1. osa: Akteosiid toimib interleukiini vastu

Akteosiid toimib interleukiini{0}}indutseeritud kataboolsete protsesside vastu mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaaside ja NFkB raku signaaliraja modulatsiooni kaudu

HyangI Lim ,1 Do Kyung Kim ,1 Tae-Hyeon Kim ,1 Kyeong-Rok Kang ,1 Jeong-Yeon Seo ,1,2 Seung Sik Cho ,3 Younghee Yun ,4,5 Ye-yong Choi ,4,5 Jungtae Leem ,4,5 Hyoun-Woo Kim ,6 Geon-Ung Jo ,6

Chan-Jin Oh, 6 Deuk-Sil Oh, 6 Hong-Sung Chun, 2 ja Jae-Sung Kim 1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

1 Chosuni ülikooli hambaarstiteaduse instituut, Gwangju 61452, Korea Vabariik

2 Biomeditsiiniteaduste osakonnad, Chosuni ülikool, Gwangju 61452, Korea Vabariik

3 Biomeditsiini, tervise ja elu konvergentsiteaduste osakond, BK21 Four, Mokpo riikliku ülikooli farmaatsiakolledž,

Jeonnam 58554, Korea Vabariik

4Chung-Yeoni meditsiiniinstituut, Gwangju 61949, Korea Vabariik

5 Teadus- ja arendusinstituut, CY Pharma Co., Seoul 06224, Korea Vabariik

6Jeollanamdo Forest Resources Institute, Naju, Jeollanamdo, 58213, Korea Vabariik

Kirjavahetus tuleks adresseerida Jae-Sung Kimile; js_kim@chosun.ac.kr

Saabunud 2. juulil 2020; Muudetud 15. veebruaril 2021; Vastu võetud 6. märtsil 2021; Avaldatud 25. märtsil 2021

Akadeemiline toimetaja: Joël R. Drevet

Autoriõigus © 2021 HyangI Lim et al. See on avatud juurdepääsuga artikkel, mida levitatakse CreativeCommonsAttributionLicense'i alusel,

mis võimaldab piiramatut kasutamist, levitamist,ja reprodutseerimine mis tahes andmekandjal, eeldusel, et originaalteosele on õigesti tsiteeritud.

cistanche võib ravida neeruhaigusi, parandada neerufunktsiooni

Osteoartriit (OA) on kõige levinum degeneratiivne liigesehaigus, millega kaasneb krooniline liigesevalu, mis on põhjustatud sünoviaalliigeste liigesekõhre progresseeruvast degeneratsioonist.Akteosiid, kofioüülfenüületanoidglükosiid, omab mitmesuguseid bioloogilisi toimeid, nagu antimikroobne, põletikuvastane, vähivastane, antioksüdatiivne, tsütoprotektiivne ja neuroprotektiivne toime. Lisaks suukaudne manustamineakteosiidsuurtes annustes ei põhjusta genotoksilisust. Seetõttu on käesoleva uuringu eesmärk kontrollida selle antikataboolset toimetakteosiidosteoartriidi ja selle antikataboolse signaaliraja vastu.Akteosiidei vähendanud normaalsete rakkudena kasutatud hiire fibroblasti L929 rakkude ja primaarsete roti kondrotsüütidena kasutatavate rakkude elujõulisust.Akteosiidneutraliseeris IL-1 -indutseeritud proteoglükaanide kadu kondrotsüütides ja liigesekõhredes, pärssides kõhre lagundavate ensüümide, nagu maatriksi metalloproteinaas- (MMP-) 13, MMP-1 ja MMP{{, ekspressiooni ja aktivatsiooni 6}}. Lisaksakteosiidpärssis põletikuliste vahendajate, nagu indutseeritav lämmastikoksiidi süntaas, tsüklooksügenaas-2, lämmastikoksiid ja prostaglandiin E2, ekspressiooni IL-1-ga töödeldud primaarsetes roti kondrotsüütides. Seejärel vähenes põletikku soodustavate tsütokiinide ekspressioonakteosiidIL-1-ga töödeldud primaarsetes roti kondrotsüütides. Veelgi enam, akteosiid ei pärssis mitte ainult mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaaside fosforüülimist IL-1-ga töödeldud primaarsetes roti kondrotsüütides, vaid ka NFkB translokatsiooni tsütosoolist tuuma, pärssides selle fosforüülimist. Akteosiidi 5 ja 10 mg/kg suukaudne manustamine nõrgendas liigesekõhre progresseeruvat degeneratsiooni osteoartriidi hiiremudelis, mis tekkis mediaalse meniski destabiliseerimisel. Meie leiud näitavad, et akteosiid on paljutõotav potentsiaalne antikataboolne aine või täiendus liigesekõhre progresseeruva degeneratsiooni nõrgendamiseks või ärahoidmiseks.

