiga luuüdist pärinevate mesenhümaalsete tüvirakkude elujõulisus kõrgeim. Kokkuvõtteks,akteosiid, forsütosiid B ja poliumosiid võivad antioksüdantse toime avaldamiseks osaleda mitmel viisil, sealhulgas ET, H pluss ülekandmine või Fe2 pluss kelaatimine, kuid mitte RAF. ET ja H pluss ülekannet võivad takistada ramnosüül- ja apiosüülfragmendid; Fe2 pluss kelaatimise potentsiaali saab aga suurendada kahe suhkrujäägi (eriti ramnosüüli osa) abil. Ramnosüül- ja apiosüülrühmade üldine toime seisneb antioksüdantsete või tsütoprotektiivsete toimete parandamises.

Märksõnad:akteosiid; apiosüül; forsütosiid B;fenüülpropanoidglükosiidid; polüumosiid; ramnosüül

cistanche'il on oksüdatsioonivastane toime

1. Sissejuhatus

Hiljuti akteosiid (verbaskosiid, joonis 1), fenoolfenüülpropanoidglükosiidleiti, et verbeni ja teiste taimede [1] esinemine parandab koerte somaatiliste rakkude tuumaülekande (SCNT) efektiivsust koerte kloonimise käigus [2]. Lisaks võib akteosiid kaitsta inimese neuroblastoomi SH-SY5Y rakke amüloidist põhjustatud kahjustuste eest [3] ja inimese naha fibroblaste röntgenkiirguse poolt põhjustatud kahjustuste eest [4]. Selle apiosiidi forsütosiid B (joonis 1) levib ka taimedes [5] ja on täheldatud, et sellel on tugev neuroprotektiivne toime soodsa terapeutilise ajaaknaga [6]. Arvatakse, et need kasulikud mõjud rakkudele ja kudedele on seotud mõnede biomolekulide, näiteks lipiidide ja DNA kaitsega. Tegelikult on tõestatud, et akteosiid ja selle analoog tsistanosiid F pärsivad mitokondriaalset lipiidide peroksüdatsiooni rottidel [7]. Lipiidide peroksüdatsioon on teadaolevalt rakkude oksüdatiivse stressi ja lõpuks reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) tagajärg.

Joonis 1. Kolme loodusliku struktuuri (vasakul) ja eeliskonformatsioonil põhinevad palli-pulga mudelid (paremal)fenüülpropanoidglükosiidid(akteosiid, forsütosiid B ja poliumosiid).

DNA kaitse aspektist võib akteosiid ja selle derivaadid kiiresti parandada DNA radikaale, nagu 2'-desoksüadenosiin-5'-monofosfaat (dAMP) ja 2'-desoksüguanosiin-5'-monofosfaat (dGMP) [ 8]. Need sekundaarsed desoksünukleotiidradikaalid võivad rakke veelgi oksüdatiivselt kahjustada, põhjustades mutageneesi ja kantserogeneesi [9]. Biofüüsikaline uuring näitas, et akteosiid ja selle derivaadid võivad dokkida DNA väiksematesse soontesse ja kiiresti parandada selliseid oksüdatiivseid DNA kahjustusi [10]. Eelistatud konformatsioonil põhinev kuulpulgamudel pakub (joonis 1, paremal), et need molekulid on piklikud ja võivad kergesti jõuda DNA ahelasse ning seega suudavad nad kiiresti parandada DNA radikaalide kahjustusi [8].

Kuid biokeemia seisukohast toimub parandus põhiliselt ROS-i eemaldamise (st antioksüdantide) raja kaudu. Nagu eelnevalt mainitud, tekivad desoksünukleotiidradikaalkatioonid lõpuks ROS-i, sealhulgas vabade radikaalide (nt ·OH-radikaal [11]) ja oksüdeerivate molekulide (nt H2O2 [12]) rünnakust. Arvatakse, et ROS-i eemaldamine vähendab tõhusalt rakkude oksüdatiivset seisundit [13, 14] ja parandab tüvirakkude kvaliteeti [12, 15]. Seetõttu on vaja uurida nende antioksüdantset võimet ja täiendavalt arutada võimalikke mehhanisme.

