Oksüdatiivne stress, düsfunktsionaalne energiametabolism ja destabiliseerivad neurotransmitterid muutsid aju metaboolset profiili simuleeritud Heliox-küllastussukeldumise rotimudelis 4.0 MPa Ⅱ

Kudede ekstraheerimise protseduur

Nagu teatatud, oli polaarsete metaboliitide koeproovidest ekstraheerimise protseduur väike modifikatsioon [18]. Eelkaalutud külmutatud koeproovid sulatati jääl ja seejärel homogeniseeriti mehaaniliselt jääkülmas HPLC-puhastusega metanool-kloroform-vesi lahustisüsteemis (400 μL, 400 μL ja 285 μL vastavalt 100 mg ajukoe kohta), kasutades koe homogenisaatorit (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, Prantsusmaa). Saadud homogenaate hoiti jääl 30 minutit ja seejärel tsentrifuugiti 12,{12}} xg juures 10 minutit temperatuuril 4 °C. Seejärel eemaldati iga proovi supernatant ja lüofiliseeriti, et saada külmkuivatis polaarseid metaboliite sisaldav pulber (FD-1A-80, BIOCOOL, Hiina). Seejärel taastati iga pulbriproov 550 µl PBS puhvriga, mis sisaldas 0,1 protsenti TSP-d, ning seejärel segati kõik proovid põhjalikult rotatsiooniga ja tsentrifuugiti 12,{22}} xg juures 20 minutit temperatuuril 4 °C. Seejärel kanti 500 µl suurune alikvoot supernatanti 5,0 mm läbimõõduga NMR-torusse (Norrel, UK). Valgu ekstraheerimise põhimõte ajukoore proovis oli selline, nagu eelnevalt kirjeldatud, ilma muudatusteta. Täpne kogus ajukoore proove valati homogeniseerimispuhvrisse (HEPES 25 mmol/L, pH 7,4, MgC12 5 mmo1/L, DTT 2 mmol/L, EDTA 1,3 mmol/L, EGTA 1 mmol/L, 0,1 protsenti Triton X-100, aprotiniini, pepstatiin A ja leupeptiini 10 ug/ml) ja homogeniseeriti käsitsi jäävannis. Segu tsentrifuugiti kiirusel 1,{43}} xg 10 minutit temperatuuril 4 °C ja supernatanti kasutati valgu kontsentratsioonide kvantifitseerimiseks, kasutades Bradfordi testi.

Cistanche oksüdatsioonivastase funktsiooni tundmaõppimiseks klõpsake siin

Biokeemiline analüüs

Tundlikku, konkureerivat ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) kasutati koos testikomplektidega metaboolsete ensüümide Na-KATPaasi ja AChE ning neurotransmitterite DA, E, NE, 5HT ja GABA kvantifitseerimiseks. ELISA määras ka SOD, MDA ja GPx tasemed kortikaalses koes testikomplektidega vastavalt tootja juhistele.

NMR mõõtmine

Kudede metaboliitide tõhus kvantifitseerimine saavutati analüütilise platvormi abil, mis põhines vedelal kõrge eraldusvõimega Bruker Avance-III NMR-spektromeetril, mis oli varustatud kõrge tundlikkusega krüogeense sondiga, mis töötab sagedusega 600. 17 MHz 1 H vaatlemiseks temperatuuril 298 K. Veesuhkruga ühemõõtmelist 1 H ZGPR (TOPSPIN versioon 3.0, Bruker Biospin) impulssjärjestust (RD-90˚-ACQ) rakendati hankida iga proovi NMR andmed. Neli näivat skaneerimist ja 128 transienti registreeriti 32 K andmepunkti ajapiirkonnas, kasutades spektraalset laiust 20 ppm koos relaksatsiooniviivitusega 10, 0 s ja kogumisajaga 2, 73 s. Kõigile vabade induktsioonide lagunemistele (FID) rakendati enne Fourier' teisendust eksponentsiaalne joone laiendamise funktsioon 0, 3 Hz ja nulltäitmine 64 K andmepunktideni. Keemilise nihke määramise kinnitamiseks kasutati täiendavaid kahemõõtmelisi NMR-meetodeid koos impulssvälja gradiendi korrelatsioonispektroskoopiaga (gCOSY) ja 2D homonukleaarset kogukorrelatsioonispektroskoopiat (TOCSY), kasutades valitud proovidel standardseid impulssprogramme. Kõigi spektrite kogumisel kasutati proovide pidevaks edastamiseks automatiseeritud proovivahetajat.

