Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Palun klõpsake siin 2. osa juurde

I-Fang Wang, 1,2 Yihan Wang, 2 Yi-Hua Yang, 1,3,4 Guo-Jen Huang, 5,6 Kuen-Jer Tsai, 3,4* ja Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1 Graduate Institute of Neural Regenerative Medicine, Medical Science and Technology College, Taipei Medical University, Taipei 11031, Taiwan

2 Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, Taipei 11529, Taiwan

3 Kliinilise meditsiini instituut, meditsiinikolledž, riiklik Cheng Kungi ülikool, Tainan 70403, Taiwan

4 Kliinilise meditsiini uurimiskeskus, riiklik Cheng Kungi ülikooli haigla, meditsiinikolledž, riiklik Cheng Kungi ülikool, Tainan 70403, Taiwan

5 Biomeditsiiniteaduste osakond ja kraadiõppur, meditsiinikolledž, Chang Gungi ülikool, Taoyuan 33302, Taiwan

6Neuroteaduste uurimiskeskus, Chang Gungi memoriaalhaigla, Linkou 33302, Taiwan

7 Juhtkontakt

*Kirjavahetus: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche võib parandada mälu

KOKKUVÕTE

Fenotüübiline varieerumine on rakkude ja organismide loomuliku valiku teel toimuva evolutsiooni põhieeldus. Kui stohhastilise geeniekspressiooni rolli geneetiliselt identsete rakkude fenotüübilises mitmekesisuses on hästi uuritud, pole stohhastilise geeniekspressiooni ja loomade individuaalse käitumise varieerumise vahelise seose kohta palju teada. Näitame, et spetsiifiline miRNA (miR-466f-3p) on Morrise veelabürindi ülesandel üksikute sisearetatud hiirte hipokampuses ülesreguleeritud. Märkimisväärselt reguleerib miR- 466f-3p positiivselt neuronite morfoloogiat, funktsiooni ja ruumilist õppimist ningmäluhiirte võimekus. Mehhaaniliselt surub miR{0}}f-3p alla MEF2A, õppimise negatiivse regulaatori tõlke/mälu. Lõpuks näitame, et hipokampuse miR-466f-3p erinev ülesreguleerimine tuleneb üksikisikute hipokampuse tsüklilise AMP (cAMP) vastuse elemendi sidumise (CREB) randomiseeritud fosforüülimisest. See ruumilise õppe modulatsiooni leidmine jamälurandomiseeritud hipokampuse signaalitelje kaudu neuronaalsel stimulatsioonil näitab, kuidas koe geeniekspressiooni varieerumine põhjustab loomade erinevat käitumist.

SISSEJUHATUS

Fenotüübiline varieeruvus indiviidide vahel annab evolutsioonilise eelise, kuna see tagab populatsiooni mitmekesisuse, millele looduslik valik mõjub (Pavlicev et al., 2011). Geneetiline taust ja keskkonnategurid aitavad kaasa sellise loomuliku variatsiooni tekitamisele (Bendesky ja Bargmann, 2011). Eksperimentaalselt on sisearetatud hiiri sageli kasutatud keskmiste fenotüüpide ja käitumise molekulaarse ja rakulise aluse uurimiseks, et minimeerida testitud indiviidide geneetiliste erinevuste mõju (Casellas, 2011). Siiski on üksikute isogeensete hiirte vahel näidatud kudede transkripti arvukuse varieeruvust. Väga varieeruva ekspressioonitasemega geene seostatakse sageli immuunfunktsiooni, stressireaktsioonide ja hormonaalse regulatsiooniga, st keskkonnanäitajate suhtes tundlike protsessidega (Vedell et al., 2011). Mõned neist uuringutest on samuti näidanud, et erinevused geeniekspressioonis või raku signaaliülekandes koos või ilma keskkonnategurite mõjuga, nagu ema lakkumine, toitainetega varustamine emakas või stressist tingitud vastupidavus versus vastuvõtlikkus (Bale, 2015; Danchin et al. ., 2011; Lorsch

jt, 2019; Pedersen et al., 2011), võib põhjustada erinevusi fenotüüpides ja käitumises (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos jt, 2015; Oey jt, 2015).

