Abstraktne

Cistanche tubulosa(Schenk) Wighti, Orobanchaceae perekonnast pärit väärtuslikku toidu-ravimite homoloogset ürti, kasvatatakse laialdaselt Hiina lõunaosas Xinjiangis. Selle peamised bioaktiivsed fenüületanoidglükosiidid,ehhinakosiidjaakteosiid (verbaskosiid)annab mitmeid farmakoloogilisi toimeid, sealhulgas antioksüdatsiooni, põletikuvastast ja immuunsüsteemi regulatsiooni. Standardeerimata traditsioonilised töötlemisprotseduurid põhjustavad sageli nende põhiliste toimeainete märkimisväärset kadu, piirates nende kasutamist meditsiinis ja funktsionaalses toidus.Cistanche tubulosakeedutükid. Selle uuringu eesmärk oli optimeerida värskete jaoks kaasaegseid töötlemisparameetreidCistanche tubulosaviilud, et maksimeerida akteosiidi ja ehhinakosiidi taastumist ning selgitada täiendavalt antioksüdatiivset stressi ja põletikuvastast bioaktiivsust ning optimaalselt töödeldud keedutükkide molekulaarset mehhanismi raku tasandil.

Viilu paksuse, aurutamise kestuse ja ahjus kuivatamise temperatuuri sobivate vahemike skriinimiseks viidi läbi ühe teguriga katsed. Mitmefaktoriliste interaktsioonimudelite loomiseks võeti kasutusele kolmefaktoriline kolmetasemeline Box-Behnken reageerimispinna metoodika, kasutades akteosiidide ja ehhinakosiidide sisaldust kahekordsete hindamisnäitajatena. Seejärel ehitati lipiidide peroksüdatsiooni ja ägedate põletikuliste kahjustuste simuleerimiseks lipopolüsahhariidiga (LPS) stimuleeritud RAW264.7 hiire makrofaagirakkude mudel. Antioksüdatiivse stressi potentsiaali hindamiseks ja signaaliülekanderadade uurimiseks viidi läbi rida biokeemilisi analüüse, sealhulgas MTT, ROS fluorestsentstuvastus, ELISA ja Western blot.

Katsetulemuste kohaselt määrati optimaalseteks töötlemisparameetriteks viilu paksus 0,6 cm, aurutamine 6 minutit ja kuivatustemperatuur 57 kraadi. Selles praktilises töötlemistingimustes saavutas akteosiidi ja ehhinakosiidi mõõdetud sisaldus vastavalt 7,25% ja 31,62%, mis näitab head kooskõla teoreetiliste ennustusväärtustega. Rakupõhised testid näitasid, et see on optimaalselt töödeldudCistanche tubulosaKeeditükkide ekstraktid vähendasid oluliselt lämmastikoksiidi (NO) ja malondialdehüüdi (MDA) kontsentratsiooni LPS-iga vaidlustatud RAW264.7 makrofaagides. Samal ajal suurendas see märkimisväärselt superoksiiddismutaasi (SOD), katalaasi (CAT), laktaatdehüdrogenaasi (LDH) rakusisese antioksüdantse ensüümi aktiivsust koos suurenenud glutatiooni (GSH) sisalduse suurenemisega. Põletikueelsete vahendajate, sealhulgas TNF-, IL-1 ja IL-6 sekretsioonitasemeid pärsiti samuti annusest sõltuval viisil. Western blot tuvastamine kinnitas sedaCistanche tubulosaekstraktid piirasid võtmevalkude liigset fosforüülimist p38/AKT/JNK/NF-κB signaaliülekandekaskaadides.

Kokkuvõttes parandab see optimeeritud kaasaegne töötlemisprotokoll tõhusalt iseloomulike fenüületanoidglükosiidide (akteosiid ja ehhinakosiidi) saagist.Cistanche tubulosakeedutükid. Töödeldud taimne materjal avaldab LPS-i indutseeritud makrofaagide kahjustuse mudelis silmapaistvat antioksüdatiivset stressi ja põletikuvastast toimet, mille farmakoloogiline mehhanism realiseerub osaliselt p38/AKT/JNK/NF-κB põletikulise signaaliülekande telje üleaktiveerimise inhibeerimise kaudu. See töö pakub usaldusväärseid tehnilisi parameetreid standardiseeritud tööstuslikuks tootmiseks ja pakub eksperimentaalset tuge antioksüdantse funktsionaalse toidu väljatöötamiseks, mis on saadudCistanche tubulosa.