Metaboliidi tuvastamine ja kinnitamine

NMR-signaalid, mis põhinevad üksikute resonantside asukohal spektris, tuvastati tarkvarapaketis Chenomx NMR Suite v. 8.4 (hindamisversioon). Mõnede metaboliitide määramise kinnitused viidi läbi, võttes arvesse metaboliitide keemilisi nihkeid, sidestuskonstante ja paljususe mustreid kui teavet skalaarsete sidemete kohta, mis on ekstraheeritud 1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, avalikest NMR andmebaasidest, nagu COLMAR ja Human Metabolome. Andmebaas (HMDB) ja kirjandus [18, 19].

Mitmemõõtmeline statistiline analüüs

Iga 1D1H NMR spektri eeltöötlemiseks kasutatud eeltöötlusprotokoll oli sama, mida kirjeldati meie eelmises töös [20]. 1H NMR spektrid faasiti ja algjoont korrigeeriti, kasutades MestReNova (Mestrelab Research, SL, Hispaania) ning iga metaboliidi spektripiirkond integreeriti ühte ämbrisse. Orgaanilise lahusti signaali resonants ja H2O/HOD jääksignaali piirkond eemaldati kõigis 1D1H NMR spektrites. Kõigis spektrites rakendati 0.{{30}}03 Hz ämberprotseduuri ja normaliseerimist spektri intensiivsuse summaks, mis on korrutatud 10 000-ga. Järgmise etapi analüüsi jaoks valiti ainult suurimad väärtused ühes piigis, et vältida diskrimineerivate metaboliitide valesti tõlgendamist signaalide kattumise tõttu. Seejärel ekstraheeriti 47 metaboliidi terviklikud ämbrid ja analüüsiti ühe- ja mitmemõõtmelist andmeanalüüsi. Diskrimineerimise analüüs põhikomponentanalüüsi (PCA) ja diskrimineerimisanalüüsi osalise vähimruutude diskrimineerimisanalüüsi (PLS-DA) ja varjatud struktuuride ortogonaalsete projektsioonide diskriminantanalüüsi (OPLS-DA) abil viidi läbi SIMCA-P pluss 14.0 tarkvarapaketi (Umetrics) abil. , Umeå, Rootsi) skaleeritud ühiku dispersiooniandmetele. PCA ja PLS-DA skoorigraafikuid illustreeriti esimese ja teise põhikomponendiga (t[1], t[2]), samas kui OPLS-DA skoori graafikul kasutati t[1] ja ortogonaalset komponenti (to[1] ]). Parameetrid Q2 (cum), R2Y (cum) ja R2X (cum) arvutati, et testida diskrimineerimismudelite vastupidavust ülepaigutamise vastu [21]. Nagu eelnevalt kirjeldatud, peetakse usaldusväärseks mudeliks kvaliteedihinnangu väärtust Q2 � 0,4. Seitsmekordset ristvalideerimise strateegiat ja permutatsioonitesti 200 korda koos esimese komponendiga rakendati, et kaitsta mudelite ülepaigutamise eest ja kinnitada veelgi mudelite töökindlust ja usaldusväärsust. Kui Q2 regressioonijoonel oli negatiivne lõikepunkt ja kõige vasakpoolsemasse punkti paigutatud Q2 väärtused olid suuremad kui kõik paremate punktide Q2 väärtused permuteeritud testis, oli loodud OPLS-DA mudel robustne [22]. Mudeli ülepaigutamise eest kaitsmiseks rakendati vaikimisi 10-foldi ristvalideerimise strateegiat. Üldiselt peetakse kvaliteedi hindamise statistikat (Q2) � 0,4 usaldusväärseks mudeliks, nagu eelnevalt kirjeldatud. OPLS-DA mudelitest eraldatud korrelatsioonikoefitsiente (r) ja VIP väärtusi kasutati metaboliitide tuvastamiseks, mis aitasid oluliselt kaasa kahe rühma eraldamisele. Lisaks arvutati funktsiooni abil metaboliitide muutused rühmade vahel. IA/IB, kus IA ja IB tähistavad vastavalt A- ja B-rühma metaboliidi integraali keskmisi väärtusi. Soojuskaart ja kastitabelid koostati, et hõlbustada metaboliitide erinevuste mõistmist rühmade vahel.

