1. OSA Akteosiid pärsib RANKL-i vahendatud osteoklastogeneesi, inhibeerides C-Fos induktsiooni ja NF-KB rada ning nõrgendades ROS-i tootmist

Seung-Youp Lee^1,2., Keun-Soo Lee^3.¤, Meri Hyun Yi^2., Sung-Ho Kook², Jeong-Chae Lee^2,3*

1 Chonbuki riikliku ülikooli kliinilise meditsiini uurimisinstituut, Chonbuki riikliku ülikooli haigla biomeditsiiniliste uuringute instituut, Jeonju, Chonbuk, Lõuna-Korea, 2 ortodontia osakond, suubioteaduste instituut ja hambaarstikool, Chonbuki riiklik ülikool, Jeonju, Chonbuk, lõuna Korea, 3 bioaktiivsete materjalide teaduste osakond, bioaktiivsete materjalide uurimiskeskus, Chonbuki riiklik ülikool, Jeonju, Chonbuk, Lõuna-Korea

Abstraktne

Paljud uuringud on teatanud, et põletikulised tsütokiinid on olulised osteoklastogeneesi vahendajad, põhjustades seeläbi liigset luu resorptsiooni ja osteoporoosi.Akteosiid, peamine toimeaineRehmannia glutinosa, mida kasutatakse laialdaselt traditsioonilises idamaade meditsiinis, omab põletikuvastast ja antioksüdantset potentsiaali. Selles uuringus leidsime, etakteosiidinhibeeris märkimisväärselt osteoklastide diferentseerumist ja moodustumist luuüdi makrofaagidest (BMM) ja RAW264.7 makrofaagidest, mida stimuleeris tuumafaktor-kappaB (NF-kB) ligandi (RANKL) retseptori aktivaator. Eeltöötlus akteosiidiga takistas ka luu resorptsiooni küpsete osteoklastide poolt annusest sõltuval viisil.Akteosiid(10 mM) nõrgendas RANKL-i poolt stimuleeritud p38 kinaasi, ekstratsellulaarse signaaliga reguleeritud kinaasi ja c-Jun N-terminaalse kinaasi aktivatsiooni ning pärssis ka NF-KB aktivatsiooni, inhibeerides p65 subühiku ja inhibiitori kBa fosforüülimist. Lisaks suureneb RANKL-i vahendatud c-Fos ja aktiveeritud T-rakkude tuumafaktori, tsütoplasma 1 (NFATc1) ekspressioon ning kasvaja nekroosifaktor-a, interleukiini (IL)-1b tootmine. , ja IL-6 pärssis ilmselt eeltöötlus akteosiidiga. Lisaks suulineakteosiidvähendas ovariektoomiast põhjustatud luukadu ja põletikuliste tsütokiinide tootmist kontrolltasemele. Meie andmed viitavad selleleakteosiidpärsib osteoklastide diferentseerumist ja küpsemist osteoklastiliste prekursoritest, pärssides mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaaside ja transkriptsioonifaktorite, nagu NF-kB, c-Fos ja NFATc1, RANKL-i poolt indutseeritud aktivatsiooni. Kokkuvõttes viitavad need tulemused selleleakteosiidvõib toimida resorptsioonivastase ainena luumassi vähendamiseks, blokeerides osteoklastide aktivatsiooni.