Märksõnad: Cistanche tubulosa; keedutükkide töötlemise tehnoloogia; akteosiid; ehhinakosiid; antioksüdatiivne stress; RAW264.7 makrofaag; p38/AKT/JNK/NF-κB signaalirada

1. Sissejuhatus

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight kuulub Orobanchaceae perekonda ja selle lihakas ketendav vars on ametlik meditsiiniline osa. See kõrbe ravimtaim on suures osas istutatud kuivas Lõuna-Xinjiangis Hiinas. Traditsioonilises Hiina ravimtaimede praktikasCistanche tubulosatoimib klassikalise toonilise ravimtaimena, millel on dokumenteeritud terapeutilised funktsioonid: toniseerib neeru-yangi, täiendab verd ja lõõgastab soolestiku liikumist. Kliiniliselt kasutatakse seda nimme- ja põlveliigese valulikkuse-nõrkuse, neerupuudulikkusest põhjustatud viljatuse ja soolestiku kuivusest põhjustatud kõhukinnisuse leevendamiseks.

Fenüületanoidglükosiidid tähistavad kõige kriitilisemaid bioaktiivseid markereidCistanche tubulosa. Hiina farmakopöa näeb ette, et ehhinakosiidi ja akteosiidi kogusisaldus ei tohi kvalifitseeritud ravimmaterjalide puhul olla väiksem kui 1,50%. Sellegipoolest on praegune tavatootmineCistanche tubulosaKeetmistükkide valmistamisel järgitakse enamasti iidseid käsitsi töövooge: värske toore ürdi leotamine, põhjalik niisutamine, viilutamine ja loomulik kuivatamine või veini aurutamine. Nendel tavapärastel lähenemisviisidel puuduvad täpsed kvantitatiivsed tehnilised kirjeldused. Fenüületanoidglükosiidide termiline ebastabiilsus põhjustab sageli toimeainete tugevat lagunemist töötlemise ajal, mis vähendab lõpptoote kvaliteeti ja piirab suuremahulist kvaliteetset tootmist. Praegu ühendab ainult piiratud teadustöö samaaegselt töötlemistehnoloogia optimeerimist bioloogilise aktiivsuse valideerimisega; enamik uuringuid tuvastab ainult keemiliste koostisosade sisu ilma raku funktsionaalsuse kontrollimiseta, luues lünki tööstuslikuks ümberkujundamiseksGoogle for....

Oksüdatiivne stress toimib mitme kroonilise metaboolse ja põletikulise haiguse peamise patoloogilise vallandajana. Liigne reaktiivsete hapnikuliikide (ROS) akumuleerumine häirib redoks-homöostaasi, provotseerides veelgi makrofaagide üleaktiveerumist ja massilist põletikueelsete tsütokiinide vabanemist, moodustades nõiaringi oksüdatsiooni ja põletiku vahel. Olemasolevad farmakoloogilised uuringud on seda tõestanudCistanche-päritolu fenüületanoidglükosiididel on antioksüdantsed ja põletikuvastased omadused. Varasemad loomkatsed näitasid sedaCistanche tubulosakogu glükosiidid leevendasid maksakahjustusi sepsise näriliste mudelites, aktiveerides Nrf2 / HO-1 antioksüdantide signaaliülekande. Lignaan-glükosiidi komponendid, mis on eraldatudCistanche tubulosavõib leevendada LPS-i poolt põhjustatud põletikulisi reaktsioone, moduleerides PI3K / AKT rada RAW264.7 makrofaagides. Siiski ei ole süstemaatiliselt hinnatud, kas äsja optimeeritud töötlemistingimustes valmistatud keedutükid säilitavad tugeva antioksüdatiivse stressivastase bioaktiivsuse. Betooni molekulaarne reguleerimismehhanism nõuab endiselt sügavamat uurimist.