Metaboliitide integraalide ühemõõtmeline statistika

Iga rühma metaboliitide keskmist väljendatakse keskmisena ± standardhälbe (SD). Ühemõõtmeline analüüs viidi läbi ka ANOVA-ga (dispersioonanalüüs). Statistiliselt olulisi erinevusi rühmade vahel hinnati kahe saba paaritu t-testiga pärast logi teisendamist GraphPad Prism V 8.4.3 tarkvaras (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA). Statistiliselt olulised erinevused määrati p väärtustega (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Süsteemi statistiline metaboolne korrelatsioonianalüüs ja hierarhiline klastrianalüüs

Pearsoni korrelatsioonikoefitsiendi arvutamine ja hierarhiline klastrianalüüs viidi läbi metaboliitide suhteliste integraalide põhjal R Studio (versioon 1.4.1717) väikeste skriptidega. Iga rühmapaari puhul illustreeriti korrelatsioonimaatriksit pikslikaardil, nagu on kirjeldatud kirjanduses [21]. Lühidalt, ühe rühma iga muutuja puhul peeti korrelatsioone p väärtustega, mis olid väiksemad kui 0.05, oluliseks statistiliseks korrelatsiooniks ja neid säilitati lõpliku korrelatsioonivõrgustiku loomiseks, et illustreerida metaboliitide varjatud seoseid rühmadevahelisi metaboolseid suhteid. Punasemad ruudud näitavad olulisemat positiivset korrelatsiooni. Sinisemad ruudud näitavad olulisemat positiivset korrelatsiooni. Valged ruudud näitavad korrelatsiooni, millel pole tähtsust. HSD-le vastajatena välja kutsutud kõige olulisemate aju metaboolsete radade ja võrgustike analüüs viidi läbi tööriista MetaboAnalyst 3.0 abil. Tehtud raja topoloogia analüüsi jaoks valiti Rattus norvegicus (rott) imetajate raja raamatukogu. Seda lähenemisviisi kasutati ka raja mõju, vale avastamise määra (FDR) ja p väärtuste hinnangute andmiseks.

Tulemused Kortikaalsed biokeemilised indeksid HSD ja CON rühmadest

HSD metaboolsete muutuste mõju ajukudedele, biokeemilistele parameetritele, sealhulgas Na-KATP, AChE ja LDH, DA, E, NE, 5HT ja GABA neurotransmitterite, ning energia metabolismiga seotud metaboolse ensümaatilise aktiivsuse valideerimiseks. aoksüdatiivse stressiga seotud valgudkohtaSOD, MDA, ja Gpx määrati ka HSD ja CON rottide ipsilateraalsetes ajukoore kudedes (tabel 1). Võrreldes kontrollrühmaga suurenesid DA, E, NE ja MDA tasemed märkimisväärselt, samas kui Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD ja Gpx sisaldus HSD mudelis vähenes. Käesolevas töös kasutatud testikomplektide tuvastamise piir oli loetletud lisamaterjalide faili S3 tabelis.

Tabel 1. Biokeemiliste parameetrite kvantifitseerimine mõõdeti ajukoorekoe CON ja HSD loomadel ELISA meetodil testikomplektidega. (keskmine ± SD). näitab statistilist olulisust.