Lisateabe saamiseks võtke ühendust:emily.li@wecistanche.com

Sissejuhatus

Osteoklastide ja osteoblastide tasakaalustatud aktiivsus muudab luud pidevalt ümber [1]. Osteoklastid tekivad monotsüütide/makrofaagide liini hematopoeetilistest prekursorrakkudest, samas kui osteoblastid kuuluvad mesenhümaalsesse liini [2]. Ebanormaalne osteoklastide aktivatsioon või vähenenud osteoblastogenees võivad häirida luu homöostaasi, põhjustades lõpuks selliseid haigusi nagu osteoporoos, artriit ja luuvähk [3,4]. Osteoporoos on tavaline luuhaigus, mis suurendab luumurdude riski. Kõige tavalisem osteoporoosi vorm on menopausis naistel põhjustatud östrogeenipuudusest. Ravimid, nagu kortikosteroidid ja epilepsiavastased ravimid, võivad samuti põhjustada tasakaalustamatust luu resorptsiooni ja moodustumise vahel, mis võib põhjustada osteoporoosi [5]. Osteoporoosi raviks on kasutatud paljusid resorptsioonivastaseid inhibiitoreid, sealhulgas bisfosfonaate, kaltsitoniini, östrogeeni ja selektiivseid östrogeeniretseptori modulaatoreid. Need inhibiitorid säilitavad luumassi, pärssides osteoklastide funktsiooni [6]. Östrogeeniasendusravi on menopausijärgse osteoporoosi ennetamiseks ja raviks kõige populaarsem ravi. Pikaajaline östrogeeniasendusravi võib aga suurendada endomeetriumi- ja rinnavähi riski. Seetõttu on paljud uurijad suunanud oma jõupingutused uue resorptsioonivastase aine väljatöötamisele, millel pole kõrvaltoimeid [7–10]. Kuna osteoklastid toimivad luu resorptsioonis, on paljudes uuringutes peetud peamiseks sihtmärgiks osteoklastide spetsiifilist inhibeerimist. Osteoklastid on mitmetuumalised hiidrakud, mille moodustavad monotsüütide/makrofaagide perekonna mononukleaarsed eellasrakud hematopoeetiliste prekursorrakkude järjestikuse proliferatsiooni, diferentseerumise ja liitmise kaudu [11]. Makrofaagide kolooniaid stimuleeriv faktor (M-CSF) ja tuumafaktori (NF)-KB (RANK) ligandi (RANKL) retseptori aktivaator on osteoklastide diferentseerumise olulised tegurid[12]. Lisaks aitavad mitmed põletikulised tsütokiinid, nagu kasvaja nekroosifaktor (TNF) ja interleukiin (IL)-1b, osteoklastogeneesi, moduleerides RANKL-i, osteoprotegeriini ja M-CSF-i indutseerimist [7,13]. RANKL-i seondumine rakupinna RANK-retseptoriga põhjustab RANKL/RANK/TNFR-i

seotud faktorite (TRAF) kompleksid, mis aktiveerivad järjestikku NFkB ja mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaase (MAPK), sealhulgas cJun N-terminaalne kinaas (JNK), p38 kinaas ja ekstratsellulaarne signaaliga seotud kinaas (ERK) [14]. See aktiveerimine mängib võtmerolli osteoklastide diferentseerumise, aktivatsiooni ja ellujäämise vahendamisel. RANKL aktiveerib ka selliste transkriptsioonifaktorite ekspressiooni nagu aktiveeritud T-rakkude tuumafaktor, tsütoplasmaatiline 1 (NFATc1) ja-Fos, mis on osteoklastide arenguks olulised. 7,9]. Seetõttu peetakse RANKL-i signaaliülekannet osteoklastide aktivatsiooni pärssivate ja luudeta resorptsioonivastaste ainete peamiseks sihtmärgiks.Akteosiidon Rehmannia glutinosa peamine aktiivne ühend, mida kasutatakse laialdaselt traditsioonilises idamaade meditsiinis [15,16].Akteosiidon tugev antioksüdant ning sellel on hepatotoksiline, põletikuvastane ja notsitseptiivne toime [17–20]. Varem leidsime selleakteosiidvähendab türosinaasi aktiivsust ja melaniini biosünteesi, reguleerides ERK signaaliülekannet [21], kaitseb reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) vahendatud igemekahjustuste eest[22] ja pärsib mükotoksiinide poolt vahendatud rakukahjustusi [23]. Need mõjud on tihedalt seotudakteosiidvõime eemaldada ROS-i ja reguleerida MAPK-vahendatud signaalimist. Eelkõige soovitatakse ROS-i vahendada RANKL-i indutseeritud signaaliradade ja rakuliste sündmuste vahendamiseks osteoklastides. Eeltöötlemine antioksüdantidega pärssis RANKL-i poolt indutseeritud NF-kB, ERK ja IkBa aktivatsiooni, pärssides seeläbi osteoklastogeneesi [24]. Need leiud viitavad tugevalt sellele, et lisaks põletikuvastasele toimele on antioksüdantne aktiivsus resorptsioonivastase aine jaoks ülioluline, seegaakteosiidvõib pärssida RANKL-i indutseeritud osteoklastogeneesi. Käesolevas uuringus uurisime, kasakteosiidomab terapeutilist toimet luuhõrenemisele. Uurisime mõjusidakteosiidosteoklastide diferentseerumise ja luu resorptsiooni ning sellega seotud rakumehhanismide kohta, kasutades in vitro ja in vivo katsesüsteeme.

akteosiid

Materjalid ja meetodid

Eetikaavaldus

Loomade hooldamise ja kasutamise tavad kiitis heaks Chonbuki riikliku ülikooli laboriloomade hooldamise ja kasutamise eetikakomitee (loa nr CBU 2010-0007). Kõik selle uuringu katsed viidi läbi vastavalt ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee juhistele.

