1. osa: NF-kB inhibiitor ja AMPK agonist: võrgu ennustamine ja multi-omika integreerimine, et saada signaaliradu Alzheimeri tõve vastase akteosiidi jaoks

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Qi Jiang1 , Yuan-Yuan Shi2 , Xiao-Li Jiang1 , Shan-Shan Wu1 , Ping Zhou1 , Hui-Ying Wang1 , Ping Li1* ja Fei Li1,2*

¹ osariik Võti Laboratoorium kohta Loomulik Ravimid, Hiina Farmaatsia Ülikool, Nanjing, Hiina, ² kolledž kohta apteek,Xinjiangi meditsiiniülikool, Urumqi, Hiina

SISSEJUHATUS

Rahvastiku vananemise ja kiire kasvuga on dementsuse juhtude arv maailmas näidanud kasvutendentsi.Alzheimeri tõbi(AD) on tavaline neurodegeneratiivne haigus, millega kaasnevad kognitiivsed häired ja düskineesia (Perea et al., 2020), mis on kõige sagedasem dementsuse tüüp. Seda iseloomustab tõsine neuronite kadu, seniilsed naastud ja neurofibrillaarsed puntrad (Shiao et al., 2017). AD patogenees(Alzheimeri tõbi)on mitmemõõtmeline ja seostub neuropõletikuga. Neuropõletikku põhjustab gliiarakkude aktivatsioon, mis on tihedalt seotud AD esinemise ja arenguga.(Alzheimeri tõbi)(Hanslik ja Ulland, 2020; Linnerbauer ja Rothhammer, 2020). Neuropõletiku progresseerumise ja ägenemise ajal peetakse mikrogliat võtmeteguriks.

Mikrogliia on kesknärvisüsteemi esmased immuunrakud, mis on tihedalt seotud selliste protsesside kaskaadiga nagu aju areng, närvikeskkonna säilitamine, aga ka vastused vigastustele ja paranemisele (Perea et al., 2020). Veelgi enam, mikrogliia saab stimuleerida M1 fenotüübiks ja suurendada põletikueelsete tsütokiinide ekspressiooni neuropõletikuga seotud haiguste, näiteks AD korral.(Alzheimeri tõbi)esineb (Tsukahara et al., 2020). Uuringud näitavad ka, et M1 fenotüübi polariseerumisega kaasnevad sageli ainevahetushäired (Li L. et al., 2020), mis põhjustab energia metabolismi tasakaalustamatust ja mitokondriaalset düsfunktsiooni (Agrawal ja Jha, 2020). Need ebasoodsad muutused on tingitud neurodegeneratsioonist, isegi AD-st(Alzheimeri tõbi).

Akteosiid(ACT), fenüületanoidglükosiid, saadakse peamiseltCistanche tubulosa. Üha rohkem tõendeid on näidanud, et ACT-l on palju farmakoloogilisi toimeid, sealhulgas neuroprotektiivne (Wei jt, 2019), põletikuvastane (Lai et al., 2019) ja antioksüdant (Ji et al., 2019). Eelkõige on tõestatud, et ACT võib parandada õppimis- ja mäluhäireid ning samuti ülesreguleerida energia metabolismi streptozototsiini indutseeritud rottidel (Chen J. et al., 2020). Lisaks võib see pärssida ka neuronaalset apoptootilist rakusurma ja mitokondriaalseid kahjustusi eksperimentaalsetel autoimmuunse entsefalomüeliidi hiirtel (Li W. et al., 2020). Siiski on harva teatatud ACT mõjust mikrogliia M1 / ​​M2 polarisatsioonile ja selle mehhanismile. Siiani on sellised mehhanismid nagu mitokondrite funktsiooni parandamine ja rakkude metabolismi reguleerimine ebaselged ning täpse mehhanismi selgitamiseks on vaja täiendavaid teadusuuringuid.