LPS-stimuleeritud RAW264.7 makrofaag on hästi aktsepteeritud in vitro põletiku-oksüdatiivse kahjustuse mudel, mida kasutatakse laialdaselt looduslike toodete antioksüdantide ja põletikuvastaste toimete hindamiseks. Selles uuringus teostame esmalt ühefaktorilise sõelumise, millele järgneb Box-Behnkeni reaktsioonipinna optimeerimine, et saada standardiseeritud viilutamise-aurutamise-kuivatamise tehnilised parameetrid, mis on suunatud kõrgele akteosiidi ja ehhinakosiidi saagisele. Pärast optimeeritud keedutükkide saamist valmistame ravimtaimede ekstraktid ja võtame kasutusele LPS-indutseeritud RAW264.7 rakukahjustuse mudeli. Antioksüdatiivse stressi efektiivsuse ja signaaliülekande mehhanismi selgitamiseks kasutatakse mitmeid eksperimentaalseid platvorme, sealhulgas oksüdatiivse stressi ja biokeemilise markerite mõõtmine, tsütokiinide ELISA kvantifitseerimine ja Western-blot raja analüüs. See uurimus pakub praktilisi protsessiparameetreid kvaliteetseks piloottootmiseksCistanche tubulosastabiilse antioksüdatiivse stressivastase toimega keedutükid ning loob eksperimentaalse aluse Xinjiangist pärit funktsionaalse toidu ja toidulisandite edasiseks arendamiseks.Cistanche tubulosaressursse.

2. Materjalid ja meetodid

2.1 Toorained, reaktiivid ja instrumendid

VärskeCistanche tubulosalihavad varred korjati sügisel Hiinast Xinjiangi Uiguuri autonoomsest piirkonnast Hotanist. RAW264.7 hiire monotsüütide-makrofaagide leukeemia rakuliin osteti ettevõttelt Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Hiina). Kromatograafilise puhtusega atsetonitriili ja metanooli tarnis Merck (Saksamaa). Võrdlusstandardained ehhinakosiid ja akteosiid (puhtus 98 %) saadi Pekingi Põhja-Weiye metroloogiatehnoloogia uurimisinstituudist. Dimetüülsulfoksiid (DMSO) osteti firmalt Sigma-VETEC (USA). DMEM kõrge glükoosisisaldusega sööde, BCA üldvalgu analüüsi komplekt olid ettevõtte Thermo Fisher Scientific (USA) tooted. Veise loote seerum (FBS) osteti ettevõttest BI (Iisrael). Penitsilliini-streptomütsiini topeltantikeha lahus pärines firmalt HyClone (USA). NO, MDA, SOD, CAT, GSH kaubanduslikud testikomplektid hangiti ettevõttest Beyotime Biotechnology (Shanghai, Hiina). LDH tuvastamise komplekt ja lipopolüsahhariid (LPS,E. coli055:B5) saadi Solarbiost (Peking, Hiina).

Peamiste laboriinstrumentide hulka kuulusid Shimadzu kõrgjõudlusega vedelikkromatograafia (HPLC) süsteem, LabTechi pöördaurusti, pöördtüüpi kiire hiina ürtide pulverisaator, termostaatiline kiirkuivatusahi, aurupoti seadmed, BioTek SYNERGY-H1 mitmerežiimiline mikroplaadilugeja, FA1204N elektrooniline refrižereeritud mikroplaadilugeja SYNERGY-H1, FA1204t24R analyt24. tsentrifuug, BSC-1300IIA2 bioohutuskapp ja BDS200-PH pöördoptiline mikroskoop.

2.2 Ühefaktorilise töötlemise katsed

VärskeCistanche tubulosalihavad varred lõigati erineva paksusega viiludeks (0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm, 1,2 cm). Viile aurutati erineva kestusega (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Seejärel kuivatati materjale erinevate temperatuurigradientide all (keskkond 25 kraadi, 40 kraadi, 50 kraadi, 60 kraadi, 70 kraadi, 80 kraadi). Täielikult kuivatatud keedutükkide proovid pulbristati ja sõeluti läbi 40-mešši sõela järgnevaks HPLC komponentide kvantifitseerimiseks.

2.3 Akteosiidi ja ehhinakosiidi sisalduse määramine

Proovilahuse valmistamine: 1,0 g peenestatud keedupulbrit kaalutakse täpselt korgiga koonilisse kolbi. Lisage täpselt 100 ml 50% metanoolilahust. Tehke 30-minutiline leotamine, millele järgneb 40-minutiline ultraheliga ekstraheerimine. Pärast jahutamist lisage lahusti massikadu 50% metanooliga, segage ühtlaseks ja laske staatilisel ladestuda. Supernatant filtriti läbi 0,22 μm mikropoorse membraani HPLC süstimiseks.

Etalon-standardlahuse valmistamine: kaalutakse täpselt sobiv kogus akteosiidi ja ehhinakosiidi võrdlusaineid, lahustatakse mõõtekolbides 50 % metanooliga, valmistatakse gradiendiga standardlahused, filtreeritakse 0,22 μm filtrimembraaniga.