Selles uuringus kolm fenoolsetfenüülpropanoidglükosiidid(akteosiid, forsütosiid B ja poliumosiid) uuriti võrdlevalt, kasutades erinevaid antioksüdantide teste, sealhulgas 2-fenüül-4,4,5,5-tetrametüülimidasoliin-1-oksüül{{6}. }}oksiidradikaali (PTIO·) eemaldamise test, raud(III)ioonide redutseeriva antioksüdandi võimsuse (FRAP) test, vaski redutseeriva antioksüdantide võime (CUPRAC) test, 2,2→-asino-bis(3-etüülbenseen-tiasoliin{{13) }}sulfoonhappe radikaali (ABTS plus ·) eemaldamise test,

1,1-difenüül-2-pikrüülhüdrasiini (DPPH·) test ja ·O2-püüdmisanalüüs, samuti Fe2 pluss kelaativa UV-spektri analüüs. Seejärel määrati nende reaktsioonisaadused DPPH·-ga, kasutades üliefektiivset vedelikkromatograafiat koos elektropihustusionisatsiooni kvadrupool-lennuaja tandem-massispektromeetriaga (UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS). Lõpuks hinnati nende tsütoprotektiivset toimet luuüdist pärinevatele mesenhümaalsetele tüvirakkudele (bmMSC-d), kasutades

3-(4,5-dimetüültiasool-2-üül)-2,5-difenüüli (MTT) test. Nagu on näha jooniselt 1, on erinevus kolme fenooli vahelfenüülpropanoidglükosiidid(st akteosiid, forsütosiid B ja poliumosiid) on glükosiiditüüp: forsütosiid B on akteosiidi apiosiid, samas kui poliumosiid on akteosiidi ramnosiid. Seega aitab see võrdlev uuring mõista ka apiosüüli ja ramnosüüli rolliantioksüdantmõjusid.

Tistanche valgendav toime nahale kuni antioksüdatsioonini

2. Tulemused

2.1. Metalli redutseerimise testid (FRAP ja CUPRAC)

Uuringus viisime läbi kaks metalli redutseerivat analüüsi, st FRAP-testi ja CUPRAC-testi. Nagu on näidatud väljaandes Suppl. Nagu on näidatud joonisel 1, suurendasid akteosiid ja selle derivaadid annusest sõltuval viisil suhtelist FRAP-i (või Cu2 pluss-redutseeriva võimsuse) protsenti 0–10 g/l juures. Nende suhteliste metallide redutseerivate tasemete järjekord vähenes ligikaudu järjekorras akteosiid> forsütosiid B> poliumosiid (tabel 1).

Tabel 1. Akteosiidi, forsütosiidi B ja poliumosiidi IC50 väärtused erinevatesantioksüdandidanalüüsid.

2.2. PTIO·-Scavenging Assay

Meie laboratoorium töötas hiljuti välja PTIO·-püüdmisanalüüsi [16]. Seda saab kasutada antioksüdantide taseme hindamiseks ja antioksüdantide radade uurimiseks. Nagu näidatud Suppl. 1, võib akteosiid ja selle derivaadid edukalt eemaldada PTIO· pH 4,5 ja pH 7,4 juures. Kuid vastavalt tabelis 1 toodud IC50 väärtustele olid nende suhtelised PTIO·-püüdmistasemed sama pH väärtuse juures üksteisest erinevad. Samuti ilmnesid igal akteosiidil ja selle derivaatidel erinevad PTIO· eemaldamise tasemed vahemikus pH 4,5 kuni pH 7,4. Üldiselt olid PTIO· eemaldamise tasemed 7,4 juures kõrgemad kui pH 4,5 juures.

2.3. ABTS plus ·-pühkimis- ja DPPH·-pühkimisanalüüsid

ABTS plus ·-püüdur ja DPPH-püüdur on nüüd laialdaselt kasutusel puhaste ühendite või ekstraktide antioksüdantide uuringutes. Nagu näha Suppl. Nagu on näidatud joonisel 1, suurendasid akteosiid ja selle derivaadid sõltuvalt kontsentratsioonist ABTS pluss ·-püüdmis- või DPPH-puhastusprotsenti.

Kuid tabelis 1 toodud IC50 väärtuste osas leiti nende suhteline ABTS pluss ·-püüdmistasemed järjestuses: akteosiid > forsütosiid B > poliumosiid > Trolox. Sarnast järjestust võis täheldada ka DPPH·-püüdmise testis.