Hiired, kemikaalid ja laboritarbed

Nelja nädala vanused emased ICR-hiired osteti ettevõttest OrientBio Inc. (Soul, Korea) ja neid hoiti temperatuuril 2261 uC ja 5565% niiskuse juures 12-tunnise valguse/pimeduse tsükliga, kus oli vaba juurdepääs toidule ja veele. Akteosiid (3,4-dihüdroksü-b-fenetüül-Oa-ramnopüranoossüül-(1R3)-4-O-kofeoüül-bD-glükopüranosiid; C29H36O15) (joonis S1) eraldati Rehmannia lehtedest glutinosa. Akteosiid lahustati enne kasutamist fosfaatpuhverdatud soolalahuses (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 ja M-CSF osteti teadus- ja arendussüsteemidest (Minneapolis, MN, USA). C-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa ja b-aktiini spetsiifilised antikehad saadi ettevõttest Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) ). Antikehad p-p38 ja p38 jaoks osteti ettevõttest Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Seerumi biokeemiliste parameetrite määramiseks osteti CalciumAssay ja Osteocalcin (OC) EIA komplektid firmalt BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) ja Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA). Seerumi TRAP5b taseme mõõtmiseks kasutati ka hiire tartraadiresistentset happefosfataasi (TRAP) testikomplekti (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA). Kui pole teisiti täpsustatud, saadi täiendavaid kemikaale ettevõttelt Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) ja laboritarbed olid ettevõttest SPL Life Sciences (Pochun, Lõuna-Korea).

Rakukultuurid

Luuüdi rakud saadi 6 nädala vanuste emaste ICR-hiirte sääreluust ja reieluust vastavalt eelnevalt kirjeldatud meetoditele [25]. Luuüdi suspensiooni inkubeeriti 50 ng/ml M-CSF juuresolekul 100-mm kultuuritassis. 3 päeva pärast kasutati kleepuvaid rakke luuüdi makrofaagidena (BMM), et kutsuda esile osteoklastide diferentseerumist. Mõnda luuüdi rakke inkubeeriti ka 48 tundi ilma M-CSF-ita ja kleepuvaid rakke kultiveeriti osteoblastide diferentseerivas söötmes, nagu on kirjeldatud mujal [25]. RAW264.7 makrofaagirakke kasvatati Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötmes (DMEM), millele oli lisatud 10 protsenti veise loote seerumit (FBS), 2 mM L glutamiini ja antibiootikume. Neid rakke kasutati BMM-i vaste rakuliinina, et uurida akteosiidi mõju osteoklastogeneesile.

Osteoklastiline diferentseerumine ja TRAP-värvimine

BMM-e töödeldi 2 tundi erineva kontsentratsiooniga (0–50 mM) akteosiidiga, enne kui stimuleeriti 100 ng/ml RANKL-iga. Kultuurisööde asendati 2. ja 5. päeval värske söötmega. Pärast 7-päevast inkubeerimist fikseeriti kultuurid 4% PBS-puhverdatud paraformaldehüüdis ja värviti TRAP-ga, kasutades sigma Aldrichi komplekti vastavalt tootja juhistele. TRAP-positiivsed rakud loendati optilise mikroskoopia abil ja 3 või enamat tuuma sisaldavaid rakke peeti osteoklastideks. RAW 264.7 rakke eksponeeriti ka 100 ng/ml RANKL-iga pärast 2-tunnist eeltöötlemist akteosiidiga ja pärast 7-päevast inkubeerimist, rakke töödeldi TRAP-värvimiseks.

Rakkude elujõulisuse mõõtmine

Rakkude elujõulisus määrati vees lahustuva tetrasooliumsoola (WST)-8 reaktiivi abil. Lühidalt, BMM-e või RAW264.7 rakke, mida kasvatati 10% FBS-i ja antibiootikume sisaldavas kasvusöötmes, töödeldi 10 mM akteosiidi või fenoolsete ühenditega, nagu kvertsetiin, luteoliin, apigeniin või epigallokatehhiin{6}}gallaat (EGCG). WST-8 reaktiiv lisati kultuuridele pärast 48-tunnist inkubeerimist. Pärast täiendavat 4-tunnist inkubeerimist mõõdeti WST-spetsiifilist neeldumist lainepikkusel 450 nm, kasutades mikroplaadilugejat (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Luu resorptsiooni test

BMM-id (16105 rakku/ml) suspendeeriti a-MEM-is, mis sisaldas 50 ng/ml M-CSF-i ja 100 ng/ml RANKL-i, seejärel jaotati kaltsiumfosfaadi nanokristallidega (OAAS{{6}) kaetud 24-süvendplaadile. Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Lõuna-Korea) tihedusega 26104 rakku/cm2 koos akteosiidiga ja ilma. Pärast 7-päevast inkubeerimist eemaldati rakud plaatidelt 5-protsendilise naatriumhüpokloritiga ja optilise mikroskoobi all jälgiti süvendite moodustumist. Resorbeeritud ala mõõdeti ka pildianalüsaatoriga ja väljendati protsendina kontrollväärtusest.