Kromatograafiline seadistus: COSMOSIL C18 analüütiline kolonn; liikuva faasi süsteem: liikuv faas A: 0,1 % fosforhappe vesilahus; liikuv faas B: atsetonitriil. Tuvastuslainepikkuseks määrati 330 nm; kolonni temperatuur 35 kraadi ; voolukiirus 1 ml/min. Akteosiidi ja ehhinakosiidi sisalduse kvantitatiivseks arvutamiseks kasutati välisstandardi meetodit. Üldine hindamisskoor=(ehhinakosiidi sisaldus × 50 %) + (akteosiidi sisaldus × 50 %). Põhjalikud hinded toimisid töötlemistingimuste toimivuse koondhindamise indikaatorina.

2.4 Box-Behnken Response-Surface eksperimentaalne disain

Ühefaktoriliste katsetulemuste põhjal kasutati Box-Behnkeni kolmefaktorilise kolmetasandilise katsekorralduse rakendamiseks tarkvara Design-Expert 13.0. Sõltumatuteks muutujateks valiti viilu paksus (X₁, cm), aurutamis-töötlusaeg (X2, min), kuivatustemperatuur (X3, kraad). Akteosiidi sisaldus (Y1, %) ja ehhinakosiidi sisaldus (Y2, %) olid vastuse väärtused. Viidi läbi seitseteist katserühma. Iga teguri nulltase valiti ühe teguri testides saadud optimaalse parameetri järgi. Pärast reaktsioonipinna katsete lõpetamist viidi lõpule mudeli dispersioonanalüüs, 3D-vastuse pinna joonistamine ja seisundi ennustamine. Praktilised kontrollikatsed viidi läbi pärast teoreetiliste prognoositud parameetrite kohandamist tegelike tootmisväärtustega.

2.5 Rakukultuur ja proovide ettevalmistamine

Keedutükkide tooraine valmistati optimeeritud töötlemistingimustes. Taimne pulber ekstraheeriti ülalmainitud proovide ettevalmistamise protokolli järgi, kontsentreeriti rotaatoraurustiga ja kuivatati vaakumis, et saada tahke ekstrakti pulber. Põhilahus valmistati ekstraktipulbri lahustamisega DMSO-s, mida lahjendati rakuliste katsete jaoks täiendavalt täieliku DMEM söötmega (mis sisaldas 10% FBS-i ja 1% penitsilliini-streptomütsiini); DMSO lõplik töökontsentratsioon kontrolliti alla 0,1% (maht/maht). RAW264.7 makrofaage kultiveeriti DMEM täissöötmes temperatuuril 37 kraadi, 5% CO₂ niisutatud inkubaatori keskkonnas.

2.6 MTT tsütotoksilisuse test

RAW264.7 rakud külvati 96-süvendilistele mikroplaatidele rakutihedusega 8 × 10⁴ rakku/ml. Katserühmad hõlmasid lahusti kontrollrühma (0,1% DMSO söödet), LPS-i mudelirühma (LPS-i lõppkontsentratsioon 1 ug/ml) ja mitutCistanche tubulosaekstrakti kontsentratsioonirühmad (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/ml). Pärast 2-tunnist eelinkubeerimist taimse prooviga lisati LPS-i (lõppkontsentratsioon 1 ug/ml) igale rühmale, välja arvatud lahusti kontrollrühm. Inkubeerimine jätkus 24 tundi. Seejärel lisati MTT reaktiiv (5 mg/ml) ja inkubeeriti 4 tundi. Supernatant visake ära, lisage 150 μL DMSO-d süvendi kohta, loksutage 37 kraadi juures 15 minutit. Neeldumisväärtus 490 nm lainepikkusel loeti mikroplaadilugejaga ja arvutati rakkude ellujäämise määr. Funktsionaalsete järeltestide jaoks määrati ohutu töökontsentratsiooni vahemik.

2.7 Intratsellulaarne ROS-i mõõtmine

RAW264.7 makrofaagid inokuleeriti kuue süvendiga plaatidele tihedusega 4 × 105 rakku süvendi kohta. Pärast rakkude kleepumist viidi läbi rühmitusravi: lahusti kontrollrühm, LPS-mudeli rühm ja CT ekstraktiga ravirühmad (12,5, 25, 50, 100 ug/ml). Pärast 2-tunnist eeltöötlemist prooviga lisati LPS 1 ug/ml, välja arvatud lahusti kontrollrühm, inkubeerige 24 tundi. Intratsellulaarne ROS-i tase tuvastati fluorestsentssondi laadimismeetodi abil vastavalt komplekti juhistele. Fluorestsentsi intensiivsust mõõdeti fluorestsents-mikroplaadilugejaga (ergastus 488 nm, emissioon 525 nm).