2.4. DPPH· reaktsiooniproduktide UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS analüüs

DPPH· reaktsiooniprodukt iga kolmegafenüülpropanoidglükosiididuuriti UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS analüüsi abil. Analüüsis (lisa 2) ei andnud ükski kolmest fenüülpropanoidglükosiidist RAF-i produkti piiki. Võrdluseks leiti, et kofeiinhape annab dimeerse produkti (m/z 359–360, lisa 2).

2.5. Fe2 pluss kelaativate toodete UV-vis-spektri analüüs

Kuna UV-vis-spektrid võivad iseloomustada metallikomplekse, kasutati uuringus UV-vis-spektreid, et analüüsida võimalikku Fe2 pluss kelaatimise reaktsiooni kolmega.fenüülpropanoid glükosiidid. Nagu on näidatud joonisel 2, võib igaüks neist tekitada UV-spektrites batokroomse nihke (335 nm ● 364 nm). Samal ajal võib igaüks neist anda kaks nõrka vis-spektri piiki nähtavates spektrites (480 nm ja 719 nm) ja viia helerohelise välimuseni. Siiski oli piigi intensiivsus kahanevas järjekorras: poliumosiid> forsütosiid B> akteosiid.

2.6. Pürogallooli autooksüdatsiooni test superoksiidi anioonide (·O2.) eemaldamiseks

Meie labor täiustas pürogallooli autooksüdatsiooni testi 2012. aastal [17]. Seda kasutati käesolevas uuringus ·O2 eemaldamise potentsiaali hindamiseks. Nagu näha Suppl. Nagu on näidatud joonisel 1, võivad kõik akteosiid ja selle derivaadid annusest sõltuvalt suurendada ·O2 eemaldamise protsenti. Siiski vähenes suhteline bioaktiivsus vastavalt tabelis 1 toodud IC50 väärtustele järjestuses poliumosiid > forsütosiid B > akteosiid.

2.7. Tsütoprotektiivne toime oksüdatiivse stressiga bmMSC-dele (MTT test)

Akteosiidi ja selle derivaatide tsütoprotektiivse toime hindamiseks viisime läbi MTT testi. Analüüsis kahjustas bmMSC-sid oksüdatiivne reagent H2O2, seejärel töödeldi kahjustatud bmMSC-sid akteosiidi ja selle derivaatidega. Suhtelise tsütoprotektiivse toime hindamiseks kasutati A490nm väärtusi. Nagu on näha tabelist 2, suurendasid iga akteosiid ja selle derivaadid annusest sõltuvalt A490 nm väärtusi. Samal kontsentratsioonil andis poliumosiid aga kõrgeimad A490nm väärtused.

3. Arutelu

Teadaolevalt osaleb looduslike fenoolsete ühendite antioksüdantne toime elektronide ülekandes (ET) [18,19]. Seega on fenoolide antioksüdantide taseme hindamiseks laialdaselt kasutatud mõnda ET-põhist metalli redutseerivat analüüsi, näiteks FRAP- ja CUPRAC-teste. FRAP analüüsi juhised peavad olema täidetud pH väärtusega alla 3,6. Selline happeline keskkond on edukalt pärssinud fenoolide H pluss ionisatsiooni; seega peetakse FRAP testi pelgalt ET protsessiks [20,21]. Akteosiidi ja selle derivaatide tõhusus FRAP-testis tähendab, et kui akteosiidi ja selle derivaadid toimivadantioksüdandid, võivad nad oma antioksüdantse toime avaldamiseks kasutada ET rada.