Western blot analüüs

Terved valgulüsaadid valmistati lüüsipuhvris, nagu on kirjeldatud mujal [26]. Tsütosoolsed ja tuumavalgud valmistati eelnevalt kirjeldatud viisil [25]. Võrdsed kogused valguekstrakti eraldati 12–15% SDS-PAGE-ga ja blotiti polüvinüüldifluoriidmembraanidele. Blotte sondeeriti primaarsete antikehadega üleöö temperatuuril 4 °C, enne kui inkubeeriti sekundaarse antikehaga blokeerimispuhvris 1 tund. Blotid töötati välja täiustatud kemoluminestsentsiga (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) ja eksponeeriti röntgenkiirtega (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).

MAPK aktiivsuse test

Rakke töödeldi eelnevalt akteosiidiga 2 tundi ja seejärel stimuleeriti RANKL-iga veel -30 min. MAPK aktiivsuse määramiseks kasutati immunomeetrilisi analüüsikomplekte, nagu p-p38kinaasi testikomplekt (Assay Designs, Inc., MI, USA), p-ERK ensüümianalüüsi komplekt (Assay Designs) ja p-SAPK/JNK sandwich ELISA komplekt. Cell Signaling Technology, MA, USA). Kõik protseduurid järgisid tootja juhiseid ja neeldumist mõõdeti mikroplaadilugejaga.

Elektroforeetilise liikuvuse nihke test (EMSA)

DNA-valgu sidumisreaktsioonid viidi läbi 3 0 min toatemperatuuril, 10–15 mg valku 20 ml puhvris, mis sisaldas 1 mg/ml BSA-d, 0,5 mg/ml polü(dI-dC), 5 protsenti glütserooli. ,1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30, 000 CPM [a-32P] dCTP-märgistatud oligonukleotiide ja Klenowi fragment DNA polümeraasist. Proovid eraldati 6-protsendilistel polüakrüülamiidgeelidel, mis kuivatati ja eksponeeriti röntgenfilmiga (Eastman Kodak Co.) 12–24 tundi temperatuuril 270 °C. NF-le spetsiifilised oligonukleotiidpraimeri järjestused olid 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 ja 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

NF-kB lutsiferaasi test

RAW264.7 makrofaagid 24-süvendiplaatidel transfekteeriti 0,8 mg kB-lutsiferaasi reportervektoriga, kasutades 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. 24 tundi pärast transfektsiooni stimuleeriti rakke RANKL-iga rakkude juuresolekul ja puudumiselakteosiid24 tunniks. Rakud resuspendeeriti 100 ml reporterlüüsipuhvris (Promega, Madison, WI, USA). Võrdsed kogused valguproove asetati 96-süvendiga mikroplaatidele ja segati lutsiferaasi substraadiga. Luminestsentsi mõõdeti mikroplaadi luminomeetriga (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksamaa). Selles katses kasutati positiivse kB inhibiitorina läbilaskvat NF-B inhibiitorpeptiidi (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA).

Tsütokiinide mõõtmine

BMM-e või RAW264.7 rakke stimuleeriti RANKL-iga akteosiidi juuresolekul 24-augukultuuriplaatidel. Pärast 48-tunnist inkubeerimist koguti kultuuri supernatandid ja hinnati ELISA meetodil, kasutades TNF-a-, IL-1b- ja IL-6--spetsiifilisi OptEIATM komplekte vastavalt tootja juhistele.

Reaalajas pöördtranskriptsiooni polümeraasi ahelreaktsioon (RT-PCR)

Osteoklastiliste markerite, nagu c-Fos, NFATc1 ja TNF-a, mRNA ekspressioon määrati reaalajas RT-PCR abil. Lühidalt, kogu RNA ekstraheeriti makrofaagidest Trizolreagendiga vastavalt tootja juhistele (Invitrogen). cDNA sünteesiti 1 mg kogu RNA-ga, kasutades SuperScriptReverse Transcriptase II ja praimereid (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mixi (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) kasutati PCR-i produkti kogunemise tuvastamiseks tsükli ajal järjestuse tuvastamise süsteemiga ABI 7500 (AppliedBiosystems). Pärast denatureerimist 95 uC juures 10 minutit tehti PCR