Ajukoe proovide 1H NMR spektrites tuvastatud metaboliidid

Joonisel 3 on kujutatud kolm tüüpilist 1H NMR spektrit HSD roti ajukoorest (joonis 3A), hipokampusest (joonis 3B) ja juttkehast (joonis 3C). Ajukoeproovide 1H NMR andmete põhjal tuvastati suur hulk silmapaistvaid metaboliite ja need on orgaanilised happeanioonid (laktaat (Lac), malonaat (Maln), suktsinaat (Suc), malaat (Mal), fumaraat (FMA). ), 2-hüdroksübutüraat (2-HB), atsetaat (Ace), formiaat (For), tauriin (Tau), askorbaat (Asc), 2-hüdroksübutüraat (2HIB)), aminohapped (leutsiin (Leu), isoleutsiin (Ile), valiin (Val), alaniin (Ala), glütsiin (Gly), türosiin (Tyr), fenüülalaniin (Phe), aspartaat (Asp), glutamiin (Gln), glutamaat (Glu) , treoniin (Thr), seriin (Ser), lüsiin (Lys), asparagiin (Asn)), neurotransmitterid (-aminobutüraat (GABA)), energiaga seotud metaboliidid (kreatiin (Cre), adenosiintrifosfaat (ATP), adenosiinmonofosfaat ( AMP)), fosfolipiididega seotud metaboliidid (ofosfoetanoolamiin (PEA), O-fosfokoliin (Pcho), sn-glütsero-3-fosfokoliin (GPC)) ja teised (müoinositool (MI), nikotiinamiidadeniindinukleotiid (NAD pluss) ), nikotiinhape (Nic), N-atsetüülaspartaat (NAA), nikotiinamiid-adeniin-dinukleotiidfosfaat (NADP pluss), UDP-N-galaktoos (UDPGa), uridiin (Uri), uratsiil (Ura), tsüstidiin (Cyt) , uridiin-5'-monofosfaat (UMP), inosiin-5'-monofosfaat (IMP), inosiin (Ino), koliin (Cho), autonitiin (Car), glutatioon (GSH). S1 tabelis on üksikasjalik teave metaboliitide määramise kohta.

Metaboolse analüüsi käigus ilmnenud metaboolse profiili muutused

PCA, kõigi ajuekstraktide 1H NMR spektrite uurimuslik ja erapooletu analüüsimeetod erinevates ajupiirkondades, tehti esmalt selleks, et paljastada peamised metaboolsed suundumused, mis on tingitud hüperbaarilisest kokkupuutest 400 msw. heliox küllastuskeskkond. PCA-st (S1A–S1C joonis) saadud integraalsete ämbriandmete PC1 ja PC2 hajuvusdiagramm näitas teatavat diskrimineerimist, mis kattusid kahe klassifikatsiooni vahel. PLS-DA (S1A'-S1C' joonis) ja OPLS-DA (joonis 4A-4C) mudelite juhendatud uuringud näitasid metaboolsete profiilide selget klassivahelist erinevust rühmade vahel. Joonisel 4 on kujutatud OPLS-DA mudeli skoordiagrammid ajukoore piirkonna (A), hipokampuse piirkonna (B) ja juttkeha piirkonna (C) jaoks, mis näitavad selget eristamist HSD rühmade ja kontrollide vahel. Suur seletatav varieeruvus ja ennustuse headus, mida peegeldavad R2X ja Q2 väärtused (S1A'–S1C', joonised 4A–4C) ja permutatsioonitesti graafikud (joonis 4'-4C'A), näitasid, et loodud järelevalvega mudelite vastupidavus. Klassi eristavate mustrite eest vastutavate oluliste metaboliitide hindamiseks koguti S-joone graafikutelt eraldatud korrelatsioonikoefitsient (r), muutuv tähtsus projektsioonis (VIP) ja p-väärtus mitteparameetrilistest ühemõõtmelistest testidest. Seetõttu valisime ühele kolmest kriteeriumist (r absoluutväärtus suurem kui 0,50, VIP väärtus suurem kui 1,0 koos p väärtusega alla 0,05) täites statistiliselt oluliste metaboliitide paneeli. (tabel 1), mis vastutab CON ja HSD rühmade eraldamise eest. Tabelis 1 näitavad kordumise väärtused, mis on suuremad kui 1, suurenenud taset HSD rühmas, samas kui kordumise väärtused alla 1 näitavad HSD rühma vähenenud taset. Diskrimineerivate metaboliitide keskmised SD väärtused on loetletud S2 tabelis. Kasutades metaboliitide hierarhilist klasteranalüüsi ja keskmist sidumismeetodit, võimaldab genereeritud soojuskaart (joonis 5A–5C) koos dendrogrammidega paremini visualiseerida kolme ajupiirkonna metaboolset muutust, mis on põhjustatud hüperbaarilisest kokkupuutest heeliumi hapnikuga küllastunud keskkonnas.