Ruumiõpe jamäluaju kontrollitud moodustised võib jagada kaheks süsteemiks: (1) egotsentriline navigatsioon, mis kasutab iseliikumist ja sisemisi näpunäiteid, ja (2) allotsentriline navigatsioon, mis hõlmab peamiselt hipokampust ja lähedalasuvaid aju struktuure, mida stimuleerivad organismidest väljapoole jäävad distaalsed näpunäited (Ekstrom). et al., 2014). Ruumiõppe võime jamäluvõimaldab enamikul loomaliikidel järk-järgult kohandada oma käitumist, et kohaneda ruumiliselt ja ajaliselt muutuvates keskkondades, mis on nende ellujäämise seisukohalt kriitiline. Seda saab hinnata laboriloomadel, rakendades käitumisparadigmasid, nagu Morrise veelabürint (MWM) (Vorhees ja Williams, 2014). Eelkõige on näidatud, et geneetiliselt identsetel sisearetatud närilistel on ruumilise õppimise fenotüübiline varieeruvus jamälu(Tsai et al., 2002), kuid selle käitumusliku variatsiooni aluseks olevad mehhanismid jäid teadmata.

Uute mälestuste teke on keeruline protsess, mis nõuab aktiivsusest sõltuvat geenitranskriptsiooni, uut valkude sünteesi ja

Joonis 1. Korrelatsioon ruumiõppe varieerumise jamäluvõime ja miR{0}}f-3p induktsioon

(A) Metsiktüüpi inbred C57BL / 6J hiirte MWM ülesanne. Vasak paneel: GLN-hiirte (punktid) ja PLN-hiirte (ruudud) MWM-i jõudlus. Kokku 289 testitud hiirest liigitati 180 GLN-ks ja 109-ksPLN-iks. Parempaneel:MWM-ülesannete probetest(n=47and30ineachgroup).Neljakvadrandi ja platvormi piirkonna pentiinjoonelisi mõõtmisi võrreldakse histogrammis. P, puuduva platvormi koht; T, sihttsoon ilma Pta; R, parem tsoon; O, vastastsoon; L, vasak tsoon. (B) miRNA ekspressiooni RT-qPCR analüüs. Kuue miR-466-669 klastris paikneva miRNA ja miR-132-3p kui ajuga rikastatud positiivse kontrolli suhtelisi ekspressioonitasemeid analüüsiti ja normaliseeriti GLN ja PLN hiire hipokampuse sisekontrolli U6 snRNA-ga. (n=9–18 rühma kohta). I, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3lk.

peenhäälestatud spetsiifiline neuronite võrgustik nagumäluengramme, et luua uusi neuronaalseid ühendusi ja säilitada püsiv plastilisus (Asok et al., 2019). Hippokampuse engrammid, mis on hõredad neuronite populatsioonid dentate gyrus (DG), esindavad neuronite ansambleid, millel on pärast seda suurenenud aktiivsus.mälumoodustamine. Kuigi DG engrammi neuronitel on väga erinev geeniekspressiooni muster (Rao-Ruiz et al., 2019), on aluseks engrammispetsiifilised molekulaarsed mehhanismid.mälukonsolideerimine on suures osas teadmata. Teadaolevalt reguleerivad õppimist positiivselt või negatiivselt mitmesugused tegurid ja signalisatsiooniteedmäluprotsessid on tuvastatud (Abraham et al., 2019; Humeau ja Choquet, 2019). Nende hulgas stimuleerib tsüklilise AMP (cAMP) vastuse elementi siduva valgu (CREB) aktiveeritud vorm geeni transkriptsiooni vastuseks rakusisese Ca2 pluss aktiivsusest sõltuvale suurenemisele neuronites (Kandel, 2012). Teisest küljest pärsib camp/PKApathway myocyteenhancer factor 2 (MEF2) transkriptsiooni aktiivsust, takistades selle kaasrepressori HDAC5 tuumaeksporti ja kaasaktivaatori NFAT tuumaimporti (Belfield et al., 2006). Lisaks, erinevalt CREB-st, piirab MEF2A aktiivsusmälumoodustamine (Cole et al., 2012). Lisaks valgufaktoritele osalevad mikroRNA-d (miRNA-d) ka neuronaalsete funktsioonide, sealhulgas õppimise ja mälu reguleerimises (McNeill ja Van Vactor, 2012). miRNA-d on väikesed (22 nt) mittekodeerivad RNA-d, mis toimivad peamiselt geeniekspressiooni transkriptsioonijärgsete regulaatoritena järjestus-spetsiifilise aluspaari kaudu oma äratundmissaitidega spetsiifiliste mRNAde 30 transleerimata piirkonnas (30 UTR-i) ​​(Daugaard ja Hansen, 2017). miRNA-d osalevad postmitootiliste neuronite mitmesugustes signaaliradades ja vahendavad aktiivsusest sõltuvaid rakuprotsesse, sealhulgas dendriitide kasvu ja hargnemist, sünapsi moodustumist ja küpsemist. Reguleerides geeniekspressiooni, mängivad nad olulist rolli ka sünaptilise plastilisuse pikaajalistes vormides, mis on aluseks.mälumoodustamine, otsimine ja konsolideerimine (Chen ja Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