Palun klõpsake siin 2. osa juurde

1. Sissejuhatus

Osteoartriit (OA) on kõige levinum degeneratiivne liigesehaigus, millega kaasneb krooniline liigesevalu, mis on põhjustatud sünoviaalliigeste liigesekõhre progresseeruvast degeneratsioonist [1].

Oodatava eluea pikenemise tõttu on liigesekõhre progresseeruvast degeneratsioonist sünoviaalliigeste liigesekõhre progresseeruvast degeneratsioonist põhjustatud OA levimus hinnanguliselt vastavalt 18 protsenti ja 9,6 protsenti meestel [2]. ]. Kuigi OA levimus maailmas suureneb igal aastal, on OA patofüsioloogiline etioloogia endiselt teadmata. Selle põhjuseks võivad olla väga keerulised ja mitmefaktorilised riskitegurid, nagu vananemine, sugu, geneetiline pärand, traumaatiline liigesevigastus ja tugev mehaaniline liigeste koormus. Lisaks ei ole teada neuropatoloogilised seosed liigesekõhre progresseeruva degeneratsiooni ja kroonilise liigesevalu tekke vahel [3]. Seega on OA-ga patsientide kliinilise ravi eesmärk säilitada keha liikuvus ja liigese mehaaniline funktsioon kroonilise liigesevalu leevendamise kaudu, kasutades farmakoloogilisi ja mittefarmakoloogilisi lähenemisviise ning liigeseasendusoperatsioone. Nõudlus pikaajalise bioloogilise ohutusega tõhusa sekkumise või täienduse väljatöötamise järele, et ennetada või leevendada OA-d, et säilitada elukvaliteeti eakate liigese mehaanilise funktsiooni säilitamise kaudu, kasvab.

Nagu on näidatud joonisel 1,akteosiid(CAS nr 61276-17-3; C29H36O15) on kofeoüülfenüületanoidglükosiid, mis on eraldatud mitmest taimsest taimest, nagu Verbascum chlorides [4], Buddleja globosa [5] ja Plantago australis [6]. Akteoidil on mitmesugused bioloogilised toimed, nagu antimikroobne [5], põletikuvastane [7], vähivastane [8], antioksüdatiivne [9], tsütoprotektiivne [9] ja neuroprotektiivne toime [10]. Lisaks suukaudne manustamineakteosiidsuurtes annustes ei põhjusta genotoksilisust[11].

Seetõttu oletasime, et põletikuvastase bioloogilise ohutusega akteosiidil on antikataboolne toime, mis on seotud liigesekõhre kaitsmisega liigesekõhre progresseeruva degeneratsiooni eest, pärssides kataboolseid tegureid, nagu põletikku tekitavad tsütokiinid, liigesepõletiku põletikulised ensüümid ja liigesekõhrepõletikud. . Seetõttu oli selle uuringu eesmärk uuridaakteosiid-indutseeritud antikataboolsed toimed ja selle rakuline signaalirada nii in vitro, kasutades primaarseid kondrotsüüte, mis on eraldatud roti põlveliigese liigesekõhrest, kui ka in vivo, kasutades OA loommudelit, mis on loodud hiirte põlveliigese mediaalse meniski kirurgilise destabiliseerimise teel.