HSD rottide erinevates ajupiirkondades täheldatud metaboolsed häired

Eespool nimetatud mitmemõõtmeline analüüs ja ühemõõtmeline analüüs, kasutades metaboliitide ämbri kõrgust erinevates rühmades, andis suurepärase töötoru, et tuvastada diskrimineerivad metaboliidid, mis paljastavad HSD sündmustega seotud võimalikud neuroloogilised metaboolsed muutused. HSD ajukoorekoes leiti kõrgenenud AMP, FMA, Nic ja Phe ning Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura ja Uri vähenemine rühm võrreldes CON-rühmaga (joonis 5A, tabel 1). Samal ajal vähenesid hipokampuses Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr ja Ura ning HSD rühmas suurenes AMP, nagu ka ajukoores. Lisaks ekspresseeriti ülesreguleeritud Thr ja allareguleeritud Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc ja DMA HSD rühma hipokampuse ekstraktides võrreldes kontrollidega (joonised 5B, 5D, tabel 1). Võrreldes CONS-rühmaga vähenes ka Cyt, GABA, Ura, Cho ja Thr sisaldus, nagu ka ajukoores ja hipokampuses. Lisaks on suurenenud hargnenud ahelaga aminohapete (BCAA, sealhulgas Leu, Ile, Val) ja Lys tase ning vähenenud Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, ATP, Tau, IMP metaboliitide, ja Suc, mis samuti vähenes hipokampuses, ja veel kahte metaboliiti, Ino ja Pcho, mis samuti vähenesid ajukoores, täheldati HSD rühma rottide juttkeha kudedes (joonis 5C, 5D, tabel 1). Sellised paljud metaboliidid viitavad alati keerukuse ja mitmekesisusega seotud molekulaarsetele radadele. Kvantifitseeriti diskrimineerivate metaboliitide terviklikud väärtused ning nende kontsentratsioonide statistiliselt olulised muutused helioks-küllastuse-hüperbaarilise kokkupuute ja kontrollrühmade vahel on kokku võetud S2 tabelis ja tabelis 2 kolme ajupiirkonna kohta.

Joonis 4. Ortogonaalse osalise vähimruutude diskrimineerimisanalüüsi (OPLS-DA) skoordiagrammid ja permutatsioonitesti graafikud, mis eristavad 400 msw helioksküllastusega kokkupuute mõju 1H NMR spektritele ajukoore kontrollrühmadest (CONC, n=8, HSDC, n=8, A ja A') (R2X=0.38; Q2=0.46), hipokampus (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B ja B') (R2X=0.37; Q2=0.43) ja juttkeha (CONS, n=8, HSDS, n=8, C ja C') (R2X=0.39; Q2=0.40). Q2 parameetri väärtused OPLS-DA skoori graafikutel, mis olid võrdsed või suuremad kui 0,40, koos permuteeritud mudelite vasakpoolseima punkti Q2 väärtustega olid suuremad kui kõik paremate punktide sobitatud Q2 väärtused (permutatsioon). test 80 korda), mis näitab, et kehtestatud OPLS-DA mudelid olid kehtivad.

Pcho, mis vähenes ka ajukoores, täheldati HSD rühma rottide juttkeha kudedes (joonised 5C, 5D, tabel 1). Sellised paljud metaboliidid viitavad alati keerukuse ja mitmekesisusega seotud molekulaarsetele radadele. Kvantifitseeriti diskrimineerivate metaboliitide terviklikud väärtused ning nende kontsentratsioonide statistiliselt olulised muutused helioks-küllastuse-hüperbaarilise kokkupuute ja kontrollrühmade vahel on kokku võetud S2 tabelis ja tabelis 2 kolme ajupiirkonna kohta.