Lisaks teostasime ka CUPRAC-testi pH 7,4 puhvris. Nagu näha Suppl. Nagu on näidatud joonisel 1, suurendasid akteosiid ja selle derivaadid annusest sõltuvalt nende Cu pluss vähendava võimsuse protsenti, mis näitab, et nad võivad füsioloogilise pH juures jääda ET potentsiaaliks. Kuid nende ET potentsiaalid vähenesid järgmises järjekorras: akteosiid > forsütosiid B > poliumosiid (tabel 1). See dünaamika viitab selgelt sellele, et apiosüülfragment forsütosiidis B ja ramnosüülfragment poliumosiidis alandasid ET potentsiaali.

cistancheon türosinaasi inhibiitor

Et testida võimalust, et ET esineb nende radikaale püüdvate protsesside käigus, võeti uuringus kasutusele hapnikukeskne vaba radikaal PTIO·. Tsüklilise voltammeetria tõendid näitasid, et PTIO· eemaldamine alla pH 5.0 on üksik elektron-redoksreaktsioon [22]. Tähelepanu, et akteosiid ja selle derivaadid võivad tõhusalt eemaldada PTIO-radikaali pH väärtusel 4,5, viitab ET võimalusele nende radikaalide eemaldamise protsesside ajal. Ilmselgelt toetab see leid veelgi eelnimetatud FRAP-i ja CUPRAC-testide tulemusi ning varasemaid tulemusi, et loovutav elektron (e) on fenooli omadus.antioksüdandid[23]. Füsioloogilise pH väärtuse 7, 4 korral ei ole PTIO-pühkimise essee aga pelgalt ET rada, vaid sisaldab ka prootonite (H pluss) ülekanderada. Protsessi ajal on PTIO-l soovitatud aktsepteerida fenoolidest H pluss, et saada produkti piigi ([PTIO-H] pluss) [16]. Kuna H pluss -ülekandega kaasneb alati ET astmeliselt või sünkroonselt [24], on realistlik (või lõpp) saadus [PTIO-H] molekul [22]. PTIO· eemaldamine pH väärtusel 7,4 (lisa 1) tähendab, et akteosiidil ja selle derivaatidel on samuti H pluss -ülekandepotentsiaal. IC50 väärtused (tabel 1) näitasid, et

suhtelised H pluss -ülekandepotentsiaalid olid akteosiid > forsütosiid B > poliumosiid kahanevas järjekorras. Ilmselgelt nõrgendasid apiosüül- ja ramnosüülfragmendid ka H pluss -ülekandepotentsiaali antioksüdantse protsessi ajal.

Nagu eelnevalt mainitud, kaasneb fenoolide antioksüdantse protsessi käigus ET-ga tavaliselt prootoni (H pluss) ülekanne, moodustades mitu antioksüdantset mehhanismi [24], näiteks vesiniku-aatomi ülekanne (HAT) [23,25–27], järjestikused elektronid. -prootonite ülekanne (SEPT) [26,27], järjestikune prootonikaoga üheelektroniülekanne (SPLET) [26] ja prootoniga seotud elektronide ülekanne (PCET) [24–26,28].

Näiteks on hiljuti tõestatud, et H pluss tasemed on mõjutanud ABTS pluss ·-scavenging, reaktsiooni, kus domineerib ühe elektroni ülekanne (SET) [29]. ABTS plus ·-scavenging on seetõttu mitmel rajal põhinev antioksüdantide test [21,31]. Asjaolu, et akteosiid ja selle derivaadid võivad hävitada ABTS plus · radikaale, näitab, et nende antioksüdantset toimet võib vahendada ka mitmel viisil. Seda hüpoteesi kinnitavad ka tõendid DPPH·-püüdmisanalüüsist, mis hõlmab HAT, ET, SEPT ja PCET mitut rada [26,32]. IC50 väärtustel põhinev kvantitatiivne analüüs (tabel 1) näitas aga, et mitme rajaga ABTS pluss ·-puhastus- ja DPPH-puhastusaspektides oli akteosiid parem kui selle apiosiidi forsütosiid B ja ramnosiidpolüumosiid. Seega võib järeldada, et apiosüül- ja ramnosüülfragmendid takistavad lõpuks vabade radikaalide eemaldamise protsessi käigus mitme raja potentsiaali (eriti ET ja H pluss-ülekannet). Nagu autorid ja teised [14,26] märkisid, võib antioksüdantse protsessi käigus tekkida ka RAF-reaktsioon. RAF-i võimaluse kontrollimiseks aga kolmfenüülpropanoidglükosiididkoos kofeiinhappega uuriti UPLC.ESI.Q.TOF.MS/MS analüüsi abil. Leiti, et kofeiinhape annab dimeerprodukti, samas kui kolmfenüülpropanoidglükosiididRAF-i toote tippu ei tekitanud.