Järgnevalt esitame tõendid põhjusliku seose kohta stohhastilise koe geeniekspressiooni ja loomade individuaalse käitumise varieeruvuse vahel. Eelkõige näitame, et hipokampuse CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A telje stohhastiline aktiveerimine moduleerib ruumilise õppimise individuaalset varieerumist jamäluvõime inbred hiirtel.

TULEMUSED

Ruumiõppe individuaalne varieerumine jamäluvõime on korrelatsioonis miR{0}}f-3p induktsiooniga konkreetsest miRNA klastrist

Õppimise regulatsioonis osalevate miRNAde tuvastamiseks jamälumoodustamisel kasutasime MWM ülesannet, et eristada hea või halva õppimis- ja mäluvõimega inbred metsiktüüpi C57BL/6J hiiri (joonis 1A). Hiired, kes täitsid ülesande viimasel (6.) seansil 30 sekundi jooksul, määrasime "headeks õppijateks" (GLN), samas kui hiired, kes ei leidnud viimasel seansil platvormi 30 sekundi jooksul, loeti "vaesteks õppijateks". (PLN). Nagu on näidatud joonisel 1A (vasak paneel), kuulus 62 protsenti hiirtest GLN-rühma (180 hiirt 289-st), näidates märgatavalt vähenenud põgenemislatentsust 98,1 sekundilt (1. seanss) 21,8 sekundini (6. seanss). Seevastu ülejäänud 38 protsendi hiirte, PLN-rühma (109 hiirt 289-st) põgenemislatentsus vähenes esimese ja kuuenda seansi vahel vaid mõõdukalt (111,8 sekundilt 1. seansis 82,1 sekundini 6. seansis). . Sondi test, mis näitas, et hiired olid ülesande tõepoolest kuue seansi jooksul õppinud, näitas ka, et GLN hiired jäid platvormi piirkonda kauemaks kui PLN hiired (joonis 1A, vasakpoolne tulpade paar paremal paneelil).

Järgmisena analüüsisime miRNA mikrokiibi hübridisatsiooni abil GLN- ja PLN-hiirte hipokampuse RNA-sid (igas rühmas n=4). Üldiselt täheldasime GLN- ja PLN-hiirte hipokampuse miRNA-de ekspressiooniprofiilides suhteliselt väikeseid erinevusi. Siiski märkisime, et 10 parimat miRNA-d, mille ekspressioonitase oli kõrgem GLN-hiirtel kui PLN-hiirtel (andmeid pole näidatud), pärinesid kõik samast närilisespetsiifilisest miRNA klastrist miR-466-669, mis paiknes 10. intronis. mSfmbt2 geen (vt allpool). Tuginedes klastris valitud miRNA-de ekspressioonitasemete pöördtranskriptsiooni-kvantitatiivse polümeraasi ahelreaktsiooni (RT-qPCR) analüüsile, valisime edasiseks uurimiseks miR-466f-3p (joonis 1B). Selle miRNA keskmine ekspressioon oli GLN hiirte hipokampuses 1,{12}} korda kõrgem kui PLN hiirtel. Eelkõige olid hipokampuse miR-466f-3p keskmised tasemed sarnased PLN-rühma, kodupuuri (HC) kontrollrühma ja ujumise kontrollrühma seas (joonis 1C), välistades sellega treeninguga seotud mõjud. ujumine ning toetades veelgi ideed, et miR-466f-3p kutsuti esile ruumiõppe jamälumoodustamine.

