1. osa: Acteoside represseeritud Microglia M1 polarisatsioon inhibeeritud NF-κB signalisatsiooniraja ja AMPK-vahendatud mitokondrite funktsiooni taastamise kaudu

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-post:audrey.hu@wecistanche.com

Pls kliki siia kuni 2. osani

Abstraktne:

Taust:Alzheimeri tõbi (AD)See on kõige sagedasem dementsuse tüüp. Kuigiacteoside cistanche ürdist(ACT), ühend, mis on eraldatud Cistanchetubulosa, omab neuroprotektiivseid omadusi. Kuid mikroglia polarisatsiooni reguleerimise aluseks olev mehhanism on endiselt halb.Meetodid:Selles rakendati AlCl3-indutseeritud AD mudelit sebra¦sh vastsetes, et paljastada ACT terapeutiline e ̈cacy. BV-2 rakke kasutati ACT rolli demonstreerimiseks mikroglia polarisatsioonil. RNA- Sequence, HPLC-Q-TOF-MS, Western blot ja molekulaarne dokkimine ühendati selle mehhanismiga.Tulemused:ACT signi¦leevendas eksperimentaalset düskineesiat ja närvisüsteemi häireid sebras¦sh. Seejärel pärssis see M1 polarisatsiooni ja edendas M2 fenotüüpi LPS-indutseeritud BV-2 rakkudes. Me demonstreerisime esimest korda, et ACT avaldas sügavat transkriptoomilist mõju, mis hõlmas peamiste signaaliradade reguleerimist §-ammatsioonis, arginiini biosünteesis, samuti pantotenaadi ja CoA biosünteesis, mis korreleerub mitokondri funktsiooniga. ACT(acteoside cistanche ürdist) ravi vähendas mikroglia M1 polariseerimist, pärssides NF-κB signaalirada. Ja metaboolseid radu kinnitas veelgi HPLC-Q-TOF-MS. Lisaks act recti¦ed liigne ROS taastada mitokondrite funktsioon läbi AMPK vahendatud PGC-1α ja UCP-2 upregulatsioon, mis on kooskõlas metaboolsete muutustega. Intrigeerivalt võib ACT otseselt seonduda nii NF-κB kui ka AMPKα-ga, mida tõendab molekulaarne dokkimine.Järeldused:Uuring andis ACT-ile infusiivse mehhanismi ja illustreeris uut perspektiivi, mis põhines mitokondriaalsel düsfunktsioonil, et paljastada seos ainevahetuse ja mikroglia polarisatsiooni vahel.

Taust:

AlzheimeriHaigus(AD) on levinud neurodegeneratiivne haigus, millega kaasnevad kognitiivsed häired ja düskineesia[1]. Seda iseloomustab tõsine neuronaalne kadu, seniilsed naastud ja neuro¦brillaarsed sasipuntrad[2]. AD patogenees on mitmemõõtmeline ja seotud neuroiiniga =ammation. Neuroin§ammatsioon on ajendatud gliaalrakkude aktiveerimisest, mis on tihedalt seotud AD arenguga[3, 4]. Neuroiini progresseerumise ja ägenemise ajal peetakse võtmeteguriks mikrogliat. Microglia on kesknärvisüsteemi peamised immuunrakud. See on tihedalt seotud protsesside kaskaadiga, mis sisaldab aju arengut, säilitades neutraalse keskkonna, samuti reageerides vigastustele ja remondile[1]. Lisaks saab mikrogliat stimuleerida M1 fenotüübiks ja pro-in§ammatiivsete tsütokiinide ekspressioon suureneb neuroiini§ammatsiooniga seotud haiguste, näiteks AD ilmnemisel[5]. Uuringud näitavad ka, et M1 fenotüübi polarisatsiooniga kaasnevad sageli ainevahetushäired[6], mis põhjustavad energia ainevahetuse tasakaalustamatust ja mitokondriaalset düsfunktsiooni[7]. Need kahjulikud muutused tulenevad neurodegeneratsioonist, isegi AD-st.

acteoside cistanche ürdistfenüületanoidi glükosiid (ACT) on peamiselt tuletatud Cistanchetubulosa. Üha rohkem tõendeid on näidanud, et ACT-l oli arvukalt farmakoloogilisi tegevusi, sealhulgas neuroprotektiivset[8], anti-in§ammatory[9] ja antioksüdantide[10] toimet. Eelkõige on teatatud, et ACT parandab streptosotsiinist põhjustatud rottidel õppimis- ja mäluhäireid ning reguleerib energia ainevahetust[11]. Samuti on soovitatud pärssida neuronaalset apoptootilise raku surma ja mitokondriaalset kahjustust eksperimentaalsetes autoimmuunsete entsefalomüeliidi hiirtel[12]. Siiski on vähem uuringuid keskendunud ACT mõjule microglia M1 / M2 polarisatsioonile. Eriti ei ole läbi viidud erinevaid mehhanisme, nagu mitokondrite funktsiooni parandamine ja rakkude ainevahetuse reguleerimine. Lisaks on ACT-i mehhanism aidanud kaasa microglia M1/M2 polarisatsioonile, jäänud uurimata.

Käesoleva aruande eesmärk oli uurida ACT terapeutilist e ̈cacy't ja ACT-i molekulaarset mehhanismi AD-s. Lisaks inhibeeris ACT tõhusalt M1 polarisatsiooni ja soodustas M2 fenotüüpi LPS-indutseeritud BV-2 rakkudes. RNA-Sequencing (RNA-Seq), mis on integreeritud metaboloomika meetodiga, et paremini mõista ACT aluseks olevat mehhanismi mikroglia polarisatsiooni reguleerimisel. Uuriti ainevahetuse ja mikroglia polarisatsiooni vahelist lõhet mitokondriaalse funktsiooni osas. See uuring annab uue austuse ACT kui potentsiaalse terapeutilise aine edasise uurimise vastu AD raviks.