See leid viitab selgelt sellele, et kolmfenüülpropanoidglükosiididei saa läbida RAF-i rada, et avaldada oma antioksüdantset toimet. Kuna kolme fenüülpropanoidglükosiidi võib pidada kofeiinhappe estriteks (joonis 1), näitab selline erinevus kohvhappe ja kofeiinhappe estrite vahel ka seda, et tohutu osa võib takistada RAF-i teket.

Kokkuvõttes võivad akteosiid ja selle derivaadid oma antioksüdantse toime avaldamiseks läbida mitmeid vabade radikaalide eemaldamise aspekte. Need antioksüdantide rajad on seotud vähemalt ET ja H pluss-ülekandega (kuid mitte RAF-iga). Meie järeldusi toetab osaliselt teoreetiline uuring, mille kohaselt võib akteosiid avaldada antioksüdantset toimet SPLET-raja kaudu. Selle protsessi käigus võib akteosiid esmalt deprotoneerida (H pluss ülekanne), et saada anioon. Arvatakse, et deprotoneerimine toimub nõrga happesusega katehhooliosades. Seejärel loovutas anioon elektrone, et tekitada fenoksüradikaal [33]. Pu-konjugatsiooniga fenoksüradikaalid on siiski teatud määral stabiilsed. Loomulikult on selles osas vaja edaspidi eksperimentaalset tööd teha.

Tasub mainida, et raku oksüdatiivne stress võib pärineda ka siirdemetallidest (eriti Fe2 pluss). Fe2 pluss ioon võib aga Fentoni reaktsiooni kaudu muuta H2O2 molekuli kõige kahjulikumateks · OH radikaalideks (Fe2 pluss H2O2 ● Fe3 pluss ·OH pluss OH.). Seetõttu võib Fe2 pluss taseme nõrgenemine tõhusalt pärssida ·OH radikaale, et vabastada raku oksüdatiivne stress. Tegelikult moodustab raua kelaatimine loodusliku fenooligaantioksüdandidon nüüdseks välja töötatud mõnede oksüdatiivse stressiga haiguste tõhusaks raviks [34,35].

Käesolevas uuringus pakuti akteosiidi ja selle derivaate tõhusate Fe2 pluss kelaatijatena spektroskoopia ja lahuse värvide muutuste põhjal (joonis 2). Sellegipoolest on akteosiid Fe2 pluss kelaatimisel kahest glükosiidist halvem ja apiosüülrühmaga forsütosiid B halvem kui ramnosüülrühmaga poliumosiid. Nende eelistatud konformatsioonide võrdluse põhjal (joonis 1, paremal) tehakse ettepanek, et apiosüül- (või ramnosüül) fragment võib aidata peamist ligandit (fenüülpropanoidGrupp) kelaativas Fe2 plussis. Selline sünergistlik efekt tugevdab kahtlemata Fe2 pluss kelaatimise võimet ja suurendab UV-viske piike. Siiski on ramnosüül oma Fe2 pluss kelaatimisvõime poolest efektiivsem kui apiosüül. Erinevus on tingitud asjaolust, et ramnosüül esineb heksotsüklilises vormis (st/-L-ramnopüranosüül), samas kui apiosüül on pentatsüklilises vormis (st -D-apiofuransüül). Heksotsükliline vorm on teadaolevalt suurem ja stabiilsem. Seega on heksotsükliline ramnosüül oma Fe2 pluss kelaativa võime poolest tõhusam võrreldes pentatsüklilise apiosüüliga.

Et testida, kas akteosiid ja selle derivaadid võivad ROS-i hävitada, viisime läbi pürogallooli autooksüdatsiooni testi. Nagu näha Suppl. 1, võiks kõik ·O2 tõhusalt eemaldada. radikaal, tüüpiline rakkudes esinev ROS. Suhteline bioaktiivsus aga vähenes järjestuses poliumosiid > forsütosiid B > akteosiid. See järjestus on paralleelne ka tsütoprotektiivsete toimetega (tabel 2). See leid näitab, et ramnosüülrühma või apiosüülrühma üldine toime on ROS-i eemaldava või tsütoprotektiivse toime tugevdamine.