Intratsellulaarse ROS-i mõõtmine

29,79-diklorodihüdrofluorestseiindiatsetaadi (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Saksamaa) põhilahus valmistati DMSO-s ja seda säilitati temperatuuril 220 uC pimedas. Lühidalt öeldes kultiveeriti BMM-e (106 rakku/ml 6-süvendiplaatidel) 24 tundi 50 ng/MLM-CSF-iga ja seejärel töödeldi 2 tundi enne 100 uM-ga stimuleerimist erinevate kontsentratsioonide (0–10 mM) akteosiidiga. ng/ml RANKL. Pärast 1-tunnist koosinkubeerimist inkubeeriti neid rakke 30 minutit 25 mM DCFH-DA-ga. 29,79-diklorofluorestseiini (DCF) roheline fluorestsents registreeriti 515 nm (FL 1) juures, kasutades FACS VantageH süsteemi (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) ja 10,000 sündmust loeti iga proovi kohta.

Munasarjade eemaldamisest põhjustatud osteoporoosi esilekutsumine

Selles uuringus kasutati emaseid ICR-hiiri (6 nädala vanused). Hiirtele tehti anesteesia all võltsoperatsioon (Sham, n=10) või kirurgiline munasarjade eemaldamine (OVX, n=20). Nädal pärast operatsiooni jagati OVX hiired juhuslikult kahte rühma, igaühes 10 hiirt: kahepoolne OVX ja kahepoolne OVX, millele oli lisatud 200 ml PBS, mis sisaldas suukaudselt 1 mM akteosiidi (AC rühm). Suulineakteosiidmanustati üks kord iga 3 päeva järel 8 nädala jooksul pärast operatsiooni ja sama kogus PBS-i manustati Sham- ja OVX-rühmadele. Pärast 1-päevast viimast manustamist hiired surmati ja seejärel analüüsiti seerumi biokeemilisi parameetreid ja 3-mõõtmelist luustruktuuri.

Seerumi biokeemiliste parameetrite määramine

Vereproovid koguti südame punktsiooniga ja seerum koguti tsentrifuugimisega. Biokeemiliste parameetrite analüüsimiseks säilitati seerumiproove temperatuuril 280 uC. IL-1b ja IL-6 seerumitasemeid hinnati ELISA komplekti abil, nagu ülalpool kirjeldatud, samas kui aluselise fosfataasi (ALP) aktiivsus määrati biokeemilise kolorimeetrilise testiga, mis mõõdab p kogust. -nitrofenool, mis on toodetud p-nitrofenoolfosfaadi substraadist, nagu on kirjeldatud mujal [27]. Luu moodustumise ja resorptsiooni biomarkerite hindamiseks määrati vastavalt tootja juhistele ka seerumi OC, kaltsiumi ja TRAP5b tase.

Luu struktuuri ja morfomeetriliste parameetrite analüüsid

Hiirte (Sham, OVX ja AC rühmad) reieluud lõigati lahti ja täideti füsioloogilise soolalahusega mehaaniliseks testimiseks. Reieluu mehaanilist tugevust mõõdeti nii, nagu on kirjeldatud mujal [28]. Murdekoormus registreeriti tippjõuna njuutonites kohas, kus parema reieluu keskosa murdub. Lisaks analüüsiti iga looma kerget reieluu histomorfomeetriliselt, kasutades mikrokompuutertomograafia (mikro-CT) süsteemi (SkyScan 1076 mikrofookusega röntgenisüsteem, Kontich, Belgia). Lühidalt öeldes kuivatati 4-protsendilises formaldehüüdihoidlas olevad luud pindmiselt paberrätikul, enne kui need pakkiti plastkilesse või parakilesse, et vältida kuivamist skaneerimise ajal. Iga plastikuga mähitud luu asetati vahtplastist/polüstüreenist torudesse, mis paigaldati mikro-CT-kuvamiseks 1076 skanneri proovikambrisse vertikaalselt horisontaalselt. Skaneerimine viidi läbi 100 kV allika pinge ja 140 mA allika vooluga 35 mm eraldusvõimega. Reieluu trabekulaarsete luude kolmemõõtmelised mudelid rekonstrueeriti SkyScan CT Analyzeri versiooni 1.11 abil. Struktuuriparameetrid, nagu trabekulaarne luu mineraaltihedus (BMD, g/cm3), luumahu protsent (luumaht (BV)/koe maht (TV), protsent), paksus (Tb.Th, mm), eraldumine (Tb.Sp , mm) ja arv (Tb.N, 1/mm) mõõdeti seejärel.