Joonisel 1C on andmed näidanud, et hipokampuse miR-466f-3p ekspressioonitasemed üle 42 protsendi GLN-hiirtest olid vähemalt 15- korda kõrgemad kui hiirte keskmine ekspressioonitase. HC kontrollhiirtel, samas kui 15 protsendil PLN hiirtel olid tasemed poole väiksemad kui HC hiirtel. Ligikaudu 25 protsendil GLN hiirtest ja 55 protsendil PLN hiirtest oli miR-466f{{10}}p (0.8- kuni 1.{14}} sarnane). korda HC suhtes). Pearsoni korrelatsiooni hajuvusdiagramm, mis näitab positiivset korrelatsiooni miR-466f-3p tasemete ja platvormi kestuse protsendi vahel sondi testi ajal, on esitatud joonisel 1D. Samuti teostasime nii GLN- kui ka PLN-hiirtel ajuviilude miR-466f-3p ja U6 väikese tuuma-RNA (snRNA) in situ hübridisatsiooni (ISH) (joonis 1E). MiR- 466f-3p signaalide statistiline analüüs ISH kaudu kinnitas, et miR-466f- 3p indutseerimine oli GLN hiirte peadirektoraadis tõepoolest suurem kui hiirtel.

PLN hiired, samas kui U6 snRNA signaalide võrdlemisel erinevust ei leitud (parempoolne histogramm, joonis 1E). Kuigi miR-466-3p signaalid ei olnud DG üksikute graanulirakkude vahel võrdsed, suurenesid need GLN-hiirte hipokampuses siiski märkimisväärselt ja kõikjal võrreldes PLN-hiirtega. Seetõttu ei toimunud miR-466f-3p induktsioon ainult väikeses osas rakkudest, nt engrammi neuronites. Need andmed näitavad, et miR-466f-3p ülesreguleerimine MWM-i ülesande ajal on tihedalt seotud parema ruumilise õppimisega jamälusuutlikkus märkimisväärse osa GLN-hiirte seas.

Samuti analüüsisime RT-qPCR abil mitmete ajuspetsiifiliste miRNA-de keskmisi ekspressioonitasemeid. Nende hulgas oli miR-132-3p hiire hipokampuses pärast MWM-ülesannet ülesreguleeritud, kuid me ei täheldanud olulisi erinevusi GLN- ja PLN-rühmade vahel (tulppaar VII, joonis 1B). MiR-335-5p ja miR-22 ekspressioonitasemed olid GLN-, PLN- ja HC-rühmades sarnased (joonis S1A). Seega, erinevalt miR-466f-3p-st, ei ole nende miRNA-de hipokampuse ekspressioon MWM treeningu ajal korrelatsioonis ruumilise õppimise jamäluhiirte võime.

miR-466f-3p ülesreguleerimine soodustab neuriitide väljakasvu ja dendriitide moodustumist