Käesoleva aruande eesmärk on uurida ACT terapeutilist efektiivsust ja ACT aluseks olevat molekulaarset mehhanismi AD korral.(Alzheimeri tõbi). Siin luuakse konsolideeritud andmebaaside põhjal süstemaatiline in silico meetod ravimi sihtmärgi tuvastamiseks. Edasi uurime ACT võimalikke mehhanisme molekulaarbioloogilisel tasemel, integreerides RNA-sekveneerimise (RNA-seq) metaboomika meetodi ja molekulaarbioloogia tehnikatega. In silico, in vivo ja in vitro süstemaatilise sõelumisstrateegia kombinatsioon annab uue protokolli traditsioonilise hiina meditsiini mitme sihtmärgiga ühendite objektiivseks avastamiseks.

Cistanche tubulosa saab ravidaAlzheimeri tõbi

MATERJALID JA MEETODID

Võrgu modelleerimine

ACT sihtmärkide ennustamiseks ja avastamiseks ühendati neli veebiplatvormi, nimelt GeneCards1, sarnasuse ansambli lähenemisviis (SEA2), SwissTargetPrediction3 ja PharmMapper4. Kõik AD geeniühendused(Alzheimeri tõbi)koguti sõltumatult DisGeNET5-st ja GeneCardsist. Pärast Stringi andmebaasi6 läbi viidud siht-sihtmärgi interaktsioonianalüüsi integreeriti võrk veelgi Cytoscape'i (versioon 3.8.2) tarkvaraga. Võrgu märkimiseks ja kaevandamiseks viidi läbi DAVID-i andmebaasis7 GO ja KEGG rikastamise analüüs.

Loomad ja mudelite rühmitamine

Selles uuringus valiti metsikut tüüpi sebrakala (AB tüvi, 4 kuud vana) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Neid hoiti 14/10-h valguse/pimeduse tsüklis 28 °C juures, järgides eelmist meetodit (Li YQ et al., 2020). Kõik sebrakala katsed viidi läbi Hiina Farmaatsiaülikooli loomaeetikakomitee järelevalve all.

Sebrakala vastsed jagati kuueks rühmaks ja neid töödeldi 3 päeva pärast viljastamist (dpf) kuni 7 dpf-ni: kontrollrühm, mudelrühm, mudel pluss donepesiilvesinikkloriid (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) ja mudel pluss ACT (HPLC puhtus 98 protsenti, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.) rühmad. Kontrollrühma hoiti söötmes, milles oli 0,2 protsenti DMSO-d, ja mudelrühma töödeldi 150 uM AlCl3-ga (pH 5,8). Mudelit pluss DPZ rühma töödeldi koos AlCl3 ja 8 uM DPZ-ga. Mudeli pluss ACT rühmi töödeldi koos AlCl3 ja erinevate ACT kontsentratsioonidega (200, 100 ja 50 uM).

Käitumisanalüüs

Sebrakala vastsete liikumised registreeriti ViewPoint käitumisanalüsaatoriga (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) temperatuuril 28 oC. Lühidalt, käitumisparameetrid ja tulemuste töötlemine olid kooskõlas meie varem loodud meetodiga (Li YQ et al., 2020). Siin valiti sebrakala düskineesia taastumise hindamiseks keskmine kiirus (AS), kiiruse muutus (AS), düskineesia taastumise määr (DRR) ja vastuse efektiivsus (RE, protsent).

Atsetüülkoliinesteraasi ja koliini atsetüültransferaasi aktiivsuse määramine

Pärast 3–7 dpf töötlemist koguti sebrakala vastsed, et mõõta atsetüülkoliinesteraasi (AChE) ja koliinatsetüültransferaasi (ChAT) aktiivsust. Tootja protokolli alusel tuvastati aktiivsus ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) komplektidega (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Hiina).