Osteogeense diferentseerumise ja mineralisatsiooni test

{{{{10}}}}süvendiga kultiveerimisplaatidel kasvatatud luuüdi rakke töödeldi DAG-ga (10 nM deksametasoon, 50 mM askorbiinhape ja 20 mM b-glütserofosfaat) 10 mM akteosiidi juuresolekul. Pärast 2-nädalast diferentseerumist fikseeriti rakud 1 tund jääkülma 70-protsendilise (maht/maht) etanooliga ja värviti 0,2-protsendilise alisariinpunase Siniga destilleeritud veega 30 minutit toatemperatuuril. Pärast rakkude eemaldamist ja õhu käes kuivatamist hinnati rakukultuuri plaate valgusmikroskoopia abil, kasutades pöördmikroskoobi (Nikon TS100, Jaapan). Punase värvaine koguse määramiseks elueeriti plekki 10% atsetüülpüridiiniumkloriidiga, loksutades 20 minutit ja neeldumist mõõdeti lainepikkusel 560 nm. Rakukihtidesse ladestunud kaltsiumi kogust mõõdeti ka Calcium Kitiga (Wako Chemical Inc. Osaka, Jaapan) vastavalt tootja juhistele. Lisaks määrati reaalajas RT-PCR abil luu-spetsiifiliste mRNA markerite, nagu runt-seotud transkriptsioonifaktor -2(Runx2), osterix, luu sialoproteiin (BSP) ja OC ekspressioon. Nende markerite oligonukleotiidpraimerid kavandati toote suurusega alla 200 bp, kasutades PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems), nagu on kirjeldatud mujal[27].

Statistiline analüüs

Kui pole teisiti näidatud, on kõik andmed väljendatud 3 või enama sõltumatu katse keskmise6 standardhälbe (SD) väärtusena. Mitme võrdluse jaoks kasutati ühesuunalist ANOVA-d, kasutades SPSS-i versiooni 12.0 tarkvara. Statistiliselt oluliseks peeti p-väärtust 0,05.

Tulemused

Akteosiid pärsib makrofagesiinide poolt osteoklastide moodustumist annusest sõltuval viisil

Et kontrollida akteosiidi mõju BMM-i diferentseerumisele osteoklastideks, kultiveeriti rakke erinevates kontsentratsioonides (0–20 mM) akteosiidiga 7 päeva 50 ng/ml M CSF ja 100 ng/ml RANKL juuresolekul. . Akteosiid vähendas osteoklastide arvu annusest sõltuval viisil. Kui rakke töödeldi 2 tundi 10 mM akteosiidiga, vähenes osteoklastide arv 43 protsenti võrreldes rakkudega, millele oli lisatud M-CSF ja RANKL (joonis 1A). Joonis fig 1B näitab RANKL-i vahendatud osteoklastide diferentseerumist ja selle inhibeerimist kombineeritud ravi korral akteosiidiga. Kooskõlas selle tulemusega vähendas akteosiidi eeltöötlus RAW264.7 rakkude RANKL-i poolt stimuleeritud diferentseerumist ja osteoklastide moodustumist (joonised 1C ja D). Kui akteosiidi osteoklastivastast potentsiaali BMM-idel võrreldi mitme fenoolühendi osteoklastide vastase potentsiaaliga samal kontsentratsioonil (10 mM), oli luteoliinil suurim aktiivsus (joonis 2A). Kuid luteoliin, kvertsetiin või apigeniin ise vähendas rakkude elujõulisust (joonis 2B). Kõik ühendid inhibeerisid osteoklastilist diferentseerumist RAW264.7 makrofaagide poolt järgmiste suhteliste aktiivsustega: luteoliin. kvertsetiin=apigeniin .EGCG=akteosiid (joonis 2C). Luteoliin, kvertsetiin või apigeniin ise näitasid samuti rakkude elujõulisuse vähenemist (joonis 2D). Seevastu kvertsetiinravi põhjustas elujõulisuse olulise vähenemise nii BMM-ides kui ka RAW264.7 rakkudes, kui neid rakke eksponeeriti 2 päeva jooksul 10 mM iga ühendiga koos 50 ng/ml M-CSF-iga, 100 ng/ml RANKL-iga, või mõlemad (andmeid pole näidatud). Kui nende ühendite kontsentratsioon on vajalik, et inhibeerida 50 protsenti

osteoklastide moodustumine BMM-ides (IC50) arvutati kontsentratsiooni-aktiivsuse kõverate abil, akteosiidi, kvertsetiini, luteoliini, apigeniini ja EGCG IC50 oli vastavalt 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 ja 6,6 mM (joonis 2E). See tulemus oli sarnane juhtumiga, kus uuriti RAW264.7 makrofaage. Need andmed viitasid sellele, et luteoliinil ja kvertsetiinil oli suurem klastogeenne toime kui akteosiidil. Seevastu kvertsetiinil oli IC50 juures ka kerge toksiline toime rakkudele (andmeid pole näidatud).