Meetodid:

Loomade ja mudeli grupeerimine:

Selles uuringus valiti metsik tüüpi sebra¦sh (AB tüvi, 4 kuud vana) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Neid hoiti 14/10 h heleda/tumeda tsükli all 28 °C juures, järgides eelmist meetodit[13]. Looduslik väetis ja tavaliselt arenenud embrüod loodi ja kasvatati 3 päeva pärast viljastamist (DPF) valgustusinkubaatoris. Kõik sebra katsed viidi läbi Hiina farmaatsiaülikooli loomaeetika komitee järelevalve all.

Zebra¦sh vastsed jagati kuuesse rühma ja neid töödeldi 3 dpf-lt 7 DPF-le: kontrollrühm, mudelirühm, mudel + donepesiili hüdrokloriidide (DPZ) rühm, mudel + ACT rühmad. Kontrollrühma säilitati keskkonnas 0,2% DMSO-ga ja mudelirühma töödeldi 150 μM AlCl3-ga (pH 5,8). Mudelit + DPZ gruppi töödeldi koos AlCl3 ja 8 μM DPZ-ga. Mudelit + ACT gruppe töödeldi koos AlCl3 ja ACT erinevate kontsentratsioonidega (200, 100, 50 μM). ACT(acteoside cistanche ürdist)(HPLC puhtus ≥ 98%) saadi Ettevõttelt Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Hiina). AlCl3·6H2O ja DPZ osteti Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD., LTD. (Shanghai, Hiina).

Käitumisanalüüs

Zebra¦sh vastsete liikumised registreeriti ViewPointi käitumusliku analüsaatoriga (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) temperatuuril 28 °C. Brie § y, käitumisparameetrid ja tulemuste töötlemine olid kooskõlas varem kehtestatud meetodiga[13]. Siin valiti keskmine kiirus (AS), kiiruse muutus (ΔS), düskineesia taastumiskiirus (DRR) ja vastus e ̈ciency (RE, %), et hinnata düskineesia taastumist sebras¦sh.

Pärast töötlemist 3 DPF-lt 7 DPF-le koguti AChE ja ChAT aktiivsuse mõõtmiseks sebra¦sh vastsed. Tootja protokolli alusel tuvastasid aktiivsuse ensüümidega seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) komplektid (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Hiina). Ja erinevate proovide valgu kontsentratsioonid määrati BCA meetodil.

BV-2 rakud külvati eraldi 6-kaevulisse tassi (n = 6 / rühm). Pärast töötlemist eemaldati keskkond ja rakke pesti kolm korda külma PBS-iga. Seejärel puutub kohe kokku vedela lämmastikuga, et pärssida rakkude ainevahetust. Rakud korjati külma 80% metanooliga (1 ml/kaev) ja suspensioon kanti üle 2 ml Eppendorfi torusse. Valkude sademete hõlbustamiseks keeratakse jõuliselt 1 min ja tsentrifreeritakse 13 000 pööret minutis 15 minutit 4 °C juures. Raku suspensioon kanti üle uude 2 ml Eppendorfi torusse ja kuivatati lämmastikuvoolu all ning seda hoiti kuni analüüsini temperatuuril -80 °C. Kuivatatud jääk taastati 150 μL eelnevalt jahutatud 25% atsetonitriidis. Järjestusanalüüsi stabiilsuse ja täpsuse tagamiseks kombineeriti kvaliteedikontrolli (QC) proovidena võrdsed kogused (10 μL) igast rakuproovist. Metaboliidi avastamise ajal süstiti need proovid pärast iga kuut rakuproovi, et tagada nende stabiilsus. HPLC-Q-TOF-MS-ile süstiti 1 μL aliquot.

HPLC-Q-TOF-MS analüüs viidi läbi Agilent 1290 HPLC süsteemil, mis on ühendatud Agilent 6530 neljakordse lennuaja (Q-TOF) massispektromeetriga (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Eraldamine toimus ACQUITY UPLC BEH C18 veerul (2,1×100 mm, 1,7 μm). Liikuv faas koosnes 0,1% sipelghappeveest (v/v; A) ja atsetonitriil (B).

§ow määraks määrati 0,4 ml/min järgmise optimaalse kaldega elutsiooni tingimusega: 0–2 min, 5% B; 2 kuni 20 min, 5% kuni 95% B (positiivne ioonrežiim); 0 kuni 2 min, 5% B; 2 kuni 20 min, 5% kuni 95% B (negatiivne ioonrežiim). Massispektromeetri tööparameetrid määrati järgmiselt: gaasi temperatuur, 320 °C; kuivatusgaas, 10 L/min; nebulisaator, 35 psi; VCap, 4000 V; fragment, 120 V.

Toorandmeid käitati MassHunteri tööjaama tarkvara versiooni B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) alusel. Toorandmeid töötles eelnevalt XCMS platvorm. Normaliseeritud andmete põhikomponentide analüüs (PCA) ja osaline vähimruutude diskrimineeriv analüüs (PLS-DA) viidi läbi MetaboAnalystiga (https://www.metaboanalyst.ca). Koos kirjandusega erinevad metaboliidid (VIP > 1, T-test P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">