2.8 NO, MDA, SOD, CAT, LDH ja GSH tuvastamine

Pärast vastavat rakutöötlust koguti rakukultuuri supernatant NO mõõtmiseks, võttes kasutusele Griessi reaktsiooni. Kinnitatud rakke pesti eeljahutatud PBS-ga, lüüsiti jääl, rakulüsaadi supernatant koguti pärast tsentrifuugimist (10 000 p/min, 4 kraadi, 5 min). BCA komplekt määras iga proovi valgu üldkontsentratsiooni. MDA, GSH ja ensümaatilise aktiivsuse indikaatorite SOD, CAT, LDH sisu analüüsiti rangelt komplekti kasutusjuhendite järgi.

2.9 Põletikueelsete tsütokiinide ELISA määramine

RAW264.7 rakud said proovi eeltöötlust ja LPS-i stimuleerimist kokku 16 tundi. Rakukultuuri supernatant koguti ja tsentrifuugiti. TNF-, IL-1, IL-6 kontsentratsioonid supernatandis kvantifitseeriti kaubanduslike ELISA komplektidega.

2.10 Western-blot analüüs

Pärast 45-minutilist LPS-i ja proovi koosinkubeerimist lüüsiti RAW264.7 rakud RIPA lüüsipuhvriga, millele oli lisatud proteaasi-fosfataasi inhibiitori kokteili. Rakulüsaati tsentrifuugiti kiirusel 10 000 p/min alla 4 kraadi 5 minutit. BCA komplekt kvantifitseeris valgu üldkontsentratsiooni. Proovivalgud (50 ug raja kohta) denatureeriti 100-kraadises metallivannis 5 minutit. SDS-PAGE geelelektroforees eraldas sihtvalgud, mis seejärel kanti üle PVDF membraanidele. Membraanid blokeeriti 1 tund 5% kooritud piima TBST lahusega. Primaarseid antikehi, mis olid suunatud p38, p-p38, AKT, p-AKT, JNK, p-JNK, NF-κB p65, p-NF-κB p65 ja GAPDH vastu, inkubeeriti üleöö 4 kraadi juures. Pärast TBST pesemist inkubeeriti vastavaid sekundaarseid antikehi toatemperatuuril 1 tund. Pärast korduvat pesemist rakendati valguriba pildistamiseks ECL-i ülitundlikku kemoluminestsentsreaktiivi. Suhtelise fosforüülimise-valgu ekspressioonitaseme hindamiseks viidi läbi riba hallskaala kvantitatiivne analüüs.

2.11 Statistiline analüüs

Statistiliseks arvutamiseks ja graafikute koostamiseks kasutati GraphPad Prism 8.0.2 tarkvara. Eksperimentaalsete kvantitatiivsete andmete tulemused väljendati kui keskmine ± standardhälve (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Rühmadevaheliseks võrdlemiseks kasutati ühesuunalist ANOVA-d, millele järgnesid post-hoc mitmevõrdlustestid. \\(P<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Katsetulemused

3.1 Ühe teguriga katsete tulemused

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 cm) takistas aine sisemist vabanemist, vähendades lõplikku tuvastatava komponendi sisaldust. Fikseeritud aurutamisaja (10 min) ja kuivatustemperatuuri (60 kraadi) korral saavutas 0,4 cm viilu paksus kõrgeima igakülgse hindamisskoori.

Aurutamistöötlemise kestuse tulemused: kui viilu paksuseks fikseeriti 0,4 cm ja kuivatustemperatuuri hoiti 60 kraadi juures, ei suutnud ebapiisav aurutamisaeg taimeraku struktuuri piisavalt hävitada, mistõttu aktiivsed ühendid olid raskesti lahustuvad. Kui aurutamisaeg ületas 6 minutit, kahjustas üleaurutamine taimseid kudesid ning põhjustas ehhinakosiidi ja akteosiidi lagunemise. Seetõttu määrati esialgselt eelistatavaks aurutamisprotsessi kestuseks 6 minutit.