Rakukultuurid ja ravi

BV-2 rakuliin osteti Ameerika tüübikultuuride kollektsioonist (ATCC, Manassas, VA, Ameerika Ühendriigid). Neid kasvatati DMEM-is (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Hiina). Söötmele lisati 10 protsenti FBS-i (Gibco, Grand Island, NY, Ameerika Ühendriigid),

100 U/ml penitsilliini ja 100 mg/ml streptomütsiini, millele on lisatud 95 protsenti õhku/5 protsenti CO2 37oC juures. BV-2 rakke inkubeeriti ACT-ga (50, 25 ja 12,5 uM) või stimuleeriti lipopolüsahhariidiga (LPS, 1 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Ameerika Ühendriigid) 24 tundi. Rakke vaadeldi pöördmikroskoobi all (Nikon ECLIPSE Ti2, Jaapan).

Rakkude elujõulisuse test

Rakkude elujõulisuse hindamiseks kasutati Cell Counting Kit-8 (CCK-8) testi (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Hiina). Lühidalt, neeldumist mõõdeti 450 nm juures mikroplaadilugejaga (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Ameerika Ühendriigid).

Lämmastikoksiidi tootmise analüüs

Lämmastikoksiid (NO) määrati nitrititaseme mõõtmisega BV-2 kultuuri supernatandis, kasutades Griessi reagenti. Lühidalt, sööde (100 ul) kanti üle uuele 96-süvendiga plaadile, igasse süvendisse lisati sama kogus Griessi reaktiivi ja lasti reageerida 15 minutit pimedas. Neeldumine 540 nm juures määrati Microplate Readeriga.

Põletikuliste tsütokiinide tase supernatandis

TNF-a, IL-1 ja IL-10 kontsentratsioonid BV-2 rakkude supernatandis määrati ELISA komplektidega vastavalt tootja juhistele.

Rakkude ainevahetuse määramine HPLC-Q-TOF-MS analüüsiga

BV-2 rakud külvati kuue süvendiga tassi eraldi (n=6/rühm). Pärast töötlemist sööde eemaldati ja rakke pesti kolm korda külma PBS-ga. Seejärel viidi nad rakkude metabolismi pärssimiseks kohe kokku vedela lämmastikuga. Rakud koguti 80% külma metanooliga. Valgu sadenemise hõlbustamiseks segati rakke intensiivselt 1 minut ja tsentrifuugiti kiirusel 13, 000 pööret minutis (15 min, 4 °C). Rakususpensiooni kuivatati lämmastiku voolu all. Kuivatatud jääk lahustati 150 ul eeljahutatud 25% atsetonitriilis. Järjestusanalüüsi stabiilsuse ja täpsuse tagamiseks ühendati iga võrdse mahuga rakuproov (10 ul) kvaliteedikontrolli proovideks. Metaboliitide tuvastamise ajal süstiti need proovid iga kuue proovi järel, et kinnitada nende stabiilsust. HPLC-Q-TOF-MS jaoks süstiti 1-ul alikvoot.

Analüüs viidi läbi Agilent 1290 HPLC süsteemiga

ühendatud Agilent 6530 Quadrupool Time-of-Flight (Q-TOF) massispektromeetriga (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Ameerika Ühendriigid). Eraldamine viidi läbi ACQUITY UPLC BEH C18 kolonnis (2,1 min 100 mm, 1,7 um). Liikuv faas koosnes 0,1 protsendilisest sipelghappe-veest (maht/maht; A) ja atsetonitriilist (B).

Voolukiiruseks määrati {{0}},4 ml/min järgmiste optimaalsete gradientelueerimistingimustega: 0 kuni 2 min, 5 protsenti B; 2 kuni 20 min, 5 kuni 95 protsenti B (positiivse iooni režiim); 0 kuni 2 min, 5 protsenti B; 2 kuni 20 min, 5 kuni 95 protsenti B (negatiivse iooni režiim). Massispektromeetri tööparameetrid määrati järgmiselt: gaasi temperatuur, 320oC; kuivatusgaas, 10 L/min; nebulisaator, 35 psi; VCap, 4, 000 V; fragmentor, 120 V.