akteosiidsissecistanchesaabparandadapuutumatus

2. Meetodid

2.1. Rakukultuur.

Primaarsed roti kondrotsüüdid eraldati roti (5-päevane; Sprague-Dawley) põlveliigeste liigesekõhrest vastavalt protokollile (CIA-CUC2019-A0027), mille on heaks kiitnud institutsioon. Chosuni ülikooli loomade hooldamise ja kasutamise komitee, Gwangju, Korea Vabariik. Eraldatud primaarseid roti kondrotsüüte hoiti Dulbecco modifitseeritud Eagle'i söötme/toitainete segus F{6}} (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), millele oli lisatud 10 protsenti veiseloote seerumit (Life Technologies) , Grand Island, NY, USA), antibiootikumid (50 U/mL penitsilliini ja 50 ug/ml streptomütsiini) ja 50 ug/ml askorbiinhapet. Tavaline hiire fibroblasti L-929 rakuliin osteti ettevõttest American Type Culture Collection (ATCC). Vastavalt ATCC juhistele kultiveeriti L-929 rakke Eagle'i minimaalses olulises söötmes, mis sisaldas 10% FBS-i, ja kasvatati niisutatud inkubaatoris 37 kraadi juures 5% CO2-ga.

2.2. Rakkude elujõulisuse test.

Dimetüültiasolüüldifenüültetrasooliumsoola (MTT) test viidi läbi, et hinnata normaalse rakuna kasutatud hiire fibroblasti rakuliini L929 rakkude ja akteosiidiga töödeldud primaarsete roti kondrotsüütide elujõulisust. Lühidalt, L929 rakke ja primaarseid roti kondrotsüüte kultiveeriti rakutihedusega 8 × 105 rakku/ml 24 tundi kultiveerimisplaatidel ja seejärel töödeldi 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM.akteosiid24 tunniks. Pärast MTT lahusega töötlemist kultiveeriti nii L929 rakke kui ka kondrotsüüte veel 4 tundi. Pärast inkubeerimist suspendeeriti moodustunud MTT kristallid täielikult dimetüülsulfoksiidis ja mõõdeti neeldumist 570 nm juures, kasutades rakkude elujõulisuse hindamiseks spektromeetrit (Epoch mikroplaadi spektrofotomeeter, BioTek®, Winooski, VT, USA).

2.3. Elus/surnud rakkude analüüs.

Rakkude ellujäämiseks kasutati Cell Live/Dead analüüsikomplekti (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA), mis koosneb rohelisest kaltseiin-AM-ist elusrakkude märgistamiseks (rohelise fluorestsentsiga) ja etiidiumi homodimeerist{1}} surnute märgistamiseks. rakud (punase fluorestsentsiga). Lühidalt öeldes kultiveeriti nii L929 rakke kui ka primaarseid roti kondrotsüüte 24 tundi rakutihedusega 8 × 105 rakku/ml (Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™ süsteem; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) ja seejärel töödeldi 50 ja 100 µM akteosiidi 24 tundi. Pärast kultiveerimist viidi läbi rakkude ellujäämise test vastavalt tootja juhistele. Seejärel pildistati värvitud rakke fluorestsentsmikroskoobiga (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).

2.4. Dimetüülmetüleensinise (DMMB) test.

DMMB test viidi läbi, et hinnata proteoglükaani sisalduse muutumist primaarsetes roti kondrotsüütides, mida raviti akteosiidiga 21 päeva IL-1 juuresolekul või puudumisel. Primaarsete roti kondrotsüütide omaduste säilitamiseks 21 päeva jooksul suspendeeriti primaarsed roti kondrotsüüdid (2 × 106 rakku) 1 ml 1,2% alginaadis ja seejärel kapseldati raku/alginaadi suspensiooni tilgutamisega 105 mM CaCl2 lahusesse. Alginaadis kapseldatud primaarseid roti kondrotsüüte kultiveeriti 24 tundi DMEM/F12-s (sisaldas 10 protsenti FBS-i, 50 U/mL penitsilliini, 50 ug/ml streptomütsiini ja 50 ug/ml askorbiinhapet) ja seejärel kohandati 24 tundi DMEM/F12-s. miniinsuliin-transferriin-seleen (mini-ITS) ja 50 ug/ml askorbiinhapet. Seejärel töödeldi kondrotsüüte 50 või 100 μM-gaakteosiid1 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 21 päeva jooksul. 21. päeval koguti primaarsed roti kondrotsüüdid proteoglükaani sisalduse hindamiseks, kasutades DMMB testi, nagu eelnevalt kirjeldatud [12]. Lisaks mõõdeti proteoglükaani sisalduse kvantifitseerimiseks raku kohta ja primaarsete roti kondrotsüütide proliferatsiooni hindamiseks rakkude arvu DNA testiga, kasutades PicoGreeni (Molecular Probes, Carlsbad, CA), vastavalt tootja juhistele. 10 ng/ml IL-1 olemasolu või puudumine 7 päeva jooksul. Kultiveerimisperioodi lõpus koguti proovid ja fikseeriti histoloogiliseks analüüsiks 4% paraformaldehüüdis 72 tundi.