Ahjus kuivatamise ja temperatuuri gradiendi katsete jaoks: viilu paksus 0, 4 cm ja aurutamisaeg 6 minutit fikseeriti. Komponentide sisaldus tõusis kuivatustemperatuuri tõustes teatud vahemikus. Kui kuivatustemperatuur ületas 60 kraadi, põhjustas kõrge temperatuuriga termiline lagunemine sihtaine sisalduse märgatava vähenemise. Seetõttu valiti 60 kraadi esialgseks optimaalseks kuivatustemperatuuri tingimuseks järgnevaks reaktsioonipinna optimeerimiseks.

3.2 Box-Behnken vastuse pinna optimeerimine ja kinnitamine

Seitseteist Box-Behnkeni katsete rühma viidi lõpule vastavalt disainimaatriksile. Dispersioonanalüüsi tulemused näitasid, et nii akteosiidi kui ka ehhinakosiidi sisalduse regressioonimudelid saavutasid statistilise olulisuse (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >viilu paksus.

Mudeli matemaatilise arvutuse abil olid teoreetilised optimaalsed töötlemisparameetrid: viilu paksus 0,600 cm, aurutamis-töötlusaeg 5,685 min, kuivamistemperatuur 57,009 kraadi. Arvestades tegelikku tööstuslikku teostatavust, kohandati parameetrid viilu paksusele 0,6 cm, aurutamisajale 6 min, kuivatustemperatuurile 57 kraadi. Viidi läbi kolm paralleelset valideerimiskatset. Sellel praktilisel tingimusel oli mõõdetud akteosiidisisaldus 7,25%, ehhinakosiidi sisaldus 31,62%. Mõõdetud väärtuste ja teoreetilise prognoosi vaheline kõrvalekalle jäi alla 5%, mis tõestab, et see reageerimispinna mudel oli usaldusväärne ja kasutatav reaalse keetmise tüki valmistamise juhtimiseks.

3.3 Optimeeritud-töödeldud tsütotoksilisuse sõeluuringCistanche tubulosaVäljavõte RAW264.7 lahtrites

MTT tsütotoksilisuse tulemused näitasid, et ekstrakti kontsentratsioon vahemikus 0–100 ug/ml ei avaldanud RAW264.7 makrofaagidele ilmset toksilist toimet ja näitas isegi kerget rakkude proliferatsiooni soodustavat tendentsi. Kui ravikontsentratsioon tõusis 200 ug/ml ja 400 ug/mL-ni, vähenes rakkude ellujäämise määr oluliselt võrreldes lahusti kontrollrühmaga, näidates kontsentratsioonist sõltuvat tsütotoksilisust. Seetõttu valiti järgnevate oksüdatiivse stressi ja põletikuga seotud rakuanalüüside jaoks ohututeks töökontsentratsioonideks kontsentratsioonigradiendid 12,5 ug/ml, 25 ug/ml, 50 ug/mL, 100 ug/mL.

3.4 Cistanche tubulosaEkstraheerige LPS-stimuleeritud makrofaagides vähendatud intratsellulaarset ROS-i taset

Võrreldes lahusti kontrollrühmaga suurenes LPS-mudeli rühma intratsellulaarne ROS-i fluorestsentsi intensiivsus äärmiselt märkimisväärselt (\\(P)<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosaekstrakt, rakusisene ROS-i kogunemine vähenes annusest sõltuval viisil. Igas ravimirühmas oli ROS-i statistiliselt oluline vähenemine võrreldes LPS-i mudelirühmaga (\\(P)<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Mõju NO ja MDA sisule

NO toimib klassikalise põletikulise vahendajana, mida vabastavad aktiveeritud makrofaagid. MDA on kuldstandardi biomarker, mis peegeldab lipiidide peroksüdatsiooni oksüdatiivset kahjustust. Võrreldes lahusti kontrollrühmaga suurendas LPS-i stimuleerimine märkimisväärselt NO ja MDA sisaldust RAW264.7 rakkudes (\\(P)<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosaekstraktiga töötlemine võib NO kontsentratsiooni oluliselt alandada. MDA indikaatori puhul: 12,5 ug/ml rühm ei toonud statistiliselt olulist paranemist; 25–100 ug/ml kontsentratsiooniga rühmad vähendasid märgatavalt MDA taset (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Mõju antioksüdantidega seotud biokeemilistele näitajatele SOD, CAT, LDH, GSH

Pärast LPS-i nakatamist langes rakusisene SOD, CAT, LDH ensümaatiline aktiivsus ja GSH sisaldus võrreldes lahusti kontrollrühmaga järsult (\\(P)<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaKeeditükkide ekstraktid võivad taastada raku endogeense antioksüdantide kaitsevõime LPS-i põhjustatud oksüdatiivsete solvangute vastu.