andmed viidi läbi rakendusega MetaboAnalyst8. Koos kirjandusega tuvastati HMDB9-l erinevad metaboliidid (VIP > 1, t-test p < 0,05).="" lõpuks="" viidi="" teekonna="" analüüs="" läbi="">

Mitokondriaalse membraani potentsiaali mõõtmine

Mitokondriaalse membraani potentsiaal (MMP) tuvastati fluorestsentssondi JC-1 (Beyotime, Hiina) abil vastavalt tootja juhistele. Lühidalt, erinevate rühmade rakke loputati PBS-ga ja inkubeeriti JC-1 värvimislahusega 20 minutit temperatuuril 37 °C. Pärast värvimist pesti rakke kaks korda värvimispuhvriga. Seejärel tuvastati fluorestsentssignaalid voolutsütomeetriaga (BD Accuri C6).

Mitokondriaalse adenosiin-5f-trifosfaadi mõõtmine

Adenosiin 5/-trifosfaadi (ATP) kontsentratsioon mitokondrites tuvastati ATP analüüsikomplektiga (Beyotime, Hiina). Lühidalt, erinevatest rühmadest pärit BV-2 rakkude sööde visati ära ja rakud homogeniseeriti jääl lüüsipuhvriga. Pärast tsentrifuugimist saadud supernatant (12,000 g,

5 min) kasutati ATP kontsentratsiooni määramiseks. Luminestsents tuvastati EnVision Multimode Microplate Readeriga (PerkinElmer).

Juhtimine(Alzheimeri tõbi)

Intratsellulaarse reaktiivse hapniku liigi taseme mõõtmine

ROS taseme mõõtmiseks kasutati reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) analüüsikomplekti (Beyotime, Hiina). Erinevate rühmade rakke inkubeeriti DCFH-DA-ga (10 uM) 20 minutit temperatuuril 37 oC. Pärast sondi laadimist pesti rakke kolm korda DMEM-ga. Seejärel tuvastati fluorestsentssignaalid voolutsütomeetriaga (BD Accuri C6).

Transmissiooni elektronmikroskoopia

BV-2 rakud külvati kuue süvendiga tassi. Sööde eemaldati ja igasse süvendisse lisati kiiresti 1 ml 2,5% glutaaraldehüüdi. Seejärel rakud koguti ja fikseeriti uue 2,5% glutaaraldehüüdiga temperatuuril 4 °C üleöö. Pärast fikseerimist, dehüdratsiooni ja kinnistamist vaadeldi rakke HT7800 ülekandeelektronmikroskoobiga (Hitachi, Tokyo, Jaapan).

RNA-Seq ja bioinformaatiliste andmete analüüs

Kogu RNA BV{{{{10}}}} rakkudest ekstraheeriti Trizoli reagendiga (Vazyme Biotech, Hiina). Kõik analüütilised proovid saadeti RNA järjestuse testimiseks ettevõttesse Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.). Andmeid analüüsiti Majorbio Cloud Platform1 veebiplatvormil0. RSEM11 kasutati geenide arvukuse kvantifitseerimiseks. Põhimõtteliselt diferentsiaalne avaldis Toorandmeid kasutati MassHunter Workstationi tarkvara versioonis B.{22}}7.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Ameerika Ühendriigid). Algandmed eeltöötleti XCMS-i platvormi poolt. Normaliseeritud analüüsi põhikomponentide analüüs (PCA) ja osaline vähimruutude diskrimineerimisanalüüs (PLS-DA) viidi läbi, kasutades DESeq2/DEGseq/EdgeR Q väärtusega 0,05; DEGs|log2FC| > 1 ja Q väärtus 0,05 (DESeq2 või EdgeR)/Q väärtus 0,001 (DEGseq) loeti oluliselt erinevateks ekspresseeritud geenideks. Lisaks viidi läbi funktsionaalse rikastamise analüüs, sealhulgas GO ja KEGG, et teha kindlaks, millised DEG-d olid Bonferroni-korrigeeritud p-väärtuse 0, 05 juures märkimisväärselt rikastatud GO terminite ja radadega võrreldes kogu transkriptoomi taustaga. Algsed järjestuse andmed on esitatud NCBI järjestuste lugemise arhiivi andmebaasi.