2.6. Histoloogiline analüüs.

Viidi läbi histoloogiline analüüs, kasutades safraniin-O ja kiiret rohelist värvimist, et kontrollida proteoglükaani kadu liigesekõhres, mida töödeldi 100 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 7 päeva jooksul. Lühidalt, fikseeritud liigesekõhre proovid dekaltsifitseeriti etüleendiamiintetraäädikhappes ja sisestati seejärel parafiini. Seejärel lõigati liigesekõhre sisaldavad ettevalmistatud parafiiniplokid järjestikku 5 μm paksusteks viiludeks ja asetati objektiklaasidele. Seejärel viidi läbi safraniin-O ja kiire roheline värvimine, et hinnata proteoglükaani kadu liigesekõhre pinnases. Lisaks viidi läbi hematoksüliini ja eosiini värvimine, et jälgida liigesekõhre üldist morfoloogiat.

2.7. Western Blotting.

Kataboolsete tegurite, sealhulgas MMP-13, MMP-1, MMP-3, indutseeritava lämmastikoksiidi süntaasi (iNOS) ja tsüklooksügenaasi-2 (COX) ekspressiooni uurimiseks viidi läbi Western blot meetod. -2) ja raku signaalmolekulide, nagu mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasid ja tuumafaktor-kappa B (NFkB) muutumine. Lühidalt, roti primaarseid kondrotsüüte töödeldi 50 või 100 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Seejärel koguti roti primaarsed kondrotsüüdid tsentrifuugimisega ja lüüsiti lüüsipuhvriga (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) vastavalt tootja juhistele. Lisaks töödeldi NFkB tuuma translokatsiooni kontrollimiseks roti primaarseid kondrotsüüte 50 või 100 μM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Seejärel ekstraheeriti tsütosool- ja tuumafraktsioonid, kasutades NE-PER™ tuuma- ja tsütoplasma ekstraktsioonireagente (Thermo Scific, Rockford, IL, USA) vastavalt tootja juhistele. Roti primaarsetest kondrotsüütidest ekstraheeritud koguvalgu kontsentratsioon määrati bitsinhoniinhappe valgu analüüsi komplekti (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) abil vastavalt tootja juhistele. Lisaks koguti konditsioneeritud sööde, et tuvastada kondrotsüütidest sekreteeritud kõhre lagundavate ensüümide taset. Võrdsed kogused valku ja konditsioneeritud söödet elektroforeesiti naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforeesil (SDS-PAGE) ja kanti seejärel nitrotselluloosmembraanidele. Seejärel viidi läbi Western blot, kasutades suunatud primaarseid antikehi MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, fosfo-ERK1/2, summaarse vastu -ERK1/2, fosfo-p38, totaalne-p38, fosfo-JNK, kogu JNK, fosfo-NFkB, kogu NFkB, - aktiin ja lamin B. Immunoreaktiivsed ribad visualiseeriti täiustatud kemoluminestsentssüsteemi abil (Thermo Sci- entific, Rockford). , IL, USA) vastavalt tootja juhistele ja seejärel pildistatud Microchemi seadmega (DNR Bioimaging Systems, Jeruusalemm, Iisrael).