cistancheomamafunktsioonikohtavalgendaminenahka

4. Materjalid ja meetodid

4.1. Kemikaalid ja loomad

Akteosiid (CAS number: 61276-17-3, 97 protsenti), forsütosiid B (CAS number: 81525-13-5, 97 protsenti) saadi ettevõttest BioBioPha (Kunming, Hiina, varustus 3). Meie meeskond eraldas poliumosiidi (CAS number: 94079-81-9, 97 protsenti ) traditsioonilisest Hiina ürdist Callicarpa pei HT Chang (tarne 3). DPPH·, (o)-6-hüdroksüül-2,5,7,8-tetrametüülkromaan-2-karboksüülhape (Trolox), 2,9-dimetüül{{ 16}},10-fenantroliin (neokuproiin), 2,4,6-tripüridüültriasiin (TPTZ) ja pürogallool osteti ettevõttelt Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co. (Shanghai, Hiina). (NH4)2ABTS [2,2→-asinobis (3-etüülbenseen-tiasoliin-6-sulfoonhappe diammooniumisool)] saadi ettevõttelt Amresco Chemical Co. (Solon, OH, USA). PTIO· radical osteti ettevõttelt TCI Development Co., Ltd. (Shanghai, Hiina). Kohvhape osteti riiklikust farmaatsia- ja bioloogiliste toodete kontrolli instituudist (Peking, Hiina). Dulbecco modifitseeritud Eagle'i sööde (DMEM), veiseloote seerum (FBS) ja trüpsiin osteti firmalt Gibco (Grand Island, NY, USA). Anneksiin V/propiidiumjodiidi (PI) testikomplekt osteti ettevõttest Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Kõik muud reaktiivid olid analüütiliselt puhtad.

4 nädala vanused Sprague-Dawley (SD) rotid saadi Guangzhou Hiina meditsiini ülikooli loomakeskusest. Selle katse protokoll viidi läbi Hiina Guangzhou ülikooli (kinnitusnumber 20170306A) institutsionaalse loomade eetikakomitee järelevalve all.

4.2. Metalli redutseerimise testid (FRAP ja CUPRAC)

Metalli redutseerivate analüüside hulka kuuluvad Fe3 pluss-redutseeriva võimsuse test ja Cu2 pluss-redutseeriva võimsuse test. Fe3 plussi redutseeriva testi lõid Benzie ja Strain ning selle ametlik nimi on FRAP [20]. Selle testi katseprotokolli kirjeldati eelmises aruandes [9]. Lühidalt, FRAP reaktiiv valmistati värskelt, segades 10 mM TPTZ, 20 mM FeCl3 ja 0,25 M atsetaatpuhvrit vahekorras 1:1:10 pH 3,6 juures. Uuritav proov (x=4–20 l, 0,05 mg/mL) lisati (20, x) l 95% etanoolile, millele järgnes 80 l FRAP reagendile. Pärast 30-minutilist inkubeerimist ümbritseva keskkonna temperatuuril mõõdeti neeldumist lainepikkusel 595 nm, kasutades mikroplaadilugejat (Multiskan FC, Thermo Scientific, Shanghai, Hiina). Proovi suhteline redutseerimisvõimsus arvutati järgmise valemi abil:

kus Amax oli reaktsioonisegu maksimaalne neelduvus prooviga ja Amin on minimaalne neelduvus testis. A on proovi neelduvus.

Cu2 pluss-redutseeriv jõud võib iseloomustada ka antioksüdantide taset ja seetõttu nimetatakse seda CUPRAC-iks. See test viidi läbi vastavalt varem avaldatud meetodile [36]. Lühidalt, 12 l CuSO4 vesilahust (10 mmol/L), 12 l neokuproiini etanoolilahust (7,5 mmol/L) ja (75, x) l CH3COONH4 puhverlahust (0). 1 mol/L, pH 7,5) lisati erineva koguse prooviga süvenditesse (0,05 mg/mL, 4–20 l). 30 minuti pärast mõõdeti neeldumist lainepikkusel 450 nm, kasutades ülalmainitud mikroplaadilugejat. Suhteline CUPRAC-i võimsus arvutati FRAP-i valemi abil. Amax oli reaktsioonisegu maksimaalne neeldumine sample ja Amin on testi minimaalne neelduvus. A on proovi neelduvus.

cistancheomavad nahka valgendavat toimet

Palun klõpsake siin 2. osa juurde