Kvantitatiivne reaalajas polümeraasi ahelreaktsioon

BV-2 rakkude kogu-RNA koguti, kasutades RNA-easyTM isoleerimisreagenti (Vazyme Biotech, Hiina) ja pöördtranskriptsioonireaktsioon viidi läbi FastKing-RT SuperMixiga (TIANGEN Biotech, Hiina). Reaktsioonid viidi läbi vastavalt tootja protokollile. cDNA-le viidi läbi kvantitatiivsed reaalajas polümeraasi ahelreaktsiooni (qRT-PCR) testid spetsiifiliste praimerite ja TransStart TOP Green qPCR SuperMixiga (TransGen Biotech, Hiina). Praimerid on loetletud täiendavas tabelis 1 ja sisekontrollina kasutati -aktiini. Kvantitatiivseks analüüsiks kasutati 2-AA CT meetodit.

Western blot analüüs

BV-2 rakud lüüsiti koguvalgu saamiseks RIPA lüüsipuhvriga (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Hiina), mis sisaldas 1 protsenti proteaasi inhibiitori kokteili (Thermo Fisher). Valgud eraldati 10% SDS-PAGE-ga ja kanti üle NC-membraanidele. Pärast blokeerimist 5% lõssi/BSA-ga inkubeeriti membraane AMKa (Proteintech), p-AMPKa (Affinity Biosciences), PGC-1a (Proteintech), NF-kB (Proteintech), p-NF-ga. kB (ABklonaalsed) või GAPDH (ABklonaalsed) antikehad 5-protsendilises TBST-s temperatuuril 4 °C üleöö. Membraanid inkubeeriti sekundaarse mädarõika peroksidaasiga konjugeeritud antikehaga (ABclonal) toatemperatuuril 1 tund. Visualiseerimiseks ja kvantifitseerimiseks kasutati suure sig-ga ECL Western blotting substraati (Tanon, Hiina), geelkuvamissüsteemi (Tanon, Hiina) ja ImageJ tarkvara.

Molekulaarne dokkimine

Molekulaarse dokkimise analüüs viidi läbi tarkvara Autodock (versioon 4.2) abil. Afiinsust ACT ja valkude vahel jälgis tarkvara AutodockTools. AMPKa (PDB ID: 5g5j) ja NF-kB (PDB ID: 4q3j) kolmemõõtmelised (3D) valgustruktuurid saadi valguandmete pangast12.

Statistiline analüüs

Kõik andmed väljendatakse keskmise standardhälbena ja neid analüüsitakse tarkvara GraphPad Prism (versioon 8.{1}}.1) abil. Rühmadevahelisi erinevusi analüüsiti ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil, millele järgnes Tukey mitmekordne võrdlustest. p < 0,05="" peeti="" statistiliselt="">

Tistanche toidulisand Alzheimeri tõve jaoks

TULEMUSED

ACT-AD sihib interaktsioonivõrku ja raja ennustamist

Mitme andmebaasi konsolideerimise kaudu saadi 253 ACT sihtmärki, samas kui kokku koguti 1697 AD-ga seotud sihtmärki. Pärast sihtvõrgu kaardistamist absorbeeriti ACT-AD sihtmärgi interaktsioonivõrku kokku 70 sihtmärki (joonis 1A). KEGG rikastamise analüüs viitas sellele, et ACT-l võib olla laia spektriga ja mitut sihtmärki (joonis 1B). Samuti viitas see sellele, et ACT-l on AD-s mitu rada, sihtpunkte ja elemente(Alzheimeri tõbi)ravi. Mehhanismide täpse tõlgenduse saamiseks klassifitseerige need teed. ACT võib peamiselt korreleeruda signaaliülekande, endokriinsüsteemi, immuunsüsteemi ning rakkude kasvu ja surmaga, et mängida vastandlikku rolli AD vastu(Alzheimeri tõbi)(Joonis 1C). Väärib märkimist, et enamik neist radadest on seotud põletikureaktsiooniga. Spekuleeritakse, et ACT-i põletikuvastane toime võib olla lahutamatu osa selle vastasseisust AD vastu.(Alzheimeri tõbi).