AkteosiidInhibeerib luu resorptsiooni makrofaagide poolt Akteosiid takistas ka RANKL-i vahendatud luu resorptsiooni annusest sõltuval viisil, mõõdetuna in vitro mudelsüsteemiga (joonis 3A). Luu resorptsioon inhibeeriti oluliselt, kui BMM-e inkubeeriti 1 mM akteosiidiga (joonis 3B). 10 mM akteosiidiga töötlemine nõrgendas peaaegu täielikult RANKL-i indutseeritud süvendite moodustumist BMM-ide poolt. Samamoodi vähendas akteosiid luu resorptsiooni RANKL-i poolt stimuleeritud RAW264.7 rakkudes (joonised S2A ja B). Võimeakteosiidluu resorptsiooni pärssimine sõltus ravi ajastust võrreldes RANKL-i stimulatsiooniga. 4 päeva pärast RANKL-i stimuleerimist lisatud akteosiid (10 mM) ei vähendanud BMM-ides süvendite moodustumist, samas kui see pärssis moodustunud osteoklastide arvu (joonis 3C). See erinev tulemus oli osaliselt tingitud süvendipiirkonnast, mis tekkis juba pärast 4-päevast RANKL-i stimulatsiooni moodustumist (joonis 3D).

AkteosiidReguleerib alla RANKL-i varaseid signaaliradu

RANKL kutsub esile 3 tuntud MAPK ja NF-KB aktivatsiooni osteoklastide prekursorites ning see aktiveerimine on vajalik osteoklastide varase diferentseerumise jaoks. Et mõista võimalikke mehhanisme, mille abil akteosiid inhibeerib osteoklastogeneesi, uurisime akteosiidi mõju MAPK-dele ja NF-B aktivatsioonile makrofaagides. BMM-e ja RAW264.7 rakke töödeldi 10 mM akteosiidiga 2 tundi ja seejärel stimuleeriti 100 ng/ml RANKL-iga 30 minutit. MAPK fosforüülimist uuriti Western blot analüüsi ja immunomeetrilise analüüsi abil. RANKL indutseeris p38, ERK ja JNK fosforüülimise BMM-ides (joonis 4A) ja RAW264.7 rakkudes (joonis 4B). Akteosiid hoidis ära need RANKL-i indutseeritud p-p38, p-ERK ja p-JNK suurenemised. Seda tulemust toetas immunomeetriline analüüs, mis eeltöötlus 10 mM akteosiidiga inhibeeris märkimisväärselt fosforüülitud MAPK-de taset nendes makrofaagides (joonis 4C). RANKL-ravi suurendas NF-kB DNA-ga seondumist, samas kui akteosiid inhibeeris RANKL-i poolt indutseeritud NF-kB-DNA seondumise aktivatsiooni (joonis 5A). See inhibeerimine oli BMM-ides silmatorkavam kui RAW264.7 rakkudes. Akteosiid vähendas ka RANKL-i poolt stimuleeritud p65 ja IkBa fosforüülimist BMM-ides ja RAW264.7 rakkudes (joonised 5B ja C). 10 mMakteosiidi lisamine inhibeeris peaaegu täielikult nii IkBa lagunemise kui ka aktiveerimise BMM-ides (joonis 5B). Et täiendavalt kinnitada, et NF kB aktiveerimine on seotud akteosiidi toimega, transfekteeriti kB promootor-lutsiferaasi konstruktid ajutiselt RAW264.7 rakkudesse. Rakkudel, mida inkubeeriti 100 ng/ml RANKL-iga, oli 3- korda kõrgem kB promootori aktiivsus, mida 10 mM akteosiid oluliselt nõrgendas (joonis 5D).

Akteosiid pärsib põletikuliste tsütokiinide tootmist ning TNF-a, c-Fos ja NFATc1 ekspressiooni RANKL-i poolt stimuleeritud makrofaagides

TNF-a, IL-1b ja IL-6 on olulised osteoklastide moodustumisel ja funktsioneerimisel, mida vahendab NF-kB signaalimine RANKL-i poolt stimuleeritud makrofaagides. RANKL stimuleeris nende tsütokiinide tootmist ja see produktsioon vähenes märgatavalt 10 mM akteosiidi eeltöötlemisel BMM-ides (joonis 6A). Samamoodi nõrgendas akteosiid RAW264.7 makrofaagides RANKL-i indutseeritud tsütokiinide tootmist, välja arvatud IL-6 (joonis S3). Akteosiidi toime molekulaarsete mehhanismide mõistmiseks osteoklastogeneesis uurisime täiendavalt akteosiidi mõju TNF-a, c-Fos ja NFATc1 ekspressioonile. RANKL reguleeris nende tegurite mRNA ekspressiooni BMM-ides ja RAW264.7 rakkudes (joonised 6B ja C). Eeltöötlemine 10 mM akteosiidiga inhibeeris oluliselt nende tegurite RANKL-i poolt indutseeritud ekspressiooni mõlemas