Kinnitamaks, et miR{0}}f-3p ekspresseeriti tõepoolest neuronites, teostasime primaarsetes hipokampuse neuronites miRNA ISH koos NeuN ja MAP2 immunofluorestsentsi (IF) värvimisega. Tulemused näitasid, et sarnaselt teistele miRNA-dele (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017) ekspresseeriti miR-466f-3p peamiselt neuronaalses sooma piirkonnas koos mõningate lisasignaalidega. dendriitides (joonis S2A). Et mõista ülesreguleeritud miR-466f-3p seose molekulaarset ja rakulist alust õppimise jamälumoodustumist, me esmalt ajutiselt üleekspresseerisime miR-466f-3p koos dsRed fusioonpolüpeptiidiga pFUGW-miR-466f-3p- ubikvitiini promootori kontrolli all. dsRed plasmiid DIV10 primaarsetesse hipokampuse neuronitesse (joonis S2B). MiRNA ISH abil kinnitasime, et miR-466f-3p signaal on miR-466f-3p üleekspressioonirühmas vektori kontrolli või mutantse miR{{ 12}}f-3p rühm (nooled, joonis S2B). Paralleelselt lõime ka platvormi, et uurida miR-466f-3p funktsiooni kadumise mõju miR-466f-3p inhibeerimise tõttu, kasutades asukohas asuvat miR-käsna. pFUGW-miR-käsna-EGFP plasmiidist ekspresseeritud EGFP mRNA 30 UTR (joonis S2C). Käsnaplasmiidis olev EGFP reporter toimis nii transfektsiooni efektiivsuse indikaatorina kui ka raku miRNA aktiivsuse andurina (Kluiver et al., 2012). Märkimisväärses osas transfekteeritud HEK293T rakkudest vähenes EGFP signaal koekspressioonil metsiktüüpi miR-466f-3p-ga, kuid mitte mutantse miR-466f{{32-ga. }}p, mis on tingitud EGFP mRNA translatsiooni pärssimisest miR-466f-3p seondumise tõttu miR-käsnaga 30 UTR-is (võrrelge nelja vasakut pilti ja kahte hisprogrammi, joonis S2C) . Seevastu me ei täheldanud EGFP signaali vähenemist kontrollkäsna koosekspressioonil, mis kodeeris pFUGW-SCR-sponge-EGFP plasmiidi segatud järjestuse kaheksat koopiat kas miR-466f-3p või selle mutant (võrrelge nelja paremat pilti ja kahte histogrammi).

Nagu on näidatud joonisel 2A, põhjustas miR-466f-3p ektoopiline ekspressioon neuronite morfoloogilisi muutusi, eelkõige suurenenud neuriitide väljakasvu võrreldes kontrollneuronitega, mis olid transfekteeritud dsRed-i ekspresseeriva vektoriga pFUGW- dsRed või mutantne miR-466f-3p-d ekspresseeriv plasmiid pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Kvantifitseerimisandmed näitasid, et keskmine dendriitide harude arv neuroni kohta ei erinenud oluliselt miR-466f-3p-d üleekspresseeriva rühma (tulp II) ja vektori või mutantse kontrolli (tulbad I ja III) vahel (paremal). ülemine histogramm, joonis 2A). Kuid dendriidi keskmine kogupikkus ja primaarsete dendriitide keskmine pikkus suurenesid miR-466f-3p üleekspressiooni korral (võrdle II tulpa I ja III tulpadega, parempoolne alumine histogramm joonisel 2A). Paralleelselt inhibeerisime endogeenset miR-466f-3p-d, kasutades miR-käsna. Nagu näha, ei olnud miR-466f{-3p-inhibeerimise ja kontrollrühmade vahel olulist erinevust dendriitide harude arvus (võrdle IV tulpa I ja V tulpadega, parempoolne ülemine histogramm, joonis 2A) , kuid miR-466f-3p-inhibeerimise rühmas vähenes dendriidi keskmine kogupikkus ning ka primaarsete ja sekundaarsete dendriitide keskmine pikkus võrreldes teiste rühmadega (võrrelge IV tulpa I tulpadega ja V, parempoolne alumine histogramm joonisel 2A). Lisaks näitas IF-värvimine, et miR- 466f-3p üleekspressioon, kuid mitte inhibeerimine, suurendas ka dendriitsete selgroogude tihedust (joonis 2B, ülemised paneelid ja alumine vasakpoolne histogramm). Viisime läbi ka kaasvärvimise postsünaptilise tihedusega valgu 95 (PSD-95) jaoks ja loendasime kolokaliseerunud dendriitsete selgroogude tiheduse, et määrata ergastavate sünapside täpne arv (joonis 2B, alumine parem histogramm), mis näitas, et miR{{40 }}f-3p üleekspressioon suurendas PSD-95-positiivsete selgroogude tihedust võrreldes teiste kontrollrühmadega. Siiski ei muutnud miR-466f-3p inhibeerimine märkimisväärselt PSD-95--positiivsete selgroogude tihedust kontrollrühmade omaga võrreldes (joonis 2B, alumine parempoolne histogramm). Need andmed näitavad koos, et neuronaalse stimulatsiooni puudumisel ei mõjuta miR-466f-3p inhibeerimine üksi ergastavate sünapside tihedust ega kogu dendriitide selgroogu.