ACT leevendas düskineesiat ja parandas kolinergilise süsteemi funktsiooni AD korral(Alzheimeri tõbi)Sebrakala vastsed

Võrgumudeli kontrollimiseks kutsus AlCl{0}} esile AD(Alzheimeri tõbi)ACT mõju demonstreerimiseks kasutati sebrakala vastsete mudelit. Täheldati sebrakala vastsete liikumist valguse/pimeduse tsüklites ja registreeriti nende ujumisrajad (joonis 1D). Tulemused näitasid, et ACT suurendas tõhusalt sebrakala AS-i ja AS-i ning sünergistlik efekt suurenes koos annuste suurendamisega (joonis 1E). DRR ja RE avastasid ACT ja DPZ intuitiivsema võrdluse (joonis 1F). Seega leevendas ACT düskineesiat, avaldades DPZ-ga sarnaseid toimeid.

Üldiselt ollakse nõus, et kolinergiline süsteem mängib õppimis- ja mäluprotsessides olulist rolli. Seega kasutati AChE ja ChAT tegevusi ACT mõju paljastamiseks. AlCl3 kokkupuude sebrakala puhul muudeti aju kolinergiliste muutustega (joonis 1G). Oli oluline, et ACT-ravi pärssis AChE aktiivsust. Lisaks vähenes ChAT aktiivsus pärast ACT-ravi. Seetõttu avaldas ACT AlCl3-indutseeritud AD-le suurt mõju(Alzheimeri tõbi)sebrakala vastsed.

ACT pärssis M1 polarisatsiooni ja soodustas M2 polarisatsiooni LPS-indutseeritud BV-2 rakkudes

Võrgustiku täiendavaks kinnitamiseks uuriti ACT põletikuvastast toimet in vitro, kasutades BV-2 mikrogliiarakke. Pärast 24-tunnist ravi LPS-ga vähenes BV-2 rakkude elujõulisus märkimisväärselt. Õnneks suurendas ACT LPS-indutseeritud BV{5}} rakkude elujõulisust (joonis 2A). Lisaks täheldati BV-2 rakkude morfoloogiat. Pärast 24-tunnist LPS-i stimuleerimist näitas see, et BV-2 rakud läbisid M1 polarisatsiooni oleku. Morfoloogilisi muutusi hoidis ära ACT-ga kaasravi (joonis 2B).

Lisaks näitasid tulemused, et erinevalt LPS-i poolt stimuleeritud BV-2 rakkudest surusid koos ACT-ga töödeldud BV-2 rakud TNF-a, IL-1 ja NO märkimisväärselt alla (joonis 2C). ekspressioonid raku supernatandis. Need on klassikalised põletikku soodustavad tsütokiinid kui M1 mikrogliia polarisatsiooni indikaatorid. Sarnaselt ELISA tulemustele avastasid qPCR tulemused, et TNF-a, lämmastikoksiidi süntaas (iNOS),

ACT-ravi pärssis oluliselt IL-1 ja CD86 mRNA ekspressioone võrreldes LPS-rühmaga (joonis 2D).

Lisaks mõõtsime M2 mikrogliia polarisatsioonitaset ELISA (joonis 2C) ja qPCR (joonis 2E) abil ning tulemused näitasid, et ACT suurendas märkimisväärselt M2 mikrogliiaga seotud markerite ekspressioonitaset (IL-10, CD206, TGF- ja Arg-1). Ühesõnaga, need tulemused näitasid, et ACT pärssis M1 mikrogliia polarisatsiooni ja soodustas M2 fenotüüpi.