3.7 Inhibeeriv toime põletikueelsele tsütokiinile TNF-, IL-1, IL-6 vabanemisele

ELISA tuvastamise tulemused näitasid, et LPS-i stimuleerimine soodustas tugevalt TNF-, IL-1, IL-6 sekretsiooni RAW264.7 makrofaagidest (\\(P)<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosaekstraktiga ravitava kontsentratsiooni tõttu vähenes nende kolme peamise põletikueelse tsütokiini vabanemise kogus järk-järgult, mis näitas selget annuse-vastuse korrelatsiooni. See kinnitas, et taimeekstrakt avaldas tugevat põletikuvastast funktsiooni, piirates põletikueelsete tsütokiinide sekretsiooni aktiveeritud makrofaagidest.

3.8 Määrus p38/AKT/JNK/NF-κB signaaliraja fosforüülimise kohta

Western-blot katseandmed näitasid, et p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK ja p-NF-κB/NF-κB suhted olid LPS-mudeli rühmas oluliselt kõrgemad võrreldes lahusti kontrollrühmaga (\\(P)<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosaekstrakti sekkumine vähendas märkimisväärselt p-p38/p38 ja p-JNK/JNK suhet (\\(P)<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosakeedutüki ekstrakt leevendas oksüdatiivseid-põletikulisi vigastusi, pärssides p38/AKT/JNK/NF-κB signaalivõrgu hüperfosforüülimise aktivatsiooni.

4. Arutelu

Hiina farmakopöas registreeritud traditsioonilised töötlemisnõudedCistanche tubulosahõlmavad peamiselt lisandite eemaldamist, pesemist, niisutamist, viilutamist ja kuivatamist, ilma et oleks täpsustatud viilu paksuse, aurutamise kestuse ja kuivatustemperatuuri täpseid arvparameetreid. Mittestandardne käsitsi töötlemine toob kaasa kaubanduslike keetmistükkide kvaliteedi kõikumise. Fenüületanoidglükosiidid (ehhinakosiid ja akteosiid) on termiliselt labiilsed bioaktiivsed ühendid. Vale kuumutamisaeg või -temperatuur põhjustab keemilise lagunemise ja vähendab raviväärtust. Meie ühe teguriga katsed näitasid, et nii ebapiisav ja liigne aurutamine kui ka liiga kõrge kuivatustemperatuur põhjustavad sihtglükosiidikomponentide kadu. Edasine Box-Behnkeni mitmefaktoriline optimeerimine andis praktilised tootmisparameetrid: viilu paksus 0,6 cm, aurutamine 6 minutit, kuivatamine 57 kraadi. Selle tingimuse korral saavutas akteosiidide ja ehhinakosiidide sisaldus 7,25 % ja 31,62 %, ületades oluliselt farmakopöa minimaalse kvaliteediläve. See optimeeritud protokoll pakub teostatavaid kvantitatiivseid tehnilisi viiteid Xinjiangi päritolu standardiseeritud tööstuslikuks töötlemiseksCistanche tubulosa.

Oksüdatiivne stress ja põletik on omavahel tihedalt seotud patoloogilised protsessid. Liigne ROS kutsub esile lipiidide peroksüdatsiooni ja tekitab MDA, mis aktiveerib veelgi kaasasündinud immuunsüsteemi makrofaage. Aktiveeritud makrofaagid eritavad ohtralt NO ja mitmeid põletikueelseid tsütokiine, mis vastupidi võimendavad rakusisest ROS-i tootmist, moodustades isevõimendava oksüdatiivse-põletikulise nõiaringi. Looduslikud taimsed antioksüdandid võivad selle patoloogilise ahela katkestada, tõstes endogeenset antioksüdantset ensüümisüsteemi ja piirates põletikuliste signaalide ülekannet. Selles in vitro uuringus optimaalselt töödeldudCistanche tubulosakeedutükkide ekstraktid alandasid ROS-i, NO- ja MDA-taset, suurendades samal ajal SOD-, CAT-, LDH-aktiivsust ja GSH sisaldust LPS-stimuleeritud RAW264.7 makrofaagides. Samal ajal pärssis see TNF-, IL-1, IL-6 põletikueelsete tsütokiinide sekretsiooni, näidates integreeritud antioksüdatiivse stressi ja põletikuvastast võimet.