BMM-id ja RAW264.7 rakud. Eeltöötlus akteosiidiga vähendas samuti tugevalt c-Fos ja NFATc1 valgu taset RANKL-i poolt stimuleeritud BMM-ides (joonis 6D). Need tulemused viitavad selleleakteosiidreguleerib alla RANKL-i, indutseerivad osteoklastide moodustumise vahendajaid geeni- ja valgu tasemel.

Akteosiid vähendab intratsellulaarset ROS-i teket BMM-ides annusest sõltuval viisil

Kuna on teada, et rakusisene ROS-i tootmine on korrelatsioonis RANKL-i poolt stimuleeritud osteoklastogeneesiga, uurisime, kas akteosiid inhibeerib ROS-i tootmist RANKL-i vahendatud osteoklastide diferentseerumise ajal, kasutades rakku läbilaskvat, oksüdatsioonitundlikku värvi DCFH-DA. Voolutsütomeetria analüüs näitas, et DCF-le spetsiifiline keskmine fluorestsentssignaal BMM-is oli pärast RANKL-iga stimuleerimist nähtavasti paremale nihkunud, võrreldes töötlemata kontrollrakkudega (joonis 7A). See nihe oli sarnane juhtumiga, kus pärast RANKL-i stimuleerimist täheldati RAW264.7 makrofaage (andmeid pole näidatud). BMM-ide töötlemine akteosiidiga vähendas DCF signaali intensiivsust annusest sõltuval viisil. Eeltöötlemine 10 mM akteosiidiga vähendas peaaegu täielikult osteoklastide diferentseerumise käigus tekkiva rakusisese ROS tasemed töötlemata kontrolltasemetele (joonis 7B).

Suukaudne akteosiidi manustamine pärsib osteoporoosi biokeemiliste markerite muutumist ja luukadu munasarjade eemaldatud hiirtel

Et uurida akteosiidi mõju luukadudele, valmistasime munasarjade eemaldamise teel osteoporoosi loomamudeli. Katseperioodil ei olnud OVX ja Shammice vahel olulist kehakaalu erinevust (andmeid pole näidatud). Rühmas oli seerumi IL{0}}b ja IL-6 tase oluliselt kõrgem kui võltsrühmal (joonis 8). Munasarjade eemaldamisest põhjustatud nende põletikuliste tsütokiinide suurenemist nõrgendas suukaudne akteosiidi manustamine (AC-rühm). Luuvahetuse markerite, nagu ALP, kaltsiumi, TRAP5b ja OC, seerumitasemed tõusid OVX rühmas märkimisväärselt. Nendest osteoporoosimarkeritest inhibeeris akteosiidiga ravi ilmselt kaltsiumi, TRAP5b ja OC suurenenud taset OVX hiirtel, samas kui ALP seerumi taset ravi ei muutnud. Keskmine maksimaalne murdekoormus parema reieluu võlli keskkohani oli OVX rühmas oluliselt väiksem kui Sham rühmas (joonis 9A). Ravi akteosiidiga suurendas luumurdude maksimaalset varu Sham-rühma omale. Kui reieluu kortikaalne luu lõigati lahti ja vaadeldi optilise mikroskoobiga, olid OVX rühmas näidatud osteoporoosi tunnused AC hiirtel peaaegu täielikult kadunud (joonis 9B). Et kontrollida akteosiidi mõju OVX-indutseeritud osteoporoosi mudelile, analüüsiti mikro-CT abil BMD-d ja luu morfoloogilisi parameetreid kerge proksimaalse reieluu trabekulaaris. Nagu on näidatud joonisel 9C, leiti OVX hiirtel reieluu trabekulaarse arhitektuuri muutus, samas kui seda muutust vähendas ravi akteosiidiga. Mikro-CT analüüsi tulemused näitasid, et BMD, luu tugevuse mõõt, vähenes OVX hiirtel dramaatiliselt (joonis 9D). Võrreldes Sham-rühmaga, näitasid OVX hiirtel olulisi muutusi ka BV / TV, Tb. Sp ja Tb. N, kuid mitte Tb.Th. OVX hiirte suukaudne ravi akteosiidiga takistas oluliselt BMD, samuti BV/TV ja Tb.N muutusi.