ACT reguleeritud M1/M2 polarisatsioon NF-kB raja pärssimise kaudu

Transkriptoomilise analüüsi teostas RNA-seq, et uurida ACT mehhanismi BV-2 rakkudes üldisest tasemest. PCA näitas, et kontroll-, LPS- ja ACT-rühmi saab hästi eristada (joonis 3A). See näitas 899 erinevalt ekspresseeritud geeni (DEG) kontrollrühma ja LPS-rühma vahel ning 49 DEG-d LPS-rühma ja ACT-i vahel.

rühm (joonis 3B). Järjekindlalt avastasid GO (joonis 3C) ja KEGG rikastamise analüüs (joonis 3D), et ACT mõju oli seotud NF-KB rajaga. NF-kB rajaga seotud geenide komplekti kinnitati veelgi ja LPS mõjutas kindlasti nende homöostaasi. Nagu oodatud, mõjutas ACT nende väljendeid märkimisväärselt (joonis 3E).

NF-kB rada on klassikaline viis põletiku progresseerumise reguleerimiseks, mille tulemuseks on põletikku soodustavate tegurite vabanemine. Mehhaanilise toe saamiseks hinnati NF-kB raja võtmevalku Western blot abil. LPS-i stimuleerimine viis NF-KB aktiveerimiseni, mis on seotud M1 polarisatsiooni soodustamisega. Kooskõlas RNA-seq analüüsiga inhibeeris ACT LPS-i poolt stimuleeritud NF-kB fosforüülimist (joonis 3F). Seetõttu võib ACT leevendada LPS-i indutseeritud M1 polarisatsiooni NF-kB raja kaudu BV-2 rakkudes.

ACT kahjustatud arginiini biosüntees, samuti pantotenaadi ja CoA biosüntees

ACT võrguprognoos näitas, et see oli seotud arginiini (Arg) ja proliini metabolismiga (joonis 1B). RNA-seq näitas, et ACT poolt mõjutatud rajad hõlmasid ka Arg biosünteesi, samuti pantotenaadi ja CoA biosünteesi (joonis 3D). On oletatud, et LPS-i stimulatsioonist põhjustatud BV-2-rakkude ainevahetushäired on seotud M1 polarisatsiooniga (Orihuela et al., 2016). Seega

ACT mõju tuvastamiseks raku metabolismile kasutati HPLC-Q-TOF-MS abil sihtmärgistamata raku metaboloomi. PCA ja PLS-DA (joonis 3G) näitasid, et kontroll-, LPS- ja ACT-rühmi saab intratsellulaarsete metaboliitide põhjal hästi eristada. Erinevate metaboliitide tasemed LPS-indutseeritud BV-2 rakkudes muutusid pärast ACT-ravi (joonis 3H). Võrreldes kontrollrühmaga oli 11 metaboliiti, mis muutusid LPS-rühmas märkimisväärselt (täiendav tabel 2), samas kui 14 metaboliiti muutusid selgelt pärast ACT-ravi (täiendav tabel 3), mis hõlmas 11 metaboolset rada (joonis 3I). ACT toime seisnes peamiselt aminohapete metabolismi, nukleotiidide metabolismi, energia metabolismi ning kofaktorite ja vitamiinide metabolismi reguleerimises. Huvitaval kombel olid metaboolsete radade abil saadud metaboolsed rajad kooskõlas võrgu prognoosi ja RNA-järjega, sealhulgas Arg biosüntees, samuti pantotenaadi ja CoA biosüntees. Ülaltoodu näitas, et ACT võib reguleerida nii Arg biosünteesi kui ka pantotenaadi ja CoA biosünteesi LPS-stimuleeritud BV- 2 rakkudes.

Cistanche ekstrakti anti-Alzheimeri tõbi

Palun klõpsake siin 2. osa juurde