2.8. Kvantitatiivne polümeraasi ahelreaktsioon (qPCR) ja kvantitatiivne reaalajas PCR (qRT-PCR).

Primaarseid roti kondrotsüüte töödeldi 50 või 100 μM-gaakteosiid10 ng/mL IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tunni jooksul. Seejärel eraldati kogu RNA primaarsetest roti kondrotsüütidest, kasutades TRIzol reagenti (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. RNA kogukontsentratsiooni mõõdeti seadmega NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). cDNA sünteesimiseks pöördtranskribeeriti 1 ug RNA-d, kasutades ThermoScripti pöördtranskriptsiooni-PCR süsteemi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) vastavalt tootja juhistele. cDNA qPCR viidi läbi, kasutades 2x TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seoul, Korea Vabariik) ja spetsiifilisi praimereid TaKaRa PCR Thermal Cycler Device'il (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Jaapan). Seejärel elektroforeesiti PCR-produkte agaroosgeelil, et määrata sihtgeenide ekspressioonitasemed. Endogeense kontrollina kasutati glütseraldehüüdi 3-fosfaatdehüdrogenaasi (GAPDH). Lisaks amplifitseeriti qRT-PCR jaoks cDNA-d, kasutades Eco™ Real-Time PCR süsteemi (illumine Inc., San Diego, CA, USA). - Endogeense kontrollina kasutati aktiini. qPCR-is ja qRT-PCR-is kasutatud praimerite järjestused on kokku võetud vastavalt tabelites 1 ja 2.

2.9. Želatiini sümograafia.

MMP-de aktiveerimise hindamiseks primaarsetes roti kondrotsüütides viidi läbi želatiini sümograafia. Lühidalt, primaarseid roti kondrotsüüte töödeldi 50 või 100µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Seejärel elektroforeesiti võrdne kogus konditsioneeritud söödet 10% polüakrüülamiidgeelil, mis oli kopolümeriseeritud 0,2% (1 mg/ml) sea naha želatiiniga. Pärast elektroforeesi inkubeeriti geeli sümogrammi renatureerivas puhvris (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM CaCl2, 50 mM NaCl ja 0,05 protsenti Brij{18}}) 37 kraadi juures 72 tundi. Pärast MMP-de renatureerimist värviti geel 0,1% Coomassie Brilliant Blue R250-ga. Želatinolüütilised ribad ilmnesid selgete ribadena ühtlaselt helesiniseks värvitud taustal ja seejärel pildistati digikaameraga.

2.10. Lämmastikoksiidi (NO) mõõtmine.

Primaarseid roti kondrotsüüte töödeldi 50 või 100 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Seejärel pandi 50 µl konditsioneeritud söödet reageerima 50 µl sulfaniilamiidi ja N-1- naftüületüleendiamiindivesinikkloriidiga. Seejärel mõõdeti neeldumist lainepikkusel 540 nm, kasutades spektrofotomeetrit (Epoch Spectrophotometer, BioTek, Winooski, VT, USA).

2.11. Prostaglandiin E2 (PGE2) test.

Primaarseid roti kondrotsüüte töödeldi 50 või 100 μM-gaakteosiid10 ng/mL IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tunni jooksul. Seejärel mõõdeti PGE2 kontsentratsiooni, kasutades PGE2 parameetritesti komplekti (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) vastavalt tootja juhistele.

2.12. Tsütokiinide massiiv.

Primaarseid roti kondrotsüüte töödeldi 50 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Seejärel ekstraheeriti valkude üldkogus ja kvantifitseeriti, nagu eelnevalt kirjeldatud [13]. Järgmisena viidi läbi tsütokiinide massiiv, et uurida tsütokiinide tootmise muutusi vastavalt tootja juhistele (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, USA).

2.13. Tuuma translokatsiooni test.

Primaarseid roti kondrotsüüte töödeldi 50 ja 100 ug/mlakteosiid10ng/mL IL-1 juuresolekul. 30 minuti pärast fikseeriti primaarsed roti kondrotsüüdid 1-protsendilise paraformaldehüüdiga, permeabiliseeriti 0,2-protsendilises Triton X{6}}-s ja pesti põhjalikult fosfaatpuhverdatud soolalahusega. Mittespetsiifilised signaalid blokeeriti tavalise kitseseerumi abil. Pärast mitmekordset pesemist inkubeeriti kondrotsüüte küüliku NFKB-vastaste antikehadega, millele järgnes inkubeerimine FITC-konjugeeritud kitse küülikuvastase IgG-ga (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) üleöö temperatuuril 4 °C. Seejärel pildistati värvitud rakud Korea põhiteaduste instituudi (Gwangju, Korea Vabariik) Gwangju filiaalis laserkonfokaalse skaneeriva mikroskoobi süsteemiga (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksamaa).

2.14. Osteoartriitiliste loomade põlvkond.

Osteoartriitiliste loomade tekitamiseks destabiliseeriti BALB/c hiirte (keskmine kehakaal 19:3±0:5g) põlveliigeste mediaalne menisk (DMM) vastavalt IACUC juhistele (CIACUC{{4}). }A0029). OA-indutseeritud loomi raviti suukaudselt 5% ja 10 mg/kg akteosiidiga, mis lahustati 5% etanoolis (katserühm; n =5) või vehiikulis (5% etanoolis) (DMM rühm; n =5) iga kord. teisel päeval 8 nädalat. Kultiveerimisperioodi lõpus lõigati põlveliigesed lahti ja fikseeriti histoloogiliste hinnangute tegemiseks 5% paraformaldehüüdiga 7 päeva jooksul. Pärast safraniin-O ja kiiret rohelist värvimist uuriti liigesekõhre kujutisega kudesid vastavalt Mankini klassile [14, 15].

2.15. Statistiline analüüs.

Katseandmed on esitatud kui keskmine ± standardhälve ja neid võrreldi dispersioonanalüüsi abil, millele järgnes mitmekordne post hoc võrdlus (Tukey test), kasutades SPSS tarkvara versiooni 25 (IBM Corp.). Kõik andmed, välja arvatud loomkatsed, saadi kolmest sõltumatust katsest.

akteosiidsissecistanche

3. Tulemused

3.1. Akteosiid ei mõjuta L929 rakkude ja roti primaarsete kondrotsüütide elujõulisust.

Normaalsete rakkudena kasutatud hiire fibroblasti rakuliini L929 töödeldi 24 tundi 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM akteosiidiga. Seejärel viidi läbi MTT test, et hinnata akteosiidi tsütotoksilisust L929 rakkudel. Nagu on näidatud joonisel 2(a), määrati L929 rakkude suhteline elujõulisus 94:8±8 protsenti, 93:6±7 protsenti, 100±5 protsenti, 103:9±5 protsenti, 126:1±8 protsenti. , ja 122:7±4 protsenti vastavalt 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM akteosiidiga võrreldes kontrollrühmaga (100:02 ± 3 protsenti). Lisaks viidi akteosiidi tsütotoksilisuse kontrollimiseks primaarsetele roti kondrotsüütidele läbi MTT test, nagu on näidatud joonisel 2(b). 2,5, 5, 10, 25, 50 ja 100 µM akteosiidiga töödeldud primaarsete roti kondrotsüütide elujõulisuseks määrati 114 ± 4 protsenti, 117:8 ± 6 protsenti, 123:9 ± 5 protsenti, 132:6 ± 4 protsenti, 153:1±7 protsenti ja 142:1±6 protsenti võrreldes kontrolliga (100:4±5 protsenti). Veelgi enam, et kinnitada akteosiidi mõju nii L929 rakkude kui ka primaarsete roti kondrotsüütide elujõulisusele, viidi läbi Cell Live/Dead test, nagu on näidatud joonisel 2(c). Punase fluorestsentsina värvunud surnud rakkude arv ei suurenenud nii L929 rakkude kui ka primaarsete roti kondrotsüütide puhul, mida töödeldi 50 ja 100 µM akteosiidiga 24 tundi. Need andmed näitasid järjekindlalt, et kindlaksmääratud annusakteosiidei mõjutanud L929 rakkude ja primaarsete roti kondrotsüütide elujõulisust. Seega kasutati 50 µM akteosiidi ja 100 µM akteosiidi, mis on mittetoksilised annused nii L929 rakkudes kui ka primaarsetes roti kondrotsüütides, et kontrollida selle antikataboolset toimet in vitro uuringutes, kus kasutati primaarseid roti kondrotsüüte.

3.2. Akteosiid neutraliseerib IL-1 -indutseeritud proteoglükaani kadu roti primaarsetes kondrotsüütides.

Alginaadi helmestesse põimitud primaarseid roti kondrotsüüte töödeldi 50 ja 100 µM akteosiidiga 1 ng/ml IL- 1 juuresolekul või puudumisel 21 päeva. Seejärel viidi läbi DMMB test, et hinnata proteoglükaanisisalduse muutusi, nagu on näidatud joonisel 3(a). Suhteline proteoglükaanisisaldus määrati 88:3±18:1 protsenti ja 86:8±16:3 protsenti primaarsetes roti kondrotsüütides, keda raviti vastavalt 50 ja 100 µM akteosiidiga, võrreldes kontrollrühmaga (103:8±16:3). 32:3 protsenti). Kuigi akteosiid vähendas suhtelist proteoglükaanisisaldust, ei olnud need tulemused märkimisväärsed. Siiski vähenes suhteline proteoglükaanisisaldus märkimisväärselt 37:1±14:7 protsenti primaarsetes roti kondrotsüütides, mida raviti 1 ng/mL IL-1-ga, kuid 50 ja 100 µM akteosiidiga vähenes proteoglükaanisisaldus märkimisväärselt 57:12:4 ± 12:4. protsenti ja vastavalt 64 ± 14:5 protsenti 1 ng/mL IL-1 juuresolekul. Seejärel, et kontrollida, kas akteosiid pärsib IL-1 --indutseeritud proteoglükaanide kadu, töödeldi roti põlveliigestest eraldatud liigesekõhre 100 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 7 päeva jooksul. Seejärel viidi läbi histoloogilised hinnangud, kasutades H&E värvimist ja safraniin-O ja kiiret rohelist värvimist, nagu on näidatud joonisel 3 (b). Morfoloogilist muutust ei täheldatud H&E värvimisega; kuid safraniin-O ja kiire roheline värvimine näitasid, et punase värvina värvitud proteoglükaan ei muutunud 100 μM akteosiidiga töödeldud liigesekõhredes võrreldes kontrollrühmaga. Siiski kutsus esile tõsise proteoglükaani kadu 10 ng/mLIL-1 liigesekõhres ja 100 µM akteosiid pärssis märkimisväärselt proteoglükaani kadu 10 ng/ml IL- 1-ga töödeldud liigesekõhres. Need andmed näitavad järjekindlalt, et akteosiidil on antikataboolne toime, mis pidurdab liigesekõhre degeneratsiooni, takistades IL{50}}indutseeritud proteoglükaanide kadu.

akteosiidsissecistancheavaldavad head mõjuantioksüdant

3.3. Akteosiidil on antikataboolne toime, mis pärsib MMP ekspressiooni ja aktivatsiooni IL-1-ga töödeldud primaarsetes roti kondrotsüütides.

Et uurida, kas akteosiidist põhjustatud antikataboolne toime on seotud MMP ekspressiooni ja aktivatsiooni pärssimisega, töödeldi primaarseid roti kondrotsüüte 50 ja 100 µM akteosiidiga 10 ng/ml IL-1 juuresolekul või puudumisel 24 tundi. Seejärel uuriti MMP-de muutusi. Nagu on näidatud joonisel 4(a), suurenes kõhre lagundavate ensüümide, nagu MMP-13, MMP-1 ja MMP-3 ekspressioon märkimisväärselt primaarse roti konditsioneeritud söötmes. 10 ng/mL IL-1 töödeldud kondrotsüütide puhul vähenes seeakteosiidannusest sõltuval viisil. Lisaks näitasid nii qPCR (joonis 4(b)) kui ka qRT-PCR (joonis 4(c)) tulemused, et IL-1 suurendas märkimisväärselt MMP-de, nagu MMP-13, MMP{ mRNA taset. {6}} ja MMP-3 roti primaarsetes kondrotsüütides. Kuid need vähenesid annusest sõltuvalt primaarsetes roti kondrotsüütides, mida raviti 50 ja 100 μM akteosiidiga. Lisaks pärsisid 50 ja 100 µM akteosiid tõhusalt MMP-de aktivatsiooni roti primaarsetes kondrotsüütides, mida raviti 10 ng/mL IL-1-ga (joonis 4(d)). Kokkuvõttes näitavad need andmed järjekindlalt, et akteosiidil on antikataboolne toime, mis pärsib kõhre lagundavate ensüümide ekspressiooni ja aktivatsiooni.