Joonis 5. Soojuskaart ja statistilised korrelatsioonigraafikud, mis on tuletatud ajukoorest (A, A', HSDC proovid asuvad ülemisel paneelil ja CONC asub alumisel paneelil), hipokampusest (B, B', HSDH) pärinevate diskrimineerivate metaboliitide väärtustest rühm asub ülemises paneelis ja CONH asub alumisel paneelil) ja juttkeha (C, C', HSDS proovid asuvad ülemises paneelis ja CONS asuvad alumises paneelis) HSD ja CON rottide kudedes. Soojuskaardil olevad metaboliidid on korraldatud hierarhilise klastrite alusel, mis põhinevad tasememustrite üldisel sarnasusel. Venni diagramm (D), mis illustreerib metaboliitide kattumist HSDC-CONC, HSDH-CONH ja HSDS-CONS võrdluste vahel.

Metaboliitide korrelatsioonianalüüs

Metaboliitide vaheline või vaheline seos oli joonisel 5A'-5C' nii keeruline. Energia metaboliitide puhul on positiivsed korrelatsioonid Lac vs Ala HSDC-s, AMP vs IMP HSDH-s, ATP vs Pcho HSDS-is, Suc vs GABA/Gln/Tyr/NAA HSDS-is ning negatiivsed korrelatsioonid Lac vs Thr ja GSH vs. Suc HSDH-s, Suc vs Val HSDS-is esinesid metaboliitide korrelatsioonigraafikutel. Neurotransmitterite puhul esinesid metaboliitide korrelatsioonigraafikutel positiivsed korrelatsioonid GABA vs auto vahel HSDC-s, GABA vs Cho osas CONH-is ja GABA vs Suc/Ino/Gln-s HSDS-is. GABA ja FMA negatiivsed korrelatsioonid CONC-is ja GABA vs NAA/Ura/NADP pluss CONS-is esinesid metaboliitide korrelatsioonigraafikutel. Metaboliitide puhul, mis on seotudoksüdatiivne stress,positiivsed korrelatsioonidGSH vs Asn HSDC-s ja CONC-s, Tau vs Lac HSDH-s, Tau vs Suc/Ala CONH-s, negatiivne korrelatsioon GSH vs Suc puhul HSDH-s, Tau vs Thr-i HSDH-s esines metaboliitide korrelatsioonis krundid.

Metaboloomiliste radade analüüs

Raja kvantitatiivne analüüs, mis koosneb raja rikastamise analüüsist ja raja mõjust raja topoloogiast, näitas väga statistiliselt olulisi HSD-indutseeritud modulatsioone metaboolsete radade seerias. Raja mõju skoorid koos valede avastamise määra (FDR) ja p väärtustega on kirjeldatud joonisel 6. Rada loeti oluliselt rikastatuks, kui p väärtused olid madalamad kui 0.05; profileeritud metaboliitide (tabamuste) arv kogu metaboliitide kogumahu suhtes (sobivuse staatus) oli suurem kui 1; ja mõjuskoorid (mis näitavad oluliselt mõjutatud metaboliitide mõju rajale, mis põhineb suhtelise vahelise tsentraalsuse võrgu topoloogia mõõtmisel) olid kõrgemad kui 0. Suurima metaboolse mõju väärtusega rajad ajukoores (joonis 6A) olidfenüülalaniin, türosiinjatrüptofaani biosüntees>fenüülalaniini metabolism> pürimidiini metabolism > alaniini, aspartaadi ja glutamaadi metabolism. Suurima metaboolse mõjuga rajad hipokampuses (joonis 6B) olid fenüülalaniini, türosiini ja trüptofaani biosüntees > glutatiooni metabolism > glütsiini, seriini ja treoniini metabolism > puriini metabolism > pürimidiini metabolism > alaniini, aspartaadi ja glutamaadi metabolism > butanoaat . Suurima metaboolse mõjuga rajad juttkehas (joonis 6C) olid alaniini, aspartaadi ja glutamaadi metabolism > nikotinaadi ja nikotiinamiidi metabolism > puriini metabolism.

Küsi lisa:

E-post:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: pluss 86 15292862950