Mitogeen-aktiveeritud proteiinkinaasi perekonna molekulid p38, JNK koos AKT ja NF-κB-ga moodustavad keskse signaaliülekande sõlmpunkti, mis vahendab makrofaagide põletikulisi-oksüdatiivseid reaktsioone. LPS-i stimuleerimisel käivitab ülesvoolu signaal p38, JNK ja AKT fosforüülimise aktiveerimise, mis soodustab järjestikku NF-κB p65 subühiku fosforüülimist ja tuuma translokatsiooni. Aktiveeritud NF-κB toimib transkriptsioonifaktorina ja käivitab suurte põletikueelsete tsütokiinide ja oksüdatiivse stressiga seotud geenide transkriptsiooni. Meie Western blot'i tulemused näitasid sedaCistanche tubulosaekstrakt võib pärssida p38, JNK, AKT ja NF-κB p65 fosforüülimist. Seetõttu järeldame, et selle antioksüdatiivne-stress ja põletikuvastane bioaktiivsus saavutatakse vähemalt osaliselt p38/AKT/JNK/NF-κB signaalitelje üleaktiveerimise blokeerimise kaudu.

Praegustes uuringutes on mitmeid piiranguid. Kõik funktsionaalsed kontrollid piirduvad rakukultuuri in vitro tasemel. Optimeeritud keedutükkide in vivo farmakodünaamilise toimivuse kontrollimiseks on vaja täiendavaid loommudelite in vivo katseid. Lisaks kasutati selles uuringus keedutükkide segaekstrakti, nii et me ei saa eristada ehhinakosiidi, akteosiidi ja muude väiksemate sekundaarsete metaboliitide individuaalset panust. Järeluuringud võivad eraldada monomeerseid ühendeid, et võrrelda vastavat antioksüdatiivset stressivastast tugevust ja viia läbi kokkusobivuse mõju uurimine. Sellegipoolest pakub meie praegune töö endiselt praktilisi töötlemistehnoloogia parameetreid ja esialgseid mehaanilisi tõendeid arendamiseksCistanche tubulosa- seotud tervishoiutooted.

5. Järeldus

Kokkuvõtteks võib öelda, et Box-Behnkeni reageerimispinna metoodikaga optimeeritud moderniseeritud töötlemise töövoog (lõigu paksus 0,6 cm, aurutamine 6 minutit, kuivatustemperatuur 57 kraadi) võib oluliselt suurendada akteosiidi ja ehhinakosiidi sisaldustCistanche tubulosakeedutükid. Nendest optimaalselt töödeldud taimelõikudest valmistatud ekstraktidel on silmapaistev antioksüdatiivne stressivastane ja põletikuvastane toime LPS-i põhjustatud RAW264.7 makrofaagide kahjustuste vastu. Selle aluseks olev mehhanism on korrelatsioonis intratsellulaarse antioksüdantide kaitsesüsteemi taastamisega ja p38/AKT/JNK/NF-κB põletikulise signaaliraja liigse aktivatsiooni pärssimisega. See uuring annab kindla eksperimentaalse aluse standarditud tööstuslikuks tootmiseks ja funktsionaalseks toiduks kasutamiseksCistanche tubulosaressursse.

Viited

Lin J, Yu H, Zhao Y jt. Ehhinakosiidi ekstraheerimineCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight ja selle kaitsva toime uurimine maksakahjustusele sepsisrottidel. Food Sci Technol, 2023, 43:e010523.

Guo J, Tang S, Miao Y jt. Lignaanglükosiidide põletikuvastane toime alatesCistanche tubulosatuleneb LPS/IFN-indutseeritud RAW264.7 makrofaagirakkudest PI3K/AKT raja kaudu. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2021, 22(10):1380-1391.

Rani V, Deep G, Singh RK jt. Oksüdatiivne stress ja metaboolsed häired: patogenees ja ravistrateegiad. Bioteadused, 2016, 148:183–193.

Park JH, Kim JH, Jang S I. Dise-necionüül-cis-khellaktooni põletikuvastane toime LPS-stimuleeritud RAW264.7 rakkudes ja selle inhibeeriv toime lahustuvale epoksiidi hüdrolaasile. Heliyon, 2023, 9 (10): e21032.

Chung YC, Song S J. Isobavachin leevendab lipopolüsahhariididest põhjustatud põletikulisi reaktsioone makrofaagides, pärssides MAPK ja NF-κB signaaliülekande radu. Journal of Ethnopharmacology, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. PI3K/AKT signaalirada põletiku, rakusurma ja gliiaarmi moodustumise korral pärast seljaaju traumaatilist vigastust. Cell Proliferation, 2022, 55